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INTRODUCCIÓN
El mejor reflejo del valor nutritivo de un alimento es la respuesta productiva de los animales que lo utilizan. Tradicionalmente se afirma que depende, fundamentalmente, de factores tales como su consumo, composición química y la digestibilidad (Baumont et al., 2000).
La evaluación de los alimentos debe definir las características que permiten predecir el comportamiento productivo del animal como la ganancia de peso, la producción de leche, el crecimiento de la lana, etc. En tal sentido, las técnicas con cada vez mayor presencia del trabajo de laboratorio y menor uso de animales han venido ganando terreno debido a su rapidez y relativamente bajo costo (Posada y Noguera, 2005). Usualmente, se usa el término digestibilidad para representar la cantidad de materias secas y/o nutrientes que son absorbidos en el tracto gastrointestinal del total consumido por el animal,
Tanto como la degradabilidad ruminal o in sacco, las técnicas de digestibilidad in vitro y más específicamente la de producción de gas han ido cobrando cada vez mayor importancia (Ayasan et al., 2018). El presente trabajo pretende recopilar información sobre algunos aspectos generales de la técnica y referirse al alcance que hasta hoy día ha tenido la misma.
DESARROLLO
Breve bosquejo y desarrollo histórico
La técnica llamada de gas in vitro (GIV) desarrollada por Menke et al. (1979) quedó para la historia como método estándar al ser adoptado por el sistema alemán de evaluación de alimentos. Los recipientes de incubación, jeringuillas o botellas, se colocan en un baño de agua regulado a 39±0.5 °C. La producción de gas que se produce cuando se inocula la muestra con líquido ruminal, heces o enzimas en un medio mineral amortiguado por bicarbonatos que libera una cantidad de gas proporcional a los ácidos grasos volátiles producidos. Para forrajes, el tiempo de lectura generalmente utilizado es después de 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas, pero para concentrados es necesario leer más frecuentemente en las primeras 24 horas. Las lecturas en intervalos de una hora elevan notablemente la precisión, lo que permite obtener también una descripción más exacta de la fase lag (Mauricio et al., 2001; Sobalvarro et al., 2020; Juraci et al., 2023).
Por otro lado, en época tan temprana como 1974, se había descrito un criterio diferente para la medición de la producción de gas in vitro (Wilkins, 1974) que consistía en mantener la fermentación en un recipiente sellado y medir la presión en el espacio “vacío”. El principio de medir la presión con sensor apropiado ha sido ampliamente adoptado con diferentes variantes. La más simple fue descrita por Theodorou et al., (1994) y consiste en medir manualmente la presión con el uso de un transductor. Estos autores propusieron un sistema semiautomático en el cual los sustratos se incuban en frascos sellados donde los gases de la fermentación se acumulan en el espacio superior y se usa una combinación de jeringa/transductor de presión para medir y liberar el gas acumulado hasta restaurar la presión atmosférica en el interior del frasco. Se usan las mediciones de presión del gas acumulado en el espacio superior para generar estimados del volumen de gas.
A diferencia de los sistemas completamente automáticos, que combinan cada botella con su propio transductor de presión, este utiliza un único transductor que manualmente se traslada a todos los frascos de fermentación. Las principales ventajas del sistema son su elevada capacidad, bajo costo y su fácil mantenimiento. Métodos con el uso de transductores, más o menos automatizados han sido descrito por varios autores (Van Gelder et al., 2005; Rodríguez et al., 2017).
La mayor innovación de la técnica de GIV es que se mide la producción de gas de la muestra en lugar de su degradación (Posada y Noguera, 2005); el mismo postulado continúa hasta hoy, aun cuando el método ha sido simplificado, mejorado y automatizado con el auxilio de las computadoras (García et al., 2022)
Heces como inoculo
En la búsqueda por encontrar inóculos alternativos al líquido ruminal las heces han ocupado un lugar preponderante (Bauer et al., 2004; Youssef y Kamphues, 2018).
En fecha temprana Jones y Barnes (1996) llevaron a cabo estudios de digestibilidad de la materia seca in vitro de leguminosas tropicales con fluido ruminal y heces bovinas como fuente de inóculo. Los valores de digestibilidad obtenidos con el uso de fluido fecal fueron linealmente correlacionados con aquellos obtenidos con fluido ruminal (r=0.98).
En trabajos comparativos entre heces de vacas y líquido ruminal, Akhter et al. (1999) concluyen que las primeras pueden ser una alternativa a los segundos en la evaluación de la digestibilidad in vitro de forrajes. Resultados similares fueron publicados por Martínez et al. (2008); Sáenz et al. (2022).
Las heces de vaca y ovejas han sido utilizadas como inóculo alternativo y su potencial en las técnicas de gas in vitro establecido (Varadyová et al., 2005; Martínez et al., 2005; Posada et al., 2012; Pandian et al., 2016; Sáenz et al., 2022).
El empeño ha estado motivado más que otra cosa por cuestiones bioéticas como los animales quirúrgicamente modificados.
La influencia del inóculo
Entre los factores muy a tener en cuenta en la producción de GIV ya sea con líquido ruminal (LR) o heces es determinante controlar la variabilidad que muestra el inoculo (Martínez et al., 2005).
En tal sentido, son prácticas comunes, mezclar inóculos provenientes de diferentes animales e introducir muestras de referencia para corregir las diferencias debidas a la influencia del inóculo (Mauricio et al., 2001; Posada y Noguera, 2005; Martínez et al., 2014).
Los criterios generalmente aplicados son que al igual que los blancos (jeringas o transductores sin muestra), los estándares o muestras de referencia deben ser corridos en cada experimento. Cada muestra de referencia ha de tener un perfil de gas conocido, determinado por promedio de muchas réplicas. Si la muestra de referencia incluida dentro de una corrida produce entre el 90 y el 110% del gas con respecto al valor promedio, entonces el fluido ruminal es calificado como "normal" y todas las medidas de volumen de gas son corregidas por el factor "promedio del volumen de la muestra de referencia/volumen de la muestra en la corrida". Si, por el contrario, el volumen de la muestra de referencia en la corrida está situado por fuera de este rango, el inóculo se clasifica como "alterado" y los datos de la corrida se suelen desechar (Schofield, 2000).
La preparación de muestras de referencia lo suficientemente estables y homogéneas es una necesidad. El uso de estándar interno tiene como importante limitante que la muestra que se use como referencia debe tener un perfil similar a la que se analiza, en aras de que se puedan extrapolar los resultados. Por otro lado, ha de cuidarse de preparar siempre nuevas muestras cuando aún hay suficiente cantidad de las que se pretendan reemplazar para logar un vínculo confiable entre ambas. La calibración externa dependerá de contar con un buen número de muestras cuya digestibilidad in vivo o in sacco haya sido bien determinada (Kamalak et al., 2005; Martínez et al., 2008; Sharifi et al., 2019). La producción de tales muestras es costosa por lo que la colaboración entre laboratorios es esencial (Rymer et al., 2005).
Experimentos realizados por Mauricio et al. (1998; 2001), con el fin de comparar líquido ruminal y heces extraidas como fuente de inóculo, mostraron que con la materia fecal se aprecian mayores fases lag y una menor capacidad de fermentación. En trabajos posteriores (Martínez et al., 2005 y 2008; Sharifi et al., 2019) llegaron a igual resultado, los primeros autores con el uso de heces depuestas, lo que agrega la ventaja de prácticamente no tocar al animal.
El uso de un inóculo más concentrado o de mayor cantidad de inóculo fecal y el mejoramiento de la actividad fermentativa de los microrganismos ha sido también investigado (Cubillos, 2010; Cantet et al., 2020). Estos últimos autores encontraron que un pretratamiento del inóculo en aras de aumentar su fuerza no era una solución viable.
Otros inóculos
Cultivos de microorganismos apropiados podrían, en teoría, ser usados para producir inóculos estandarizados sin el uso de animales experimentales. Tales cultivos podrían ser preparados con un amplio rango de actividad que se pueden crear las condiciones para mantenerlos como tal. Rymer et al. (2000) investigaron el uso de cultivos bacteriales con la mezcla de varios microorganismos y compararon los patrones producción de gas de varios alimentos. Encontraron que, aunque hay diferencias en la forma de los perfiles con los cultivos bacterianos en que se produce gas a velocidades mucho más bajas que con los inóculos de líquido ruminal, hubo una alta correlación entre los parámetros. Aún queda por avanzar en este sentido
Elías et al. (2005) reportan una metodología para la determinación exitosa de la digestibilidad de la materia seca y materia orgánica in vitro mediante la utilización de "células lavadas" (bacterias extraídas de líquido ruminal con la ayuda de la centrifugación). Esta alternativa puede ser probada para producción de gas in vitro. Basados en ese criterio, Cubillos et al. (2010) propusieron medir la fuerza del inóculo de heces bovinas depuestas y usar una cantidad inversamente proporcional a dicha fuerza.
Además se han usado heces de equinos (Elghandour et al., 2016; Franzan et al., 2018) y caprinos (Martínez et al., 2014).
Alcances de la técnica
La tabla que se muestra a continuación ofrece una medida de la versatilidad de la técnica de gas in vitro:
Como puede apreciarse, en los últimos años ha predominado el uso de la técnica para la búsqueda de vías que permitan el control del metano como principal gas de efecto de invernadero producido por los rumiantes.
Llama la atención que el estudio de la relación entre líquido ruminal y heces se ha estado estudiando prácticamente desde que surgió la técnica y aún continúa haciéndose.
CONCLUSIONES
La técnica in vitro de producción de gases es probablemente la herramienta más versátil de medición de la digestibilidad; presenta procedimientos didácticos y accesibles; acarrea menos costos; además representa una alternativa más compatible para las legislaciones de bienestar animal, al usar las heces como inóculo. Se ha aplicado con éxito para diversos propósitos en la evaluación de alimentos para rumiantes, incluido el cálculo de la digestibilidad de la materia orgánica, la energía metabolizable de los alimentos y la cinética de su fermentación; determinar cómo el valor del alimento se ve afectado por los factores antinutritivos y los aditivos, etc.
Esta técnica puede medir el volumen de gas a presión atmosférica constante, la presión de gas a un volumen fijo, o una combinación de ambos procedimientos, empleando metodologías manuales, semiautomáticas y automáticas.
