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INTRODUCCIÓN
La lesión renal aguda (LRA) se caracteriza por cambios en la fisiopatología renal, siendo notable la disminución rápida del filtrado glomerular, lo que pone en peligro la vida del paciente si no se trata adecuadamente (Yan et al., 2021). A nivel mundial se presenta en el 30-70 % de los pacientes graves, con una mortalidad hospitalaria del 50 % (Lewington et al. 2013; Hoste et al. 2015; Moore et al. 2018; Lombardi et al. 2019). En Cuba, las afecciones renales constituyen la 12ma causa de muerte (Anuario Estadístico de Salud del 2020), donde la mortalidad por LRA es del 33,6 % (Castañer et al. 2017).
La isquemia-reperfusión (I/R) renal provoca LRA debido a la hipoxia, lo que conduce a la liberación de especies reactivas del oxígeno (ERO) y mediadores inflamatorios, que se asocian con alteraciones histopatológicas a nivel tubular principalmente, aunque se han descrito cambios sutiles en los glomérulos (Zuk y Bonventre, 2016; Chihanga et al. 2018). El estudio histopatológico de los glomérulos es importante para comprender mejor la fisiopatología de la LRA, en donde ocurre daño funcional a nivel glomerular, el cual puede conducir a una insuficiencia renal y al desarrollo de una enfermedad renal crónica, una condición en la que la supervivencia depende de la diálisis o el trasplante renal (Nasri, 2019).
Actualmente, a pesar del aumento de la morbi-mortalidad por LRA, aún no se dispone de tratamientos preventivos, por lo que la comunidad científica internacional continúa la búsqueda de sustancias potencialmente protectoras de la LRA. En la última década, diversos investigadores han demostrado que sustancias de origen natural con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias son los mejores candidatos para el tratamiento y/o la prevención de la LRA inducida por I/R renal (Venkatachalam et al. 2015; Rabb et al. 2016; Mahi-Birjand et al. 2020).
El D-005, extracto lipídico saponificado obtenido del fruto de Acrocomia crispa, palma endémica de Cuba perteneciente a la familia Arecaceae, contiene una mezcla reproducible de ácidos grasos, principalmente láurico, oleico, mirístico y palmítico, mientras el palmitoleico, caprílico, cáprico, y esteárico se encuentran en menores concentraciones (Sierra et al. 2014). En correspondencia con su composición química esta sustancia ejerce efectos antioxidantes y antiinflamatorios demostrados en estudios previos in vitro e in vivo (Pérez et al. 2016, 2017; Oyarzábal et al. 2020; Oyarzábal et al. 2021 a, b; Rodríguez-Salgueiro et al. 2021).
El D-005 previene la LRA inducida por I/R renal, evidenciado mediante la disminución de las concentraciones séricas de derivados nitrogenados (creatinina, ácido úrico y urea), del daño histopatológico de los túbulos renales, y los procesos oxidativos a nivel celular (Oyarzábal et al. 2018, 2019).
Teniendo en cuenta los resultados previos de protección funcional e histológica a nivel tubular que ejerció el D-005 en ratas sometidas a I/R renal, es posible suponer que esta sustancia pueda también prevenir el daño a nivel glomerular. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del D-005 sobre los cambios histomorfométricos en glomérulos de riñones de ratas sometidas a I/R renal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Animales
Se emplearon 42 ratas machos Sprague-Dawley (250-300 g) procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana), las cuales se mantuvieron en un Bioterio, con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y temperatura de 20-25 °C. La alimentación diaria fue con dieta estándar (CENPALAB) y agua corriente ad libitum.
El manejo de los animales se realizó de acuerdo con las normas establecidas y los principios éticos para el uso de animales de laboratorio recomendados en los lineamientos internacionales y en la República de Cuba, “Principios de las Buenas Prácticas de Laboratorio no Clínico de Seguridad Sanitaria y Medioambiental del Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos 039/2004”; así como los aspectos específicos plasmados en el Manual de Calidad y los Procedimientos Normalizados de Trabajo del Centro de Productos Naturales perteneciente al Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC), La Habana, Cuba.
Los animales se distribuyeron en siete grupos: un grupo control negativo (sin daño) y seis grupos sometidos a I/R renal: un control positivo tratado con el vehículo (Tween 65/H2O 2 %), cuatro grupos tratados con D-005 (25, 100, 200 y 400 mg/kg) y uno con Dexametasona (3 mg/kg), como sustancia de referencia.
El D-005 (Centro de Productos Naturales, CNIC, La Habana, Cuba) se administró por vía oral en forma de suspensión en Tween 65/H2O (2 %), mientras que la Dexametasona, por vía intraperitoneal (i.p), disuelta en tampón citrato de sodio 0,1 mol/L (pH 4,2). Ambas sustancias se administraron 1 h antes de inducir la I/R renal.
Inducción de la isquemia/reperfusión renal
Los animales se sometieron a un ayuno de 12 h y se anestesiaron con tiopental sódico (30 mg/kg, i.p). Una vez anestesiados se les realizó una incisión en la línea media, previo rasurado y desinfección del campo operatorio y seguidamente se colocaron en una mesa caliente para mantener la temperatura corporal durante la realización de la laparotomía. A continuación, se localizaron ambos paquetes vasculares renales y una vez identificados se realizó la oclusión de los mismos empleando pinzas microvasculares. Transcurridos 30 min se retiraron las pinzas permitiendo la reperfusión del flujo sanguíneo durante 24 h. Posteriormente, para su eutanasia, se anestesiaron previamente con tiopental sódico (30 mg/kg) y a continuación se desangraron por la aorta abdominal y se colectaron los riñones para el análisis histológico.
Procesamiento histológico
Los riñones se seccionaron mediante un corte sagital a través del hilio, se fijaron por inmersión en formol tamponado 4 %, se deshidrataron en disoluciones de etanol a concentraciones ascendentes (70 %-100 %). Se incluyeron en bloques de parafina y se obtuvieron secciones finas de 3-5 µm de grosor mediante un micrótomo Sakura. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina.
Análisis histomorfométrico
Se analizaron las imágenes de 10 campos histológicos ubicados a distancias regulares desde el polo superior al inferior de cada riñón, obtenidas mediante una cámara digital Canon EOS 1000 D#2, acoplada a un microscopio óptico Zeiss Primo Star, a 64 X. En cada imagen se evaluó el estado de los glomérulos renales y se procedió a la descripción histopatológica. Se seleccionaron los glomérulos que se encontraban completamente en el campo histológico y con límites definidos. Se midió el área total de los glomérulos o corpúsculos renales, bordeando la cápsula de Bowman, mediante el uso de la herramienta polígono del programa de morfometría computarizada Image J versión 1.39U (Fig. 1).
Procesamiento estadístico
Los datos se procesaron mediante el programa Graph Pad Prism versión 5.0 para Windows. Se determinaron los valores de media y error estándar de la media mediante estadística descriptiva. Se realizaron comparaciones entre los grupos control negativo y tratados con respecto al control positivo mediante la prueba de la U de Mann Whitney. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas cuando p ≤ 0,05.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el análisis histológico de las secciones de riñón del grupo control negativo se observó la estructura glomerular normal, caracterizada por ovillos de capilares y mesangio escaso, con 2-3 núcleos por zona mesangial. Los glomérulos estaban rodeados por la cápsula de Bowman, constituida por un epitelio simple plano (hoja parietal), separada de la hoja visceral por el espacio de Bowman, formando así los corpúsculos renales (Fig. 2A). El área glomerular promedio fue de 11 978,00 ± 513,2 µm2 (Fig. 3), en correspondencia con los parámetros normales de las ratas Sprague-Dawley machos adultas (Hassan et al. 2019).
Fig. 2 Corteza renal de ratas Sprague-Dawley. Tinción de Hematoxilina y eosina. A) Control negativo, B) Control positivo (isquemia-reperfusión), C) D-005 100 mg/kg, D) Dexametasona (3 mg/kg). Flechas: glomérulos.
Fig. 3 Efecto del D-005 sobre el área glomerular. I/R isquemia reperfusión renal. Comparación respecto al grupo control positivo; *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01 (Prueba U de Mann Whitney).
En el grupo control positivo (sometido a I/R renal) el corpúsculo renal presentó engrosamiento de la cápsula de Bowman, dilatación vascular con segmentación del ovillo capilar, aumento del mesangio a expensas de la matriz mesangial, sinequias (adherencias del ovillo a la cápsula de Bowman) y estrechamiento del espacio de Bowman (Fig. 2B). En este grupo el área glomerular disminuyó significativamente respecto al control negativo (9 987,00 ± 341,7 µm2; p=0,0070) (Fig. 3).
Este resultado confirma lo obtenido por otros autores en condiciones experimentales similares a las nuestras (Salahshoor et al. 2019; Kostina et al. 2021). El daño glomerular se relaciona con la afectación de las estructuras tubulares, como evento primario del daño por I/R renal, demostrada en estudios previos (Oyarzábal et al. 2018, 2019). En este modelo, el desequilibrio entre el suministro y el consumo de oxígeno y nutrientes a nivel local, junto con la acumulación de moléculas tóxicas en las células tubulares dañadas, inicia una lesión tubular y endotelial que conduce a la disfunción renal (Han et al. 2019).
El D-005 (25-400 mg/kg) disminuyó los cambios glomerulares provocados por la I/R renal; se apreció la cápsula de Bowman con epitelio simple plano, separada del ovillo capilar por el espacio de Bowman y conservación del mesangio (Fig. 2C). Además, desde la dosis mínima evaluada (25 mg/kg), aumentó significativamente el área glomerular con respecto al grupo control positivo (Fig. 3).
Teniendo en cuenta que la reducción del tamaño de los glomérulos conlleva a trastornos de la filtración glomerular (Fogo et al. 2016); la conservación de estas estructuras, tras la administración del D-005, indica una mejoría de la función renal. En este sentido, este resultado se relaciona con estudios previos, en las mismas condiciones experimentales, en donde el D-005 previno el aumento de los niveles sanguíneos de urea, creatinina y ácido úrico, lo que evidencia recuperación de la filtración glomerular y, por ende, de la función renal (Oyarzábal et al. 2018, 2019).
El estrés oxidativo tiene un papel clave en la patogénesis de las lesiones tubulares y glomerulares inducidas por la I/R renal, que resultan en la disfunción del órgano, por lo que la protección glomerular que ejerce el D-005, también podría estar relacionada con sus efectos antioxidantes y la protección de los túbulos renales que ejerció el D-005 en este modelo experimental (Oyarzábal et al. 2018, 2019), lo cual se encuentra en correspondencia con los efectos demostrados para otros extractos naturales obtenidos de diversas plantas (Gheitasi et al. 2020, Asgharpour et al. 2020, Ala et al. 2022).
Por otra parte, los efectos del D-005 sobre los glomérulos también podrían atribuirse a su acción inhibitoria sobre la actividad enzimática de la ciclooxigenasa tipo 2 (COX-2), demostrada previamente in vitro (Pérez et al. 2016); ya que durante la I/R renal la COX-2 se expresa de manera marcada en el riñón, en donde contribuye al aumento de la respuesta inflamatoria y el estrés oxidativo. En este sentido, estudios previos demuestran que los inhibidores de la COX-2 reducen la inflamación y el estrés oxidativo asociado (Moro et al. 2017).
De manera similar, otros extractos vegetales con propiedades antioxidantes y antiinflamatorias, como el obtenido de la planta Potentilla fulgens y la piperina de Piper nigrum, previenen la contracción de los glomérulos renales de ratas sometidas a I/R renal (Morsy et al. 2020, Yaris y Deveci, 2021).
La Dexametasona (3 mg/kg), sustancia de referencia de este estudio, previno los cambios histopatológicos glomerulares provocados por la I/R renal e indujo el restablecimiento del área glomerular, si bien aún se encontraron signos de daño (Figuras 2D y 3). En concordancia con este resultado, en estudios previos, la Dexametasona también restableció las variables de bioquímica clínica y protegió los túbulos renales dañados por la I/R renal, aunque en menor grado que el D-005. Vale señalar la mayor protección que ejerce el D-005 respecto a la Dexametasona, tanto a nivel tubular como glomerular, lo que representa una ventaja adicional para esta nueva sustancia (Oyarzábal et al. 2018, 2019).
Esta investigación demuestra el efecto nefroprotector del D-005 sobre los cambios histopatológicos a nivel glomerular inducidos por I/R renal en ratas, posiblemente asociado a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias.
