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INTRODUCCIÓN
En la actualidad, la obtención de productos naturales constituye una fuente alternativa de sustancias bioactivas para la industria alimentaria y farmacológica, debido a su eficiencia y bajo costo. Los frutos de Morus alba L., presentan metabolitos secundarios y nutrientes fundamentales que estimulan su uso en dietas balanceadas (Gündeşli et al., 2019). Entre los metabolitos secundarios, los compuestos fenólicos constituyen el grupo más ampliamente utilizado en la medicina natural (Sánchez-Salcedo et al., 2015). Se destacan las antocianinas, que se encuentran acumuladas en las vacuolas de la célula y son responsables del color en frutas y vegetales (Rodrigues et al., 2019). Se ha demostrado que el elevado contenido y diversidad de compuestos fenólicos está altamente correlacionado con la capacidad antioxidante (Kobus-Cisowska et al., 2020).
La presencia de estos compuestos atribuye a los frutos propiedades antidiabéticas (Nanasombat et al., 2019), efecto hipolipidémico (Sirikanchanarod et al., 2016) para prevenir la obesidad, antitumoral, de protección contra el daño cerebral y efectos hepaprotectores (Li et al., 2016), entre otros de gran importancia para la salud y nutrición animal y humana.
En Cuba, se refieren diversas investigaciones acerca del uso de M. alba. En la ganadería, son promisorios los resultados agronómicos de esta especie, sus beneficios en la producción de leche, el control parasitario, la reducción de la producción de metano, entre otros aspectos relacionados con la nutrición de los rumiantes. En la agricultura, los estudios en la ganadería ovina, la porcicultura, cunicultura, avicultura, entre otros, demuestran el alto valor nutricional de M. alba, como una opción en la alimentación de estas especies (Peña-Borrego et al., 2019). Además, se han informado estudios sobre evaluaciones de metabolitos secundarios en diferentes órganos de esta planta (hojas, tallos y raíces) (Sande et al., 2016). Sin embargo, las investigaciones se han dirigido a los órganos de mayor biomasa y productividad, y no hacia los frutos.
El objetivo de este estudio fue determinar el contenido de antocianinas y de vitamina C, así como la actividad antioxidante de los extractos etanólicos de los frutos de siete variedades de M. alba.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización. Las muestras de los frutos se recolectaron del banco de germoplasma de la Estación Experimental de Pastos y Forrajes Indio Hatuey (EEPFIH), situada a los 22º 48’ y 7’’ de latitud norte y 79º 32’ y 2’’ de longitud oeste, a 19 msnm, en el municipio de Perico, provincia Matanzas, Cuba.
El suelo de esta región corresponde al tipo Ferralítico Rojo lixiviado (Hernández-Jiménez et al., 2015). Su topografía es llana, con pendiente de 0,5 a 1,0 %, y tiene una profundidad promedio hasta la roca caliza de 1,50 m.
Las siete variedades de morera (Yu-12, Yu-62, Universidad, Acorazonada, Nueva, Cubana y Universidad mejorada) se sembraron en diciembre de 2012, con densidad de siembra de 0,60 x 1,30 m. Se mantuvo el riego antes y después de la siembra. Se monitoreó cada mes la aparición de plagas y enfermedades. La fertilización se realizó tres veces al año, con fertilizantes basados en N, P y K, a razón de 300, 120 y 300 kg/ha/año, respectivamente. Durante la investigación no se realizó poda a las plantas.
Tratamientos y diseño experimental. Se aplicó un diseño totalmente aleatorizado y se evaluaron siete variedades, que constituyeron los tratamientos.
Procedimiento experimental. Para los ensayos se utilizaron frutos maduros de estas siete variedades. Se recolectaron manualmente, en marzo del 2019 (1 kg), en las primeras horas de la mañana. Se seleccionaron al azar, de plantas que no presentaban signos de enfermedades u otra afectación. Se guardaron en bolsas de polietileno y se trasladaron al laboratorio inmediatamente para su procesamiento.
Para realizar los extractos etanólicos, se realizaron tres extracciones sucesivas. Para ello se pesaron 10 g de fruto fresco de cada variedad, se maceraron con 150 mL de solvente (etanol absoluto) y se incubaron a temperatura ambiente durante 24 h, con agitación manual de forma intermitente. Las mezclas etanólicas se filtraron al vacío y se mantuvieron en reposo, en la oscuridad, por 24 h. Después de la tercera extracción, el filtrado final se concentró hasta la sequedad en un rotoevaporador (modelo IKA®HB10 Basic), a temperatura de 60 °C y velocidad de agitación de 105 rpm. Los extractos obtenidos se almacenaron a -4 °C hasta su utilización.
Cuantificación de antocianinas totales (AT). Se realizó por el método del pH diferencial, descrito por Rapisarda et al. (2000) con algunas modificaciones. Se pesaron 10 g de muestra, que se trituraron en el mortero. Se centrifugó durante 15 min. a 5 000 rpm, y temperatura de 15 °C. Se tomaron dos alícuotas de dos mililitros del sobrenadante. Una se diluyó en una disolución tampón de cloruro de potasio (0,025 mol/L pH 1,0) y la otra, en disolución tampón de ácido acético/acetato de sodio (0,4 mol/L, pH 4,5) en un balón volumétrico de 50 mL. Después de 40 min. de reacción, se determinó la absorbancia a 510 y 700 nm en un espectrofotómetro (modelo Ray Leigh UV-2601). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. El resultado se expresó como mg/100 g de cianidina-3-glucósido.
Cuantificación de vitamina C (ácido ascórbico). Se realizó por el método descrito por Ciancaglini et al. (2001), con algunas modificaciones. Los frutos se trituraron mecánicamente, se centrifugaron a 8 000 rpm durante 10 min., a temperatura de 20 °C y el sobrenadante se filtró. Se adicionó 1 mL del jugo filtrado en un Erlenmeyer de 250 mL, se adicionó 60 mL de agua destilada, 1 mL de HCl al 15 % y 1 mL de almidón al 1 %. Se valoró con una solución de yodo al 25 mM, previamente estandarizada, hasta obtener cambio de coloración persistente (naranja-azul) durante 30 segundos. Cada mililitro de yodo, 25 mM gastado en la titulación, equivale a 8,806 mg de ácido ascórbico. Cada muestra se realizó por triplicado. El resultado se expresó en milígramos de ácido ascórbico/100 mL de jugo de morera.
Capacidad antioxidante total por el método de captura del radical fosfomolibdato (CAT). El ensayo se basa en la reducción de Mo(VI)-Mo(V) por los extractos y, consecuentemente, en la formación de un complejo verde fosfato/Mo(V) a pH ácido (Umamaheswari y Chatterjee, 2008). La absorbancia de la solución se midió a 695 nm contra un blanco en el espectrofotómetro T70 UV/VIS. Los resultados se expresaron en mmol de ácido ascórbico/g de extracto. Las pruebas se realizaron por triplicado en cada experimento y se informó el resultado como la media ± SD.
Contenido de fenoles totales (FT). La concentración de compuestos fenólicos en las muestras se determinó de acuerdo con el método de Folin-Ciocalteu (Ocampo et al., 2014). Se midió la absorbancia a 760 nm en un espectrofotómetro T70 UV/VIS. Para la preparación de la curva de calibración se utilizaron soluciones de ácido gálico, con concentraciones entre 25 y 400 µg/mL. Los niveles de compuestos fenólicos se expresaron en equivalentes de ácido gálico mg/100 g del extracto. Las pruebas se realizaron por triplicado en cada experimento y se informó el resultado como la media ± SD.
Análisis estadístico. Se realizó un análisis de varianza para el procesamiento de los datos, después del cumplimiento de los supuestos de homogeneidad de varianza (Prueba de Levene) y normalidad (Shapiro Wilk). La comparación entre medias se hizo mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (p ≤ 0,05). Se realizaron correlaciones para determinar la interrelación entre las variables capacidad antioxidante total, fenoles totales, contenido de antocianinas y vitamina C. Se tuvo en cuenta el coeficiente de correlación de Pearson y dos niveles de significación de 0,01 y 0,05. Todos los análisis mencionados anteriormente se realizaron mediante el paquete estadístico SSPS ® Statistics 22.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cuantificación de antocianinas totales (CAT). El contenido de antocianinas totales (CAT), expresadas como equivalente cianidina-3- glucósido (mg/100 g de extracto), presentó diferencias significativas entre las variedades (fig. 1).
La variedad Yu-62 mostró el mayor contenido de antocianinas (96,07 mg/100 g). Le siguió Universidad mejorada y la Yu-12. Universidad fue la de menor contenido de cianidina-3- glucósido (40,74 mg/100 g).
Estos valores se encuentran en el rango informado por Lee y Hwang (2017), quienes demostraron que el contenido de antocianinas totales, expresado en mg/100 g equivalentes de cianidina-3-glucósido, aumentó de 0 a 2,0 g/100 g a medida que los frutos maduraron. Asimismo, se corresponden con los obtenidos por Jung et al. (2019), quienes indican contenido de 75,85 mg/100 g de cianidina-3-glucósido para extractos de frutos de otras variedades de M. alba, en Corea. Sin embargo, en la misma especie se informaron valores inferiores a los que se muestran en este estudio.
Aljane y Sdiri (2016) obtuvieron contenido de antocianinas para M. alba de 1,35 mg cianidina-3-glucósido/100 g en frutos de morera, cultivados en regiones áridas de Túnez. De igual forma, existen estudios que evidencian contenidos superiores de antocianinas en esta especie. Zhao et al. (2018) informaron valores elevados e incremento en el contenido total de antocianinas durante la maduración del fruto de M. alba var. cheongil hasta alcanzar 59,16 mg/g de cianidina-3-glucósido (equivalente a 5916,0 mg/100 g). Mientras, el cultivar M. alba var. Turkey no tuvo presencia. Ambos cultivares están ubicados en la misma provincia de Corea. En otros trabajos se evidencia la carencia de antocianinas (cianidina-3-glucósido) en frutos de M. alba.
Sánchez-Salcedo et al. (2015) observaron que las antocianinas totales variaron significativamente entre los clones de M. nigra, mientras que M. alba no presentó antocianinas. Krishna et al. (2020), en un estudio con 10 genotipos de frutos de M. alba de la India, observaron que el contenido de cianidina-3-glucósido varió para los genotipos de M. rubra y M. leavigata. Sin embargo, no se halló en los dos genotipos de M. alba estudiados.
La variación en el contenido de antocianinas se puede deber a la diversidad genética que existe entre las variedades. Otros factores que influyen en el contenido de los compuestos fenólicos son el grado de madurez, los métodos analíticos para su determinación y las condiciones de crecimiento, como la temperatura, la humedad y la luz (Natić et al., 2015; Sánchez-Salcedo et al., 2015).
La presencia de la antocianina (cianidina-3-glucósido) en los frutos de M. alba refuerza la importancia de las frutas de M. alba, como posible fuente de alimentos funcionales, debido a los diversos efectos biológicos y farmacológicos que presentan. Es evidente que los frutos de M. alba constituyen una fuente prometedora de pigmentos y antioxidantes naturales, con potencialidades a considerar para su futura explotación.
Contenido de vitamina C (ácido ascórbico). Las variedades estudiadas mostraron diferencias significativas en los contenidos de vitamina C (fig. 2). Los valores estuvieron entre 16,73 y 28,40 mg de ácido ascórbico/100 mL de jugo. La variedad Yu-62 fue la que presentó mayor contenido. Le siguieron Nueva, Yu-12 y Universidad. La Cubana fue la variedad con menor contenido de vitamina C.
Krishna et al. (2020) hallaron contenido de vitamina C hasta de 27,10 mg de ácido ascórbico /100 g peso fresco para los frutos de morera en la India. A su vez, se informan contenidos de vitamina C ligeramente inferiores a los de las variedades en estudio. Eyduran et al. (2015) analizaron los frutos de M. alba y M. nigra del Valle de Aras, en Turquía, y refirieron contenido de vitamina C para M. alba de 10,12 mg/100 g.
Gecer et al. (2016) lograron valores en esta especie de 12,74 mg/100 g en la región de Anatolia Oriental. Sin embargo, Gundogdu et al. (2017), en un estudio comparativo realizado entre dos variedades de M. alba, procedentes de Turquía y China, encontraron contenido superior de vitamina C hasta 31,34 mg/100 g para el cultivar de China. En trabajos similares en la región este de Anatolia, en Turquía, Gundogdu et al. (2018) refirieron que el contenido de vitamina C en cuatro genotipos de M. alba varió entre 25,51 y 30,45 mg de ácido ascórbico/100 g de peso fresco, valores que son muy superiores a los de esta investigación.
En función del contenido de vitamina C, las especies de frutas se pueden clasificar en tres grupos (bajo, moderado y alto). Los contenidos de vitamina C obtenidos en esta investigación coinciden con lo referido por Eyduran et al. (2015), quienes ubican a las moras entre las especies de frutas con un contenido moderado de vitamina C.
La importancia del ácido ascórbico (vitamina C) se atribuye a sus propiedades como antioxidante hidrosoluble, lo que favorece la actividad enzimática, pues actúa como cofactor en diferentes reacciones y participa en el secuestro de varias formas reactivas del oxígeno y en la reducción de radicales libres. Reduce así las reacciones oxidativas en cadena y prevé daños en los alimentos, además de actuar en sinergia con la vitamina E, y evitar la oxidación lipídica inducida por el radical superóxido (Oroian y Escriche, 2015).
Capacidad antioxidante total. Los valores obtenidos indican que todos los extractos tienen actividad antioxidante. Se observaron diferencias significativas entre las variedades en estudio (figura 3). La CAT mostró valores entre 175,96 y 229,48 mmol de ácido ascórbico/g de extracto. Las variedades Yu-12, Yu-62, Universidad y Nueva mostraron las actividades más elevadas, con valores superiores a la Acorazonada, Universidad mejorada y la Cubana.
Figura 3 Actividad antioxidante total de extractos etanólicos de frutos de siete variedades de M. alba.
La actividad antioxidante total que muestran los frutos se puede deber a la presencia de fitoquímicos (taninos, terpenoides, esteroides, saponinas y flavonoides), así como a sustancias antioxidantes como la vitamina C (Rodrigues et al., 2019).
En un estudio de la actividad antioxidante total de extractos de raíces de 11 variedades e híbridos de M. alba en Cuba, Sande et al. (2016) refieren que el extracto etanólico fue el que mostró mejor actividad antioxidante total en todas las variedades estudiadas. Le siguió el extracto acuoso y, por último, el hexánico. El valor máximo para los extractos etanólicos de raíces, determinado mediante el ensayo de captura de radical fosfomolibdato, fue muy superior al valor máximo de esta actividad para los extractos de frutos en estudio.
Issa y Abd-Aljabar (2013) evaluaron por varios métodos la actividad antioxidante para diferentes extractos de fruta de M. nigra (etanólicos, flavonoide, antocianina y pigmento aislado). Estos autores informaron que el extracto etanólico de las frutas dejó ver mayor capacidad antioxidante total, evaluada por el ensayo del radical fosfomolibdato, y le siguió el extracto de flavonoide. Plantearon, además, que esta mayor actividad se debe a la presencia de compuestos fenólicos con propiedades redox, que les permiten actuar como agentes reductores, donantes de hidrógeno y eliminadores de oxígeno en estado de singlete.
Diferentes estudios indican también que la capacidad de donar electrones de los compuestos bioactivos está asociada a la actividad antioxidante, lo que contribuye a reducir los intermedios oxidados de los procesos de peroxidación de lípidos, de modo que pueden actuar como antioxidantes primarios y secundarios (Lee et al., 2015). En esta investigación, los extractos de las variedades evaluadas demostraron la capacidad de donar electrones. Por lo tanto, podrían actuar como terminadores de la cadena radical, y podrían transformar especies reactivas del oxígeno y otros radicales libres en productos no reactivos más estables.
Contenido de fenoles totales. Los contenidos de FT de los extractos mostraron valores entre 291,52 y 897,17 mg de ácido gálico/100 g de extracto (fig. 4). Las cifras más altas se encontraron en la variedad Yu-62. Le continuaron Universidad, Universidad mejorada, Yu-12, Nueva, acorazonada y Cubana, con diferencias significativas entre ellas.
Figura 4 Contenido de fenoles totales en los extractos etanólicos de frutos de siete variedades de M. alba.
Los resultados de este estudio resultan similares a los referidos por otros autores. Jin et al. (2017) informaron contenidos de fenoles totales (FT) entre 67 y 770 mg de ácido gálico /100 g de peso fresco. En tanto, Farahani et al. (2019) refirieron valores entre 134,73 y 922,64 mg de ácido gálico/100 mg de peso fresco. De igual forma, se corresponden con los informados por Natić et al. (2015) para otras variedades de morera, cultivadas en el norte de Serbia. En otros trabajos se refieren contenidos de FT inferiores a los de esta investigación. Lou et al. (2012) encontraron que el contenido de FT en la fruta de morera varió de 185 a 344 mg de ácido gálico/100 mg de peso fresco. Estos autores afirmaron que, en las frutas con color rojo, los compuestos fenólicos aumentan en las etapas finales de la maduración, lo que se debe a la acumulación de flavonoles y antocianinas.
Sánchez-Salcedo et al. (2015) destacaron que las diferencias genéticas, el medio ambiente y las etapas de madurez influyen en los compuestos fenólicos de la fruta y en la síntesis de otros metabolitos secundarios. Además, esta variación puede estar asociada también con los métodos de extracción.
Los fenoles se conocen como los compuestos responsables del aroma y el color de muchas frutas. Esto se debe a que durante el proceso de maduración se acumulan en las vacuolas muchos compuestos secundarios, productos del metabolismo de los fenilpropanoides, entre ellos pigmentos, antocianinas, flavonoides y fenoles. A pesar de las diferencias existentes en los contenidos de fenoles totales de las variedades en estudio, los resultados de esta investigación mostraron que los frutos de morera podrían ser una fuente importante de constituyentes fenólicos. La realización de estudios más profundos acerca del perfil fitoquímico de estas variedades sería de gran utilidad, debido a las propiedades beneficiosas que estos componentes aportan a la salud.
La presencia de compuestos fenólicos, incluidas las antocianinas, los flavonoides y los ácidos fenólicos, puede contribuir, en forma y proporción diferentes, a la actividad antioxidante de las frutas. Diversas investigaciones demuestran la existencia de correlaciones altas de estos indicadores (Belwal et al., 2019; Rodrigues et al., 2019).
Correlación entre la capacidad antioxidante total, contenido de fenoles totales, antocianinas y vitamina C de los extractos etanólicos. Numerosos estudios refieren correlación entre la actividad antioxidante in vitro y el contenido de compuestos fenólicos y otras sustancias secuestradoras de radicales libres (Koss et al., 2019). Sin embargo, Stinco et al. (2015) destacaron que los resultados de muchas variables que se correlacionan pueden variar, ya que depende de varios factores, como el tipo de compuesto, la estructura química, los efectos sinérgicos y las condiciones específicas aplicadas.
Con respecto a ello, se encontró una correlación altamente significativa (p < 0,01) y positiva entre los indicadores CAT y FT con un r=0,621 y los fenoles totales (FT) (r=0,621) (tabla 1), así como para la CAT y el contenido de vitamina C (r=0,723).
Tabla 1 Matriz de correlación entre la capacidad antioxidante total (CAT), el contenido de fenoles totales (FT), antocianinas y vitamina C de los extractos etanólicos de frutos de M. alba.
** p < 0,01
Krishna et al. (2020) encontraron correlación positiva entre el contenido de antocianinas y la capacidad antioxidante medida por CUPRAC (capacidad antioxidante de reducción del ión cúprico) de 0,95 y el FRAP (ensayo del poder reductor férrico) de 0,96. Asimismo, obtuvieron correlación alta y positiva entre el contenido de fenoles totales y capacidad antioxidante (0,88 para CUPRAC y FRAP, respectivamente).
Natić et al. (2015) informaron alta correlación entre el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante, evaluada mediante el ensayo del poder reductor (PR) y el método de actividad de eliminación del radical anión superóxido (SAS), con correlación de 0,838 y 0,933, respectivamente.
Kobus-Cisowska et al. (2020), en un estudio del potencial antioxidante y la composición principal de polifenoles en diferentes extractos de frutos de M. alba, refirieron que los extractos de acetona presentaron capacidad alta de eliminación de radicales DPPH• y correlación positiva entre el efecto antioxidante DPPH• y los flavonoides totales (r=0,63), rutina (r=0,69) y ácido ferúlico (r=0,78). Estos autores afirman que la actividad antioxidante de los polifenoles confiere propiedades redox, debido a la capacidad de estos compuestos de donar átomos de hidrógeno (agentes reductores) en las reacciones de oxidación-reducción. En consecuencia, pueden actuar como constituyentes de quelatos metálicos o pueden eliminar los radicales libres (Zhang et al., 2018).
En otras especies del mismo género también se informa la existencia de correlaciones positivas entre la actividad antioxidante y el contenido de flavonoides y compuestos fenólicos. Hosseini et al. (2018) encontraron en el estudio realizado con frutos de M. nigra L. correlación positiva entre el contenido de flavonoides y los compuestos fenólicos (r=0,94). Además, la actividad antioxidante mostró correlaciones positivas con el contenido de compuestos fenólicos (r=0,80) y el contenido de flavonoides (r=0,80).
Entre los compuestos polifenólicos, los ácidos fenólicos constituyen fitoquímicos con marcada influencia en la capacidad antioxidante de las frutas y verduras. Estos ácidos actúan como inhibidores de la generación de radicales libres, pues son capaces de aumentar la actividad catalítica de las enzimas endógenas que participan en la neutralización de los radicales libres (Jin et al., 2017).
Según los resultados de esta investigación, las variedades de M. alba no mostraron comportamiento similar de actividad antioxidante, según los métodos evaluados. Este aspecto se puede atribuir a que cada componente fenólico puede contribuir, en forma y proporción diferentes, a la actividad antioxidante, y a que la correlación no solo depende de la concentración y la calidad antioxidante, sino de su interacción con otros metabolitos presentes en los extractos. Sin embargo, se demuestra correlación positiva entre los indicadores en estudio y la marcada actividad antioxidante que se observó en todas las variedades, debido al elevado contenido de antocianina (cianidina-3-glucósido) y vitamina C, así como de otros metabolitos secundarios.
La actividad antioxidante es la principal línea de defensa contra los radicales libres, formados producto del metabolismo celular. Los compuestos antioxidantes presentes en los frutos de M. alba pueden neutralizar estos radicales libres, por lo que resultan beneficiosos para la salud humana y animal. Las variedades estudiadas aportan formas nuevas de antioxidantes naturales en alimentos funcionales y nutracéuticos.
CONCLUSIONES
Los frutos de M. alba presentan elevados contenidos de antocianinas y vitamina C. La variedad Yu-62 tuvo las mayores concentraciones de estos compuestos.
Los extractos etanólicos presentaron elevada actividad antioxidante, lo cual está fuertemente correlacionado con el alto contenido de fenoles totales, de antocianinas y de vitamina C presentes en los frutos, por lo que constituyen un producto natural beneficioso, que se puede incorporar a cualquier tipo de dieta.
