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INTRODUCCIÓN
Las enfermedades diarreicas agudas (EDA) son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo, sobre todo en el grupo de niños menores de 5 años.1 Dentro de sus agentes causales, se encuentran diferentes bacterias y entre ellas sobresale Vibrio cholerae, como uno de los de mayor importancia médica.2,3
Basado en el antígeno O del lipopolisacárido capsular, V. cholerae se clasifica en más de 200 serogrupos idénticos desde el punto de vista bioquímico, dentro de los que se encuentran el O1 y O139, serogrupos epidémicos que causan el cólera,4 mientras que, los no-O1, se consideran no epidémicos y causan brotes o casos esporádicos de diarreas, con síntomas y signos clínicos que difieren del cólera.3 La circulación simultánea de los serogrupos epidémicos y no epidémicos constituye una emergencia para la salud, ya que por el intercambio genético demostrado entre aislados de V. cholerae de genes de virulencia y de resistencia a los antimicrobianos pudieran aparecer cepas más virulentas y con potencialidad para convertirse en agente etiológico de cólera y generar nuevas epidemias.5
A pesar de los estudios escasos sobre los factores de virulencia en aislados de V. cholerae en América Latina y el Caribe,6 en la literatura consultada describen la presencia de productos extracelulares tales como una enterotoxina termoestable NAG-ST, la TCP, la producción de las siguientes enzimas: gelatinasa, elastasa, lecitinasa y hemolisinas y la capacidad de formación de biopelícula.7,8
Después de la introducción de los agentes antimicrobianos, V. cholerae permanece con una relativa sensibilidad antibacteriana hasta finales de 1970. La problemática creada por el uso inadecuado de los antimicrobianos asociados a los brotes de cólera, adquiere mayor importancia a la luz del incremento de la multirresistencia en las diferentes áreas geográficas.9,10
En Cuba, desde 1980 el Laboratorio Nacional de Referencia-EDA del Instituto Pedro Kourí (LNR/EDA) realiza la vigilancia del V. cholerae donde se evidencia desde 1985, la circulación de V. cholerae no-O1 de origen clínico y ambiental. A partir de 1997 se comienzan a realizar los estudios de susceptibilidad a los antimicrobianos, donde se demuestra que no circulan aislados multirresistentes de esta especie. En 2012 se detecta por el LNR/EDA el agente etiológico del cólera, produciendo un alza de casos entre los años 2013-14 y a partir del 2017 no se notifican casos sospechosos de la enfermedad en el país. En este estudio se propone estudiar los aislados de V. cholerae no-O1causantes de diarrea que circularon en las etapas epidémica y postepidémica (2012-2019), en cuanto a la distribución en las regiones geográficas del país, las variaciones en el potencial patogénico y la resistencia a los antimicrobianos en estos aislados.
MÉTODOS
Se realizó un estudio analítico de corte trasversal que abarcó 8 años, desde enero de 2012 hasta diciembre de 2019.
Universo y muestra: Se estudiaron 80 aislados de V. cholerae pertenecientes a la colección de cultivos del LNR/EDA/IPK, remitidos desde los 15 Centros Provinciales de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CPHEM) del país y el Centro Municipal de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CMHEM) de la Isla de la Juventud.
Desde el punto de vista geográfico, los centros emisores de los aislados se agruparon en regiones, según la división político administrativa vigente en el país. A todos se les realizó la confirmación de género, especie y el serotipo utilizando la metodología convencional.11 Además, se particularizó en describir los relacionados con brotes, considerando como brote aquellos donde la unidad emisora de los aislados de V. cholerae refirió que pertenecieron a un episodio en el cual hubo 2 o más enfermos relacionados entre sí; se tuvo en cuenta el momento de inicio de los síntomas, el lugar donde ocurrieron o las características de las personas enfermas.12
Identificación de los factores de virulencia: Para la identificación de las enzimas extracelulares se sembró por agotamiento una asada del microorganismo en los medios recomendados, a partir de un cultivo puro de 18 h a 24 h de incubación en el medio de AHK. Para la determinación de las enzimas DNasa, gelatinasa, lecitinasa y elastasa se utilizó los medios recomendados en la metodología según Karagozova A y Salnikova O, 2000.13 Y para la actividad hemolítica se siguió el procedimiento recomendado por Robinson J, 1986.14
Determinación de la biopelícula en los aislados de V. choleraeno-O1
A partir de un cultivo puro en AHK se realizó la capacidad de formación de biopelícula, según lo descrito por O'Toole GA y col., 2011. La aparición de color azul indicó la formación de la biopelícula. Se clasificaron en 4 categorías desde 1 cruz (25 %) hasta 4 cruces (100 %) de acuerdo al área de teñido del pocillo. Además, se estableció una correlación entre el sistema de cruces y la clasificación de formación de biopelícula en débil, moderado, fuerte y muy fuerte.15
Determinación de la susceptibilidad a los antimicrobianos: Se determinó la susceptibilidad de cada uno de los aislados, frente a 9 antimicrobianos (ampicilina, tetraciclina, trimetoprim/sulfametoxazol, cloranfenicol y ciprofloxacina, gentamicina, kanamicina, doxiciclina y azitromicina). Se utilizó el método de difusión en agar Kirby-Bauer para la ampicilina, la tetraciclina, el trimetoprim/sulfametoxazol, el cloranfenicol, la ciprofloxacina, la gentamicina y la kanamicina. Para la doxiciclina y la azitromicina se utilizó el método de dilución en agar, determinando la CMI de cada antimicrobiano mediante el sistema commercial prueba de Épsilon (etest, por sus siglas en inglés. Se utilizaron los criterios de resistencia según los puntos de corte establecidos por CLSI de 2010 y 2018.16,17
Criterio de multirresistencia: se consideraron como multirresistentes aquellos aislados de V. cholerae que mostraron resistencia a 3 o más familias de antimicrobianos diferentes.17
Análisis estadístico: Los datos se archivaron y procesaron en una base de datos con el uso del programa excel de microsoft office. Se utilizaron medidas estadísticas descriptivas como la frecuencia y el porcentaje para el análisis y la presentación de los resultados. Para el análisis de las variables cualitativas se emplearon las pruebas de comparación de proporciones y chi-cuadrado (Χ2) en muestras independientes.
Para evaluar la asociación de los factores de virulencia enzimáticos, la formación de la biopelícula y el serotipo con la presencia de la multirresistencia, se realizó un análisis bivariado. Se empleó la prueba de chi cuadrado para comparar los grupos multirresistentes (MR) y no MR o la prueba exacta de Fisher, si alguna de las celdas (en las tablas tetracóricas construidas) tenía algún valor esperado menor de 5. Se calcularon los valores de odds ratio (OR) con sus intervalos de confianza al 95 % (IC 95 %) para la evaluación de riesgo. Posteriormente, se realizó una regresión logística binaria para minimizar los sesgos y ver la influencia de conjunto de todas las variables estudiadas en los aislados MR.
RESULTADOS
Distribución temporo-espacial de V. cholerae en Cuba
De los 80 aislados estudiados, el 17,5 % procedían de brotes. La figura 1 muestra la distribución en el período de estudio, evidenciándose la identificación de este agente en el período epidémico y postepidémico.
Fig. 1 Distribución en el tiempo de los serogrupos V. cholerae no-O1 responsables de enfermedad diarreica en Cuba (2012-2019).
La distribución porcentual de los serogrupos según regiones geográficas demostró que, aunque se identificó en las 3 regiones del país, fue la región oriental la que aportó el mayor número de aislados (figura 2).
Presencia de factores de virulencia
Se evidenció la presencia de 2 o más factores de virulencia enzimáticos (lecitinasa, Dnasa, gelatinasa, elastasa, betahemolisina) en los aislados estudiados. Los mayores porcentajes se obtuvieron para las enzimas lecitinasa (95 %), gelatinasa (93,7 %), seguido de hemolisina (80 %), DNasa (76,2 %) y elastasa (46,2 %). Se demostró un incremento del porcentaje de positividad para todos los factores de virulencia enzimáticos en relación a estudios anteriores.
En relación a la capacidad de formación de biopelícula de los aislados estudiados, se identificó que 54 (67,5 %) resultaron positivos, lo que demuestra su habilidad para sobrevivir durante el ciclo infeccioso y en el ambiente.
La distribución de los aislados según la intensidad del color de la biopelícula formada en cada uno de los períodos estudiados se evidenció que, entre los aislados positivos predominaron los clasificados con 2 cruces con porcentajes de positividad de 46,3 %, seguidos por los catalogados con una cruz (38,9 %). En los aislados clasificados con 3 cruces y 4 cruces los valores de positividad fueron de 9,2 % y 5,5 %, respectivamente.
Resistencia a los antimicrobianos y relación con el fenotipo de virulencia
Se demostró los mayores porcentajes de resistencia frente a la ampicilina (91,2 %) y al trimetoprim/sulfametoxazol (68,7 %). Para los antimicrobianos de primera y segunda línea empleados para el tratamiento de las diarreas por V. cholerae (la doxiciclina, la azitromicina y la ciprofloxacina), los valores fueron inferiores al 5 % (figura 3).
En el período se evidenció que 6 (7,5 %) de los aislados resultaron multirresistentes, con 5 patrones de multirresistencia: AMP/SXT/C (33,3 %), AMP/C/TE (16,6 %), AMP/SXT/K (16,6 %), AMP/SXT/CIP (16,6 %), AMP/C/SXT/DXT/TE (16,6 %) y en 3 de ellos, están incluidos los antimicrobianos utilizados en el tratamiento de elección.
La figura 4 muestra la distribución porcentual de los aislados multirresistentes en el período. Nótese que circularon en los años 2012, 2015 y 2016 (período epidémico) y 2018, 2019 (período postepidémico).
Fig. 4 Distribución porcentual de los aislados de V. choleraeno-O1 multirresistentes en el período. Cuba. 2012-2019.
La figura 5 muestra la distribución según las regiones geográficas de los aislados multirresistentes en el período 2012-2019. Se evidenció que la circulación de estos aislados comenzó por la región oriental y luego se extendió a la región central y occidental de Cuba.
Fig. 5 Distribución de los aislados de V. choleraeno-O1 multirresistentes, según regiones geográficas. Cuba. 2012-2019
Según el análisis bivariado y la regresión logística binaria se demostró que no hubo asociación entre la presencia de los factores de virulencia y la multirresistencia en los aislados incluidos en el estudio.
DISCUSIÓN
Las especies de Vibrio muestran una amplia distribución en ambientes acuáticos de todo el mundo,18 y como consecuencia del cambio climático, puede ser responsable de los brotes de infección por Vibrio.19
La circulación de aislados de V. choleraeno-O1procedentes de pacientes con EDA en las 3 regiones del país también se evidenció desde la década de los ´80 hasta 1998 en Cuba, donde se demuestra una mayor circulación en la región oriental, sugiriendo la posible existencia de un nicho ecológico que favorece la persistencia de las diarreas causadas por este agente.
La coexistencia de V. cholerae O1 y V. cholerae no-O1 se demostró en investigaciones realizadas en Ghana durante los años 2015-2016, en muestras de heces obtenidas de pacientes con EDA y del ambiente.20
Como está descrito en la literatura internacional, durante los brotes de cólera circulan junto con V. cholerae O1, los serogrupos no epidémicos. Así lo notifican en Tailandia, Iraq y Japón.21 Esto representa una emergencia de salud para el mundo debido a la transferencia horizontal de genes que aportan virulencia y resistencia antimicrobiana entre los serogrupos de la misma especie, lo cual favorece la aparición de cepas más virulentas.22
Los aislados de V. cholerae no-O1, a pesar de no poseer los genes que codifican para la toxina colérica, son capaces de causar enfermedad en el humano mediante la colonización del intestino delgado y la producción de enzimas extracelulares involucradas en su patogenicidad.23
En Cuba, varios estudios evidencian la presencia de enzimas extracelulares en los aislados de V. cholerae no-O1. Pérez. C y col. en 2013 demuestra que la mayoría de los aislados no toxigénicos de esta especie producen la enzima gelatinasa.24 De igual forma, Cabrera y col. en el año 2006, en 65 aislados procedentes de pacientes con EDA, informan al menos 2 factores de virulencia presentes en todos los aislados, donde el 100 % de los mismos son positivos a las enzimas hemolisina y gelatinasa; seguido de DNasa (73,8 %), lecitinasa (80 %) y elastasa (86,1 %).25
Saleh y col., encuentran en Iraq durante el período 2007-2009, que el 100 % de los aislados de V. cholerae no-O1 obtenidos de pacientes con EDA producían lecitinasa.26) Un factor clave para la supervivencia ambiental y transmisión de V. cholerae es su capacidad para formar biopelícula. Diferentes investigaciones sugieren que el desarrollo de la biopelícula por V. cholerae puede ser importante durante el desarrollo de la infección en los humanos.27-29
Estudios realizados en Alemania, Austria y Eslovaquia ponen de manifiesto que la presencia de biopelícula es más común en los serogrupos no epidémicos.23,27) La intensidad de la biopelícula está relacionada con la patogenicidad en este microorganismo, ya que este hecho puede condicionar el pronóstico y el tratamiento de la infección causada por V. cholerae.23
En el estudio realizado en Alemania y Austria, en aislados de V. cholerae procedentes de pacientes con EDA, evidencian la formación de biopelícula con predominio en la intensidad de 2 cruces, o sea moderada (33,3 %)30 Sin embargo, en Eslovaquia, se evidencia en V. cholerae que predominan los aislados clasificados como muy fuerte (4 cruces).23
El no cumplimiento de los regímenes de tratamiento antimicrobiano prescritos conduce con frecuencia a la aparición de resistencia antimicrobiana.31 Está demostrado que los aislados de V. cholerae adquieren resistencia a casi todos los antimicrobianos después de su uso para el tratamiento del cólera. La OMS recomienda la doxiciclina, la azitromicina y la ciprofloxacina como medicamentos de elección para el tratamiento de los casos de cólera.32
Según la literatura especializada, para determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos no se tienen en cuenta los diferentes serogrupos de V. cholerae. Los puntos de corte según la CLSI se determinan para la especie, teniendo en cuenta que la resistencia intrínseca a los antibióticos está asociada a la adquisición de determinantes genéticos de resistencia y mutaciones dentro de la misma especie y entre los enteropatógenos en general.16
En Cuba, Majano en un estudio en aislados de V. cholerae no-O1 evidencia un 5,5 % de resistencia a la tetraciclina.33) De igual forma, investigaciones realizadas en Hangzhou, provincia de China, detectan en aislados de V. cholerae O1 toxigénicos y no toxigénicos causantes de EDA entre los años 2001-2012, valores de resistencia de 1 % frente a la tetraciclina.21 La tetraciclina es un fármaco de poco uso por sus efectos adversos gastrointestinales y el depósito de este fármaco en los dientes y huesos, puede ser la causa del porcentaje de aislados resistentes frente a este antimicrobiano.20 El porcentaje de aislados resistentes a la doxiciclina en el período estudiado, fue similar al obtenido en 2019 en Ghana, quienes al investigar aislados de V. cholerae de origen clínico y ambiental, no evidencian resistencia a este antimicrobiano.20
En relación con la susceptibilidad antimicrobiana frente a la azitromicina, en la presente investigación no se identificó resistencia entre 2012-2019, lo que no coinciden con los obtenidos por Abana D y col., en 2019 en Ghana, quienes en aislados de origen clínico detectan valores de resistencia de un 42 % para este antimicrobiano.20
La política de antibióticos aplicados en Cuba para el tratamiento de las EDA causadas por V. cholerae, indica el uso de la ciprofloxacina en aquellos pacientes adultos con la vía oral comprometida o que presenten antecedentes de alergia al medicamento de elección. Estudios previos realizados en 2008, no identifican aislados resistentes frente a este antimicrobiano en Cuba.25 De igual forma, investigaciones realizadas en Ghana en el año 2018, no detectan aislados de V. cholerae resistente a la ciprofloxacina.34
Entre los antimicrobianos estudiados en esta investigación, el mayor porcentaje de resistencia se observó frente a la ampicilina y al trimetoprim/sulfametoxazol. En Cuba, resultados similares se evidencian, en aislados de V. cholerae, al notificar el 55,5 % y 57 % de resistencia para la ampicilina, y 44,9 % y 41 % para el trimetoprim/sulfametoxazol, respectivamente.25,33
En el caso de la resistencia detectada frente al cloranfenicol en el presente estudio, puede explicarse por su poco uso en Cuba, asociado a serios efectos adversos hematológicos, por lo que se reserva para el tratamiento de infecciones severas siempre y cuando no existan otras alternativas de tratamiento eficaces y menos tóxicas.35
Frente a los aminoglucósidos el porcentaje de resistencia obtenido fue similar a los obtenidos por Válariková J y col., 2019, quienes no obtienen aislados resistentes a la gentamicina.23
La adquisición de genes de resistencia en aislados de V. cholerae constituye un importante fenómeno desde el punto de vista clínico, ya que se incrementan los enfermos con fallo terapéutico y, por ende, la estancia hospitalaria.34
Los patrones de multirresistencia en V. cholerae no-O1 están menos estudiados que los serogrupos epidémicos.36) Investigaciones realizadas en países del continente asiático, evidencian que la resistencia de estos serogrupos generalmente se asocia a los brotes de cólera, demostrándose resistencia a varios antimicrobianos y a la circulación de aislados MR.23
Este trabajo es el primero en notificar la circulación de aislados MR de este patógeno en Cuba. El porcentaje de los aislados MR y los patrones de multirresistencia detectados, constituyen un llamado de alerta y ratifica la necesidad de mantener la vigilancia de la susceptibilidad de los aislados de V. cholerae circulantes en el país.
La detección de los aislados MR según las regiones geográficas se relacionó con la aparición de los brotes de cólera en el 2012, los que comenzaron por la región oriental. Se conoce que, dentro de las medidas aplicadas en el control del cólera está la aplicación de la terapia con antimicrobianos en los pacientes y contactos, lo que ejerce una presión selectiva sobre los aislados circulantes durante el brote, favoreciendo así la aparición de la multirresistencia.
Estudios recientes evidencian que, en los países no endémicos de cólera, la presencia de V. cholerae no-O1 juega un papel en la diseminación de genes de resistencia, por lo que debe mantenerse una estrecha vigilancia sobre este aspecto en estos serogrupos.37
Los resultados de la presente investigación acerca de la relación entre los factores de virulencia y la multirresistencia en los aislados estudiados pueden relacionarse con la ausencia de mecanismos de resistencia, como las bombas de eflujo, la adquisición de plásmidos y de elementos integradores y conjugativos, involucrados en ambos procesos.38
Las bombas de expulsión y los determinantes de virulencia se estudian en especies de importancia clínica entre las que se encuentra V. cholerae. Bina y col., en los Estados Unidos refieren que los aislados que presentan bombas de expulsión RND (resistencia-nodulación-división celular) muestran una disminución en la producción de la TC y Tcp en comparación con aislados salvajes.39
Hay algunos ejemplos claros en los que la coselección de resistencia y virulencia se produce a través de ICE. En V. cholerae, la enzima bis- (3 ', 5') - GMP dimérico cíclico aumenta la formación de biopelículas y disminuye la virulencia y la motilidad, por lo que se considera un factor importante para la persistencia en el medio ambiente.40 Se documenta la plasticidad in vitro y la capacidad del ICE para transferir genes de virulencia a otras especies como E. coli.41
La capacidad de formación de la biopelícula evidencia en aislados de V. cholerae que, las células dentro de la biopelícula son más resistentes a la acción de los antimicrobianos, y no se refiere a los mecanismos genéticos descritos para este patógeno, sino implica que los antimicrobianos no pueden penetrar y ejercer su acción en las células.8 Los mecanismos bacterianos implicados en la patogenicidad y virulencia experimentan un largo proceso evolutivo dependiente de la relación hospedero-patógeno. Muchos de estos cambios se deben a la presión de selección provocada por los antimicrobianos, lo que obliga a los microorganismos a su adaptación de manera continua a las condiciones cambiantes, con la adquisición o el desarrollo de nuevos mecanismos de patogenicidad y resistencia.41,42
De manera evidente, estos resultados ratifican la problemática en Cuba de las infecciones gastrointestinales por V. cholerae no-O1 y sugiere utilizar los resultados de la investigación para el diseño de las estrategias focalizadas, atendiendo al patrón de distribución temporo-espacial. Este enfoque es además significativo y de vital importancia en el manejo de las diarreas, pues brinda al Sistema Nacional de Salud y al Programa de Enfermedades Trasmitidas por Alimentos, una información útil y pertinente referente a la programación de y hacia dónde deben dirigirse los recursos humanos y materiales necesarios para el control de las EDA.
