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INTRODUÇÃO
No Brasil, o Ministério da Saúde introduziu algumas políticas públicas que buscam a inclusão do uso de plantas medicinais no Sistema Único de Saúde tais como a Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares, Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos e a Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS).1 Essas medidas são voltadas para prevenção, promoção e recuperação da saúde através de acesso seguro e uso racional de plantas medicinais.1,2
Em 2009, o Ministério da Saúde elaborou a Relação de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS, o RENISUS, que trata de uma lista com 71 espécies com potencial terapêutico para orientar pesquisas e desenvolvimentos de produtos de interesse do SUS. Com isso, pretende-se ampliar a lista de medicamentos fitoterápicos disponíveis na assistência farmacêutica básica no país.3
Considerando os problemas que acometem a cavidade bucal, o uso de plantas medicinais é baseado no conhecimento popular, sendo frequentemente empregadas como agentes antimicrobianos, anti-inflamatórios, analgésicos, entre outros.4,5 Entretanto, a validação do efeito biológico previsto pelo conhecimento popular nem sempre é confirmada cientificamente.
Diante da diversidade de problemas orais com etiologia microbiana, se faz necessário avaliar a atividade biológica de plantas medicinais frente microrganismos patogênicos de interesse oral. Sendo comprovada a atividade antimicrobiana e potencial de aplicabilidade na clínica odontológica, os resultados do presente estudo poderiam subsidiar o desenvolvimento de novas drogas e produtos cosméticos de origem natural. Logo, este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana de diferentes extratos de ervas medicinais sugeridos pelo Ministério da Saúde para utilização no SUS frente a bactérias orais.
MÉTODOS
A atividade antibacteriana de extratos de ervas medicinais sugeridos pelo MS foi avaliado in vitro por meio das técnicas de difusão em ágar e determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM).
Extratos naturais
Os extratos de ervas medicinais avaliados advém da lista com 71 ervas medicinais divulgada pelo MS para uso no SUS. Dentre essas, selecionou-se as que tinham origem no Brasil e estavam disponíveis comercialmente sob forma de tintura ou óleo essencial (OE). Seis extratos foram obtidos junto à farmácia de manipulação Homeovitae (João Pessoa, Paraíba, Brasil) e à Empresa Viessence® (Florianópolis, Santa Catarina, Brasil). Os extratos de Eucalyptus globulus (eucalipto), Mentha piperita (menta hortelã) e Schinus terebinthifolius (aroeira) foram obtidos sob forma de óleo essencial; enquanto que Erythrina mulungu (mulungu), Casearia sylvestris (guaçatonga) e Maytenus ilicifolia (espinheira santa) foram adquiridos na forma de tintura.
Cepas bacterianas
As cepas de referência utilizadas no estudo foram Streptococcus mutans (ATCC 25175), S. oralis (ATCC 10557) e S. salivarius (ATCC 7073), obtidas do Laboratório de Materiais de Referência do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, Rio de Janeiro - RJ, Brasil).
O processo de reativação deu-se em caldo Sabouraud-Dextrose, a 37ºC e a estocagem em ágar Sabouraud-Dextrose 4 % no Laboratório de Microbiologia Oral - Núcleo de Medicina Tropical do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Paraíba. As suspensões bacterianas foram preparadas em soluções salinas e ajustadas a escala de MacFarland 0,5. O número aproximado de colônias viáveis foi de 1,5 × 106 UFC/mL.
Método de difusão em ágar
Para avaliação inicial da atividade antibacteriana dos produtos, realizou-se o método de difusão em ágar. As suspensões bacterianas (1,5 × 106 UFC/mL) foram semeadas em placas de Agar Müller Hinton (DIFCO®, Detroit, Michigan, EUA), nas quais foram confeccionados poços com 6 mm de diâmetro. Cada poço foi preenchido com 50 μL das soluções testadas e do controle (Clorexidina 0,12 %), em formulação pura. As placas foram incubadas em estufa bacteriológica, a 37 ºC, por 48 h. Os extratos sob a forma de óleos essenciais e de tinturas foram avaliados em placas separadas, no intuito de diminuir possíveis interferências de um sobre outro. As zonas de inibição de crescimento bacteriano foram medidas em milímetros com auxílio de paquímetro e comparado ao controle positivo.
Concentração inibitória mínima
As tinturas foram adquiridas sob a concentração de 20 % correspondendo aproximadamente a 180 mg/mL. Já os óleos essenciais (OE) foram inicialmente diluídos em água destilada estéril e Tween 80, obtendo-se a concentração 16 %. Para obtenção das diluições dos OEs, foi considerada a densidade das substâncias igual a 0,9 g/mL, conforme especificações do fornecedor. Utilizou-se o método de diluição descrito por Aligiannis et al.6 e Lima et al.,7 no qual foram adicionados em tubos de vidro estéril: 0,8 mL do óleo essencial; 0,05 mL de Tween 80 (emulsificante); e 4,2 mL de água destilada estéril. O conjunto foi agitado durante 5 minutos em aparelho agitador de soluções tipo Vortex (Mod. AP56, Phoenix), sendo a concentração final obtida de 16 %, equivalente a 144 mg/mL. Para avaliação da concentração inibitória mínima (CIM), os óleos essenciais e tinturas foram diluídos de forma seriada, mediante emprego da técnica da microdiluição em caldo infuso de cérebro e coração (ICC).
A determinação da CIM (NCCLS, 2013) foi realizada em placas de microdiluição com 96 poços (ALAMAR®, Diadema, São Paulo, Brasil), dispostos em 12 colunas (1 a 12) e 8 linhas (A a H). Em cada um dos poços das placas de microdiluição foram inseridos 100 μL de caldo ICC duplamente concentrado. Em seguida, inseriu-se 100 μL das emulsões dos óleos essenciais e tinturas para obtenção da concentração inicial de 8 % e 10 %, respectivamente, na primeira linha da placa de microdiluição.
Em seguida, realizou-se diluição seriada dos produtos na placa de microdiluição, pela transferência de 100 μL do conteúdo ao poço subsequente, sendo obtidas concentrações de 10 % até 0,0625 %. Para os poços da linha H, foram dispensados 100 μL do conteúdo, de modo a igualar o volume total dos poços. As concentrações (em porcentagem e em mg/mL) dos produtos analisados após a diluição seriada são apresentadas no quadro.
Quadro Diluições seriadas das tinturas e óleos essenciais obtidas pela técnica de avaliação antimicrobiana por microdiluição
| Linhas | Óleo essencial | Tintura | Concentração (%) | Concentração (mg/mL) | Concentração (%) | Concentração (mg/mL) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | 8 | 72,0 | 10 | 90,0 | ||||
| B | 4 | 36,0 | 5 | 45,0 | ||||
| C | 2 | 18,0 | 2,5 | 22,5 | ||||
| D | 1 | 9,0 | 1,25 | 11,25 | ||||
| E | 0,5 | 4,5 | 0,625 | 5,625 | ||||
| F | 0,25 | 2,25 | 0,3125 | 2,8125 | ||||
| G | 0,125 | 1,125 | 0,1562 | 1,4062 | ||||
| H | 0,0625 | 0,5625 | 0,0781 | 0,7031 | ||||
A CIM correspondeu à última diluição dos óleos essenciais na qual não foi verificada a presença de precipitado bacteriano ou turvação no meio de cultura após o período de incubação. O controle positivo utilizado foi a solução de Clorexidina 0,12 %. O meio de cultura adicionado à suspensão bacteriana sem adição dos produtos naturais foi tomado como controle de crescimento; enquanto o controle de esterilidade correspondeu à adição do meio de cultura estéril sem adição de inóculo bacteriano e de produtos avaliados.
Concentração bactericida mínima
A concentração bactericida mínima (CBM) foi obtida por meio do subcultivo, em Agar Müller Hinton, de alíquotas de 10 μL das diluições correspondentes a CIM e duas imediatamente anteriores (2CIM e 4CIM). Após a semeadura dos conteúdos dos poços das placas de microdiluição, as placas de petri foram incubadas em estufa bacteriológica a 37 ºC, por 24 h. A CBM foi considerada a menor concentração da substância que impediu o crescimento visível do subcultivo ou a formação de até três Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
Todos os testes foram realizados em triplicata e os dados analisados descritivamente. Para o screening da atividade antibacteriana foi obtida a média dos halos de inibição através do software Excel®.
RESULTADOS
Os halos de inibição em milímetros para os produtos naturais testados frente às cepas bacterianas são descritos na tabela 1. A tintura Maytenus ilicifolia apresentou resultados discretamente superiores aos demais produtos. Dentre os óleos essenciais, Eucalyptus globulus foi o único OE que apresentou atividade antibacteriana significante para todos os microrganismos estudados, apresentando maior halo de inibição para S. mutans (13,67 ± 3,00).
Tabela 1 Valores das médias e desvio-padrão dos halos de inibição de crescimento provocado pelos produtos naturais analisados sobre as cepas bacterianas em mm
| Produtos naturais |
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|---|---|---|---|
|
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8,83 ± 4,5 | 0 ± 0,00 | 4,5 ± 3,5 |
|
|
13,67 ± 3,00 | 12,67 ± 3,0 | 5,1 ± 0,8 |
|
|
16,0 ± 3,0 | 9,0 ± 1,0 | 0 ±0,00 |
|
|
15,25 ±1,5 | 12,25 ± 1,5 | 12,5 ±2,5 |
|
|
19 ± 2,0 | 13,5 ± 1,0 | 12,3 ± 2,5 |
|
|
15 ± 0,0 | 12 ± 2,0 | 11,3 ± 2,0 |
| Clorexidina (0,12 %) | 20,5 ± 2,12 | 19,5 ± 0,70 | 20,0 ± 0,50 |
Os valores de CIM e CBM são apresentados, respectivamente, nas tabelas 2 e 3. A metodologia para obtenção da CIM foi validada pela ausência de crescimento bacteriano para o controle de esterilidade e controle positivo (Clorexidina 0,12 %), bem como pela presença de crescimento bacteriano para o controle de crescimento. Entre os produtos naturais, destaca-se atividade da tintura de Erythrina mulungu frente S. mutans (CIM= 2,81 mg/mL) e da tintura de Casearia sylvestris frente S. oralis (CIM= 0,7031).
Tabela 2 Concentração inibitória mínima (mg/mL) dos produtos naturais analisados sobre as cepas bacterianas testes
| Produtos naturais |
|
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|---|---|---|---|
|
|
9,00 | 9,00 | 9,00 |
|
|
72,00 | 18,00 | 9,00 |
|
|
72,00 | 72,00 | 72,00 |
|
|
11,25 | 0,7031 | 11,25 |
|
|
11,25 | 5,625 | 11,25 |
|
|
2,812 | 11,25 | 11,25 |
| Clorexidina (0,12 %) | 0,5625 | 0,5625 | 0,5625 |
Tabela 3 Concentração bactericida mínima (mg/mL) dos produtos naturais analisados sobre as cepas bacterianas testes
| Produtos naturais |
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|
|
|
|
9,00 | 9,00 | 9,00 |
|
|
> 72,00 | 18,00 | >72,00 |
|
|
>72,00 | >72,00 | >72,00 |
|
|
>90,00 | 2,8125 | 11,25 |
|
|
>90,00 | 11,25 | 11,25 |
|
|
90,00 | 11,25 | 11,25 |
| Clorexidina (0,12 %) | 0,5625 | 0,5625 | 0,5625 |
A CIM variou de 72 mg/mL a 0,562 mg/mL, e CBM, 18 mg/mL a 2,8125 mg/mL. Apenas Mentha piperita e Erythrina mulungu apresentaram ação frente a todos os microrganismos orais no teste de CBM, e os únicos a mostrarem atividade bactericida frente a S. mutans (tabela 3). A Clorexidina (0,12 %) obteve ação sobre as todas as cepas nas menores concentrações avaliadas para o produto.
DISCUSSÃO
Cerca de 80 % da população brasileira utilizam produtos à base de plantas em seus cuidados com a saúde mediante uso popular, pela indicação de profissionais ou orientada pelos princípios e diretrizes do SUS.2 O incentivo do MS através do RENISUS3 e a maior aceitação de produtos naturais pela população4 tem provocado maior atenção para as pesquisas voltadas à investigação de uso de ervas medicinal na saúde, assim como desenvolvimento de novos fitoterápicos.
Estudos a respeito do tema não são recentes. Há muitos trabalhos sobre a ação de produtos naturais frente a biofilmes orais relatados na literatura.7,8,9,10,11 Segundo Freires et al.,4 88 % desses trabalhos de evidências sobre potencial contra cárie são baseados em estudos in vitro. Apesar de estudos in vitro apresentarem limitações por não representarem fielmente a condição oral, se tornam válidos por assumirem papel de triagem ou funcionarem como estudo preliminar de produtos naturais.
Os extratos vegetais avaliados por este estudo apresentaram ação antimicrobiana frente às linhagens bacterianas utilizadas. Para o teste de difusão em ágar, todas as tinturas mostraram maior ação antibacteriana do que os óleos essenciais. Como a capacidade de difusão das soluções no ágar pode ser um interferente nesse teste, as tinturas podem apresentar esse resultado devido a uma melhor capacidade de difusão no meio.
Curiosamente, as tinturas apresentaram também melhores resultados para CIM e CBM devido às menores concentrações capazes de ação antibacteriana. Contudo, a técnica de microdiluição é mais sensível do que a técnica de difusão em ágar.12) No intuito de diminuir vieses metodológicos nesse teste e nas comparações entre os extratos testados utilizou-se controle positivo, de crescimento e de esterilidade em cada placa de microdiluição.
Para CIM, os extratos apresentaram grande variabilidade de concentração. Mentha piperita foi a que obteve as menores concentrações dentre os OEs. Suas propriedades medicinais e características antimicrobianas são bem estabelecidas na literatura.13,14,15,16Alves et al.15 mostraram CIM frente a bactérias orais inferiores a encontrada no nosso estudo, variando de 1,25 mg/mL a 0,312 mg/mL. A Mentha piperita está presente na composição de cremes dentais comercializados atualmente, conhecidos como dentifrícios herbais.11 E ainda, recentemente, proposta de incorporação de nanopartículas de prata no óleo essencial, com objetivo de maior atividade antimicrobiana, foi desenvolvida com êxito, mostrando alternativa de uso da menta hortelã na odontologia.13
Similarmente, Eucalyptus globulus, Schinus terebinthifolius e Casearia sylvestris também foram investigadas frente a microrganismos orais por outros estudos.15,17,18 Para CIM, os valores do OE de Eucalyptus globulus encontrados por esse estudo frente a S.mutans e S.salivarius foram maiores do que encontrados por outros estudos ambos microrganismos.15,17Goldbeck et al.17 mostraram que o contato de 15 min do OE na concentração de 2 mg/mL foi capaz de induzir a morte de S. mutans. Diferentemente, este estudo não encontrou atividade bactericida do óleo de eucalipto nas concentrações estudadas, com exceção de S. oralis.
Freires et al.,18 encontraram atividade antibacteriana na concentração de 3,125 mg/mL para tintura de Schinus terebinthifolius, no entanto, o presente estudo não verificou atividade bactericida nas concentrações avaliadas e a CIM foi determinada pela maior concentração na diluição seriada. Um bochecho fitoterápico desenvolvido a base de aroeira apresentou, in vivo, potencial de diminuição da inflamação gengival, porém, não reduziu o acúmulo de biofilme.9,10 Assim, vê-se no Schinus terebinthifolius uma alternativa na terapêutica frente a inflamações da cavidade bucal. Tal mecanismo de ação antinflamatória pode estar vinculado a sua capacidade de inibir seletivamente a fosfolipase A2.19
A Casearia sylvestris, por sua vez, pode ser utilizado para mau hálito, tratamento endodôntico20 e em dentifrícios.11 Em estudos pré-clínicos, não foi identificado efeitos tóxicos mesmo quando utilizado por longos períodos de tempo.21 Apresenta atividade antibacteriana frente diferentes linhagens bacterianas gram-positivas e gram-negativas; além de ter demonstrado ação antifúngica.22 No presente trabalho, verificou-se atividade antibacteriana frente as cepas utilizadas. Outros estudos que avaliassem a Casearia sylvestris na formulação de tintura não foram encontrados na literatura.
Nogueira et al.23 avaliando OE de Mentha piperita e Casearia sylvestris, observou que ao alterar a região de coleta das plantas como também o período de coleta, houve diferença na atividade antimicrobianas dos OEs. Para tanto, os autores deste trabalho revigoram a influência do preparo dos produtos naturais na sua atividade antimicrobiana. Sabe-se que fatores como sazonalidade, região geográfica, variabilidade genética, forma de armazenamento e a parte da planta utilizada na extração incidem na quantidade e qualidade de fitoconstituintes ao final dos extratos.4,24 Os produtos analisados nesse estudo foram obtidos comercialmente e não houve controle desses fatores o que pode ter levado a resultados desconformes e, até inferiores, daqueles encontrado na literatura.
Diferentemente das ervas descritas acima, as plantas Maytenus ilicifolia e Erythrina mulungu não foram investigadas para bactérias de biofilmes orais. Elas apresentam utilizações diversas. A espinheira santa tem ação analgésicas, cicatrizantes, diuréticas e laxativas, apresentando ação antibacteriana frente a gram-positivas e antifúngica. É usada principalmente em problemas gástricos e combate a Helicobacter pylori.25 Já o Mulungu apresenta ação sedativa e hipotensiva,26 porém não há trabalhos que investigaram sua ação contra microrganismos da cavidade bucal. Devido à ação sedativa, pode ser utilizada para inflamações orais. O presente estudo mostrou ação bactericida e bacteriostática do mulungu, o que pode está vinculada a presença de grande quantidade de fenóis e taninos encontrada através da prospecção fitoquímica de suas folhas no estudo de Bona et al.26 Essas substâncias estão intimamente ligadas ao potencial antimicrobiano de plantas.27 Não foram encontrados estudos com Maytenus ilicifolia e Erythrina mulungu sob forma de tinturas.
Foi Erythrina mulungu e a Menta piperita, as únicas a mostrarem atividade bacteriana frente a S. mutans na concentração estudada e, para tanto, podem ser denominadas como potencial de uso para combate ao biofilme cariogêncio, já que, é o S. mutans, o microrganismo considerado como o principal e resistente constituinte de biofilmes cariogênicos.28
Observa-se na literatura uma tendência de uso de óleos essenciais a tinturas em estudos antimicrobianos. Ainda, alguns trabalhos mostram as tinturas como produtos naturais que apresentam concentração de princípios ativos inferiores aos óleos essenciais.29 A extração de drogas vegetais para tinturas ocorre por meio de preparação alcoólica ou hidroalcoólica,30 o que leva ao maior teor de álcool encontrado nessas formulações. Visto isso, os autores supõem que haja ação do álcool das tinturas na maior atividade antimicrobiana encontrada nesse estudo e em outro31 quando comparados a atividade dos óleos essenciais. O teor de álcool também deve ser levado em consideração, quando pensado em formulações para uso intra-oral tais como bochecho, sendo necessária avaliação de efeitos colaterais na mucosa oral.
Vê-se que as plantas medicinais tem potencial de uso odontológico, e por isso devem ser tomadas como alternativas nas terapêuticas no consultório. Para tanto, os CDs precisam conhecer as propriedades e ações dos produtos naturais frente a condições orais e acompanhar o desenvolvimento de novos produtos fitoterápicos.32) Tornar disponíveis plantas medicinais e/ou produtos a base de ervas medicinais nas Unidades de Saúde da Família é significativo, pois estabelece novas opções de tratamento eficazes, seguras, de amplo acesso e baixo custo à população.
Os produtos naturais contidos na lista de ervas medicinais para uso no SUS avaliados por este trabalho apresentaram atividade antimicrobiana frente a microrganismos orais. De forma geral as tinturas apresentaram melhor ação antibacteriana do que os óleos essenciais destacando Erythrina mulungu no grupo das tinturas e Mentha piperita para OEs. Outros estudos in vitro, no entanto, devem ser realizados para melhor comprovação da ação antibacteriana considerando situações microbiológicas como biofilmes multiespécies, desafios de dieta e pH, entre outros fatores que mimetizem a cavidade oral. Avaliações toxicológicas e clínicas são, também, etapas importantes para verificar a viabilidade de uso das plantas medicinais na odontologia.
As plantas medicinais avaliadas e pertencentes à lista divulgada pelo MS para uso no SUS apresentaram atividade antimicrobiana frente a microrganismos orais e potencial para uso na odontologia. A Mentha piperita e Erythrina mulungu merecem destaque por apresentarem as menores CIM e CBM, além de serem as únicas a mostrarem atividade bactericida a todas as cepas bacterianas avaliadas.
