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INTRODUCCIÓN
Las plantas indeseables, entre las que se consideran muchas especies herbáceas, aportan múltiples beneficios pues, entre otros, desempeñan servicios vitales para los ecosistemas como la protección y restauración de suelos expuestos o degradados 1. A pesar de todas las ventajas que estas ofrecen para los seres humanos y la agricultura, la mayor atención sigue dirigida hacia sus impactos negativos. En la agricultura, son motivo de preocupación porque compiten con los cultivos por factores de crecimiento como agua, luz, nutrientes, espacio y quizás bajo ciertas condiciones, dióxido de carbono (esencial para la fotosíntesis). La injerencia de estas plantas afecta los rendimientos agrícolas y aumentan los costos de las operaciones agrotécnicas y del procesamiento de las cosechas 2.
Por esta razón, las prácticas agrícolas están directamente relacionadas con el uso de herbicidas y otros plaguicidas con el objetivo de controlar las plagas que atacan a los cultivos y de esta forma aumentar la productividad de alimentos. Sin embargo, la contaminación ambiental originada por estos plaguicidas constituye un problema de gran importancia a escala global, debido a los diferentes niveles de persistencia de estos compuestos en el ambiente, así como a la toxicidad ejercida sobre los animales domésticos, aves, peces, insectos y otros representantes de la vida salvaje 3.
Entre los herbicidas más empleados se encuentran los fenoxiherbicidas, como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) o el ácido 4-cloro-2-metilfenoxiacético (MCPA). La degradación de estos compuestos conduce a la formación de fenoles (fenol, 2-clorofenol y 2,4-diclorofenol) y catecoles (catecol y 4,6-diclorocatecol). La biotransformación del ácido 4-clorofenoxiacético conduce a la formación de 4-clorofenol y la fotodegradación del Declorprop (ácido 2,4 diclorofenoxi-2-propiónico) y del 2,4-D originan la formación de 2-clorofenol, 4-clorofenol y 2,4-diclorofenol. Estos compuestos son considerados peligrosos por las regulaciones de las agencias de protección ambiental 4.
Por otra parte, la agricultura también demanda la utilización de fertilizantes, así como de estimulantes del crecimiento, para incrementar las producciones agrícolas ante condiciones, cada día más acentuadas, de baja fertilidad de los suelos y factores de estrés abiótico. Entre los últimos destacan la sequía, la salinidad y la contaminación del aire y suelo debido a presencia de metales pesados y plaguicidas, los que actúan como principales factores limitantes en la producción de los cultivos, debido a que afectan todas las funciones de las plantas.
El uso de las bacterias promotoras de crecimiento vegetal para reducir el uso de compuestos químicos en la agricultura adquiere cada vez mayor relevancia en el contexto internacional como vía para garantizar la calidad ambiental y de los alimentos. En la actualidad se llevan a cabo múltiples esfuerzos para la explotación comercial de estas bacterias como bioinoculantes para varios cultivos de importancia económica 5,6.
Al mismo tiempo, el uso de microorganismos para eliminar xenobióticos y compuestos orgánicos persistentes es considerado un proceso amigable con el ecosistema. La actividad microbiana en la vecindad de las raíces (rizosfera) ofrece un ambiente favorable para el cometabolismo de los compuestos químicos recalcitrantes, muchos de los cuales, debido a su naturaleza, no pueden ser tomados directamente por las plantas. Se ha informado por varios investigadores, que las bacterias que habitan en la rizosfera de las plantas que crecen en terrenos contaminados tienen más probabilidades de degradar compuestos tóxicos, constituyendo una fuente potencial de bacterias tolerantes a los compuestos presentes en dicho ambiente y con capacidad para metabolizarlos 7,8.
La rizosfera de muchas plantas de cultivo ha sido estudiada con el objetivo de obtener bacterias que sean promotoras de crecimiento vegetal y degradadoras de compuestos xenobióticos 9; sin embargo, las plantas herbáceas indeseables han sido largamente ignoradas 10. Cada vez son más las investigaciones donde se exploran las plantas herbáceas como fuentes de bacterias promotoras del crecimiento vegetal, debido a la amplia biodiversidad que ellas pueden mostrar 6. Si a ello se une que muchas de sus especies son capaces de crecer en ambientes contaminados 11-13, entonces estas también podrían ser aprovechadas para el aislamiento de bacterias que reúnan ambas capacidades.
Este trabajo se planteó como objetivo aislar bacterias rizosféricas de plantas herbáceas crecidas en sitios contaminados con compuestos fenólicos, capaces de exhibir características promotoras del crecimiento vegetal y de utilizar compuestos fenólicos como única fuente de carbono.
MATERIALES Y MÉTODOS
Aislamiento de rizobacterias a partir de plantas que viven en suelos contaminados
Se colectaron ejemplares de tres especies vegetales que crecen en el área de Movimiento y Almacenaje de Productos (MAP) en la Refinería Hermanos Díaz, de la Provincia Santiago de Cuba. Esta es un área de 56 m2, contaminada con hidrocarburos y compuestos fenólicos caracterizada por la presencia de un suelo arenoso (76,7 % de arena, 6,9 % de grava y 16,4 % de arcilla), con pH 7,2 y 24,7 % de capacidad de campo, cuya composición en fosfato y nitrato es de 5,60 x 10-2 y 3,82 mg g-1 de suelo, respectivamente 14. Se tomaron muestras de las plantas herbáceas Cyperus rotundus L, Scleria sp. y Cynodon dactylon (L).
Las plantas se extrajeron, preservando la tierra que las rodeaba y cuidando tomar toda la raiz, sin que esta sufriera afectación y depositadas en bolsas plásticas para su traslado.
Las rizobacterias se aislaron de acuerdo a la metodología descrita por Woyessa y Assefa 15. Para ello se removió cuidadosamente el suelo de las raíces y entonces estas fueron lavadas con agua destilada estéril para remover tantas bacterias como fuera posible. Se mezclaron por agitación 10 g del suelo de rizosfera de cada planta con 90 mL del agua de lavado de las raíces de la propia planta. Se realizaron diluciones seriadas de las suspensiones obtenidas de cada planta, utilizando MgSO4·7 H2O 0,01 mol L-1. Posteriormente, 0,1 mL de cada suspensión, así como de las correspondientes diluciones, fue sembrado por diseminación en placas con agar nutriente. Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 h. Se seleccionaron colonias representativas de todos los tipos morfológicos, las cuales fueron subcultivadas en medio agar nutriente para su purificación. Los aislados obtenidos se purificaron mediante resiembras sucesivas en placas con agar nutriente y se conservaron en cuñas de este mismo medio a 4 ºC.
Evaluación de la presencia de características de promotoras de crecimiento vegetal en las bacterias aisladas
La evaluación se realizó atendiendo a la presencia o no de las siguientes características:
Producción de ácidos orgánicos, acetoína y ácido indolacético
Fijación de nitrógeno atmosférico
Solubilización del fosfato de calcio.
La producción de ácidos orgánicos se evaluó por el método colorimétrico de Cunningham y Kuiack 16, adicionando el indicador alizarina roja al 0,1 % a cultivos bacterianos crecidos durante 5 días en medio sacarosa-triptona (ST). El cambio de color de rosado a amarillo indicó respuesta positiva.
La producción de acetoína se detectó inoculando las bacterias en medio Voges-Proskauer. Luego de 48 h de incubación se indujo una respuesta colorimétrica acorde a Romick y Fleming 17, tomando como respuesta positiva la aparición de una coloración rosa-rojiza.
El ensayo para detectar las bacterias que solubilizan el fosfato fue desarrollado acorde a Nautiyal 18. La presencia de un halo claro alrededor de las colonias indica capacidad solubilizadora de fosfato.
Para evaluar la capacidad de producir ácido indolacético (AIA) se utilizó el ensayo de Salkowsky (adaptado de Patten y Glick) 19. Las bacterias se inocularon en 1 mL de medio 869 1/10 suplementado con 0,5 g L-1 de triptófano. Después de incubar durante 4 días se indujo una reacción colorimétrica adicionando el reactivo de Salkowsky (Gordon y Weber) 20. Se tomó como positividad la aparición de un color rosa.
La capacidad de fijar el nitrógeno se evaluó por el método descrito por Xie y col 21. Las bacterias aisladas se cultivaron en el medio-N suplementado con bromotimol azul (con y sin NH4Cl como fuente de nitrógeno) e incubado durante dos semanas a 30 °C. El cambio de color de azul a amarillo se tomó como respuesta positiva a la prueba.
Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Crecimiento en medio mineral con clorofenol como única fuente de carbono
Se utilizaron los siguientes compuestos clorofenólicos grado analítico: 4-clorofenol (Merck), 2,4-diclorofenol (SIGMA-ALDRICH), Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (SIGMA-ALDRICH).
Para seleccionar los aislados bacterianos capaces de crecer en presencia de clorofenoles como única fuente de carbono se utilizó un medio mineral libre de cloro (MMS), consistente en Buffer fosfato 0,02 mol L-1 (KH2PO4, Na2HPO4, pH 7,2), 0,5 g L-1 de (NH4)2SO4 y 0,2 g L-1 de MgSO4(7H2O en agua destilada, suplementado con 10 mL de una solución de elementos traza compuesta de (en mgL-1): Ca(NO3)2 .4H2O, 600; FeSO4 .7H2O, 200; MnSO4 .4H2O, 20; CuSO4 .5H2O, 40; ZnSO4.7H2O, 20; H3BO3, 3; NaMoO4 .2H2O, 4 y acidificada con 1 mL de ácido sulfúrico concentrado L-1. Al medio se adicionó agar (1,5 g L-1), el indicador bromotimol azul (0,04 g L-1), así como el herbicida clorofenólico 2,4-D (0,2 g L-1). Los aislados que fueron capaces de crecer y producir cambios de coloración en la colonia o en el medio de azul a amarillo fueron declarados como positivos al ensayo de degradación 22.
Los aislados que resultaron positivos al ensayo se sembraron entonces en placas conteniendo el mismo medio de cultivo, pero sustituyendo el 2,4-D por 4-clorofenol o 2,4-diclorofenol como únicas fuentes de carbono, ambos a una concentración de 0,02 g L-1. Las placas se incubaron a 30 °C durante 5 días para evaluar el crecimiento. Se emplearon como controles placas de los medios que no fueron inoculados. Los ensayos fueron realizados por duplicado.
Las bacterias que fueron capaces de crecer en presencia de ambos clorofenoles se consideraron con capacidad de degradar los compuestos fenólicos ensayados 9 y se seleccionaron para los estudios posteriores.
Ensayos de evaluación de la capacidad degradadora del 2,4-diclorofenol de los aislados de rizosfera seleccionados
Preparación de los inóculos bacterianos
Los aislados bacterianos seleccionados se inocularon en 10 mL de caldo nutriente. Se incubaron durante 72 h a 33 °C en agitación. La biomasa se separó por centrifugación y se lavó dos veces con MgSO4. 7H2O 0,01 mol L-1.
Biodegradación de 2,4-diclorofenol
La biodegradación fue desarrollada en agua destilada utilizando 5 % de biomasa húmeda, 0,2 g L-1 del clorofenol y un volumen de reacción de 2 mL. La reacción se desarrolló en agitación a 30 °C, durante 24 h. Se llevó en paralelo un ensayo control sin biomasa 23. Al sobrenadante se realizaron los análisis de fenoles y cloruro. La cuantificación de los clorofenoles se realizó mediante el método colorimétrico de la 4-aminoantipirina, según la modificación de Farrell y Quilty 24 del procedimiento descrito en el Standard Methods for the Determination of Water and Wastewater 25, en tanto la concentración de cloruro se analizó colorimétricamente según Jörg y Bertau 26. El porciento de degradación de los clorofenoles fue determinado acorde a la ecuación.
Donde Ci fue la concentración inicial del compuesto y Cf la concentración final. El cloruro se cuantificó por la ecuación de la recta de la curva patrón de cloruro de sodio (0,003-0,1 g L-1).
Análisis estadístico
El análisis estadístico de los datos experimentales fue realizado usando el programa Statgraphics Centurion XV. Se realizó un análisis de clasificación simple (ANOVA I) y la prueba de rangos múltiples basada en el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher para la comparación de medias. En todos los casos se utilizó 5 % de significación. Estas pruebas se utilizaron para comparar la degradación del clorofenol y la liberación de cloruro entre los aislados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La colecta de las plantas se realizó en un área localizada en la refinería de petróleo caracterizada por la contaminación del suelo con crudo y compuestos fenólicos, derivados del proceso de refinación.
En el terreno se observó abundancia de plantas herbáceas y algunos ejemplares arbustivos. Las herbáceas recolectadas pertenecieron a la Familia Cyperaceae: Cyperus rotundus L y Scleria sp y a la Familia Poaceae: Cynodon dactylon (L), todas de la Clase Monocotyledonea.
C. dactylon (bermuda grass o grama común) y C. rotundus (corocillo o coquito) son dos herbáceas que están consideradas como plagas invasoras de muchos cultivos, con efectos alelopáticos debido a la liberación al suelo de múltiples compuestos aleloquímicos que afectan el desarrollo de las plantas vecinas 27,28.
Estas plantas han sido referenciadas por algunos autores como especies que crecen en suelos contaminados con hidrocarburos y que pueden degradar el petróleo y el diésel 29,30. Sarathambal e Ilamurugu las utilizaron como fuente de rizobacterias fijadoras de nitrógeno y solubilizadoras de fosfato 5.
Otros autores 31,32 describieron a C. dactylon como útil para la rehabilitación de suelos explotados por la minería y suelos contaminados con metales pesados.
El procedimiento de rizobacterias seguido permitió el aislamiento de 51 bacterias, encontrándose el mayor número de aislados en las plantas herbáceas C. rotundus y Scleria sp. (Tabla 1)
Tabla 1 Distribución de rizobacterias según la fuente de aislamiento
| Plantas | Cantidad de bacterias aisladas |
|---|---|
| 20 | |
| 17 | |
| 14 | |
| Total | 51 |
Características de promotoras de crecimiento vegetal de las rizobacterias aisladas.
En la Tabla 2 se muestra un resumen de las rizobacterias aisladas de cada planta que presentaron más de una característica de promotora del crecimiento vegetal. Como puede observarse, la aparición de estas características estuvo marcadamente influenciada por el origen de las bacterias, o sea, por la planta de la cual procedían. Este hallazgo sugiere que la especie vegetal influye en la colonización diferencial de la rizosfera por determinados grupos bacterianos, aun cuando estas especies vegetales crezcan en el mismo entorno.
Tabla 2 Características de promotoras del crecimiento vegetal en las rizobacterias aisladas de plantas crecidas en suelos contaminados con hidrocarburos
| Aislados | Producción Acetoína | Producción de ácidos orgánicos | Solubilización de fosfato | Fijación de nitrógeno | Producción de AIA | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| RR-42 | - | + | + | - | + | |
| RR-45 | - | + | + | - | - | |
| RR-47 | + | - | + | - | - | |
| RR48 | - | + | + | - | - | |
| RR-50 | - | + | + | - | - | |
| RR-51 | - | + | + | - | - | |
| RR-52 | - | + | + | - | - | |
| RR-53 | - | + | + | - | - | |
| RR-54 | - | + | + | - | - | |
| RR-56 | - | + | + | - | + | |
| RR-102 | - | + | + | - | + | |
| RR-62 | - | + | + | - | - | |
| RR-63 | - | + | + | - | - | |
| RR-64 | - | + | + | - | - | |
| RR-69 | - | + | + | - | - | |
| RR-72 | - | + | + | - | + | |
| RR-75 | - | + | + | - | - | |
| RR-76 | - | + | + | - | - | |
| RR-79 | - | + | + | - | + | |
| RR-81 | - | + | + | + | + | |
| RR-84 | - | + | + | + | + | |
| RR-85 | - | + | + | - | + | |
| RR-86 | + | + | - | - | - | |
| RR-87 | + | + | - | - | - | |
| RR-88 | + | + | - | - | - |
Al comparar, para cada especie de planta, los porcentajes de aislados que presentaron características de promotoras del crecimiento, se encontró que C. rotundus aportó 5 % de aislados capaces de producir acetoína y ácido indolacético, 65 % con capacidad de producir ácidos orgánicos y 60 % de solubilizadores de fosfatos. En Scleria sp. se observó 71 % de aislados productores de ácidos orgánicos y 53 % de solubilizadores de fosfato, así como 6 % de productores de ácido indolacético; no se aislaron fijadores de nitrógeno ni productores de acetoína. Se observó que 36 % de los aislados obtenidos de C. dactylon solubilizaron fosfatos; sin embargo, el 100 % produjo ácidos orgánicos, en tanto cuatro aislados produjeron ácido indolacético y dos fueron capaces de fijar nitrógeno atmosférico, siendo así mismo la planta que más aportó aislados productores de acetoína (21 %).
Otros autores plantearon que las interacciones entre las plantas y los microorganismos del suelo son altamente dinámicas en la naturaleza y están basadas en presiones co-evolutivas, por lo que no es asombroso encontrar que la comunidad microbiana en la rizosfera difiera entre especies vegetales, entre genotipos dentro de las especies, e incluso entre diferentes etapas del desarrollo de las plantas 33.
Se encontró que la capacidad de fijar nitrógeno y producir acetoína fueron las menos frecuentes, en tanto la característica predominante fue la de producir ácidos orgánicos, al obtenerse entre tres y cuatro aislados con las primeras características y 39 bacterias productoras de ácidos orgánicos.
Varios autores han planteado que los ácidos orgánicos producidos por las bacterias solubilizadoras de fosfato no son determinantes en la solubilización y que el único factor determinante es la concentración de iones hidronio (H3O+), los que se producen en la respiración o como consecuencia de la asimilación de iones amonio (NH4 +), lo cual altera el pH del medio, lo suficiente como para movilizar minerales del suelo 34,35.
En este trabajo se evaluaron las capacidades de producir ácidos orgánicos y solubilizar el fósforo inorgánico insoluble, encontrándose que ambas características eran independientes en algunas de las bacterias aisladas, lo cual sugiere la existencia de varios mecanismos de solubilización. Nahas apoyó que existían varios mecanismos, los cuales incluían no solo la excreción de ácidos orgánicos, sino además la extrusión de protones o la producción de agentes quelantes 36. Otros mecanismos, como la producción de ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico, ácido nítrico o ácido carbónico han sido mencionados por otros autores 37.
La literatura revisada recoge datos del aislamiento de bacterias promotoras del crecimiento vegetal de rizosfera de plantas valiosas para la economía, como son algodón, trigo, maíz 38 y arroz 39. A pesar de ello, cada vez son más los trabajos donde se exploran otras plantas herbáceas como fuente de rizobacterias con características de promotoras, debido a la amplia diversidad bacteriana que pueden mostrar 5,10. Esta investigación se convierte en otro aporte a la utilización de estas plantas como fuentes de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Los nuevos aislados, portadores de estas valiosas cualidades, pudieran ser empleados en suelos deficientes de nutrimentos para mitigar el estrés y lograr la sostenibilidad de los cultivos 5.
Las plantas indeseables pueden ser dañinas para los cultivos, debido a que muchas de ellas producen sustancias tóxicas que inhiben el desarrollo de los cultivos (alelopatia) o compiten con estos por luz, espacio y nutrientes. Por otro lado, cuando crecen donde no afecten los cultivos o durante la rotación de estos, se pueden aprovechar muchas de las propiedades beneficiosas que ellas ofrecen como son protección del suelo de la erosión, restauración de la biodiversidad, absorción, conservación y reciclaje de nutrientes solubles, que de otra manera se filtrarían por el suelo, así como la restauración de los suelos expuestos o degradados 1. Algunas plantas herbáceas toleran compuestos y elementos tóxicos e incluso los degradan o acumulan en su interior, lo cual constituye otro aspecto de gran valor a favor de estas plantas, aspecto corroborado al aislar plantas de ambientes contaminados con hidrocarburos y compuestos fenólicos.
Debido a la utilizacion de compuestos químicos como plaguicidas muchas veces queda una concentración residual o se producen intermediarios más tóxicos durante su degradación, por lo que se genera una contaminación en los terrenos donde estos compuestos son utilizados. Algunos plaguicidas contienen metales pesados en su estructura (hexacloruro de cobre), los cuales tienden a acumularse en el suelo o en las plantas. Esta contaminación puede diseminarse hacia las aguas superficiales y las subterráneas, trasladando la contaminación hacia otros ecosistemas más sensibles o son atrapados en las particulas del suelo dificultando su eliminación. Estos contaminantes pueden permanecer en los ecosistemas aún cuando se haya abandonado su uso, pudiendo acumularse en los organismos vivos y concentrar su efecto tóxico en la cadena alimenticia causando daños no solo a las especies blanco sino además a otras especies beneficiosas como abejas, peces, microorganismos del suelo, así como al hombre 40.
Todo lo antes expuesto avala las perspectivas enormes que ofrecen estas plantas para posibles estrategias de biorremediación de suelos agrícolas, contribuyendo no solo como reservorio de bacterias estimuladoras del crecimiento vegetal, sino también por sus propias implicaciones en procesos de remoción de contaminantes.
Capacidad de las rizobacterias de crecer en medio mineral con clorofenoles como única fuente de carbono
Para determinar la habilidad de las bacterias rizosféricas aisladas de crecer en diferentes compuestos clorofenólicos y seleccionar las de mejor comportamiento ante todos los compuestos ensayados, se realizó un ensayo de crecimiento utilizando ácido 2,4-D como única fuente de carbono y energía (Tabla 3). De los 51 aislados ensayados, 92 % mostró capacidad de crecer en 2,4-D, sugiriendo que pueden degradar este compuesto para utilizarlo como fuente de carbono para la biosíntesis del material celular.
Tabla 3 Crecimiento en clorofenoles de las rizobacterias aisladas
| 2,4-D (0,2g L-1) | 2,4-DCF (0,02g L-1) | 4-CF (0,02g L-1) | 2,4-DCF y 4-CF (0,02g L-1) | |
|---|---|---|---|---|
| 17 (85) | 8 (40) | 5 (25) | 3 (15) | |
| 16 (94) | 14 (82) | 12 (71) | 11 (65) | |
| 14 (100) | 10 (71) | 10 (71) | 9 (64) | |
| Total | 47 (92) | 32 (63) | 27 (53) | 23 (45) |
Entre paréntesis se encuentran los porcientos respecto al total en cada planta
Muchos compuestos fenólicos son exudados por las raíces de las plantas. Los microorganismos capaces de usar estos compuestos fenólicos como fuente de carbono, frecuentemente tienen las enzimas que pueden co-metabolizar contaminantes con similar estructura 41. Muchos de estos compuestos como naringina, miricetina, catequina y otros, son liberados por las raíces de las plantas y se ha mostrado que estimulan el crecimiento de bacterias degradadoras de bifenilos policlorados (PCB). Algunos autores han mostrado que el exudado de terpenos (ej. α-pineno, α-terpineno, entre otros) pueden actuar sobre la actividad de la enzima bifenil dioxigenasa en las bacterias degradadoras de PCB, activándola o inhibiéndola 42.
La literatura plantea que existen dos rutas por la cual puede degradarse el 2,4-D. La primera ruta involucra a la alfa-cetoglutarato dioxigenasa para dar lugar al 2,4-diclorofenol, mientras que la otra ruta comienza activando una dehalogenasa para formar el 4-clorofenoxiacetato, el cual se transforma en 4-clorofenol 43. Este conocimiento indica la necesidad de explorar si las bacterias que sean capaces de crecer en 2,4-D son capaces a su vez de utilizar alguno o ambos de los dos intermediarios principales de estas rutas: el 2,4-diclorofenol y el 4-clorofenol.
El hallazgo de bacterias que pueden crecer en ambos compuestos sugiere que esas bacterias pueden degradar cualquiera de ellos sin que resulte inhibitorio para su crecimiento (Tabla 3). Este resultado significa que estas bacterias pueden ser empleadas para remediar suelos que pudieran estar contaminados incluso con ambos compuestos.
El número y clase de bacterias que se encuentran en diferentes suelos puede estar influenciado por las condiciones del mismo, incluyendo la temperatura, humedad y presencia de compuestos inorgánicos (sales) y orgánicos, así como por el número y el tipo de planta que en ellos crece.
Los resultados evidenciaron que Scleria sp y C. dactylon fueron las que más aportaron en aislados de rizosferas con capacidad de utilizar los clorofenoles. Lo encontrado coincide con lo planteado por otros autores 44, al ofrecer evidencias de que las especies de plantas preparan a la comunidad bacteriana del suelo y que sus exudados seleccionan a las bacterias que conviven en sus raíces a partir de la comunidad del suelo en su totalidad.
Acorde a los resultados obtenidos se escogieron aquellas bacterias que eran capaces de crecer en los clorofenoles ensayados y, además, presentaban varias características que promovieran el crecimiento vegetal, siendo seleccionados ocho aislados.
Bacterias capaces de reunir ambas características buscadas (crecimiento en presencia de plaguicidas y propiedades de promotoras de crecimiento vegetal) han sido descritas por varios autores (35,45), siendo los compuestos más mencionados el 2,4-D, pentaclorofenol, triclorofenol y 4-clorofenol, pero no se han encontrado hasta el momento referencias sobre la degradación de 2,4-diclorofenol por rizobacterias. No obstante, Ahemad y Saghir referenciaron la tolerancia de rizobacterias aisladas por ellos a fungicidas y herbicidas en cuya estructura química estaban el 4-clorofenol y 2,4-diclorofenol 9.
Degradación de compuestos clorofenólicos por las rizobacterias seleccionadas
Al evaluar la degradación del 2,4-DCF (0,2 g L-1), el principal intermediario de la degradación del herbicida 2,4-D, por rizobacterias seleccionadas se corroboró la capacidad degradadora sugerida al crecer en este compuesto como única fuente de carbono (Tabla 4). Los resultados obtenidos mostraron que el aislado RR72 es el que presentó las mejores características. La aparición de cloruro libre confirmó la degradación del clorofenol.
Tabla 4 Examen de los aislados para la degradación del 2,4-diclorofenol
| Aislados | Biodegradación (%) |
|---|---|
| RR56 | 22 |
| RR62 | 22 |
| RR72 | 40 |
| RR79 | 18 |
| RR81 | 22 |
| RR84 | 15 |
| RR88 | 19 |
| RR102 | 6 |
Para p<0,05, letras diferentes evidencian diferencias significativas
Otros autores encontraron una degradación de 15 % a las 24 h y entre 70-85 % a los 7 días cuando ensayaron este compuesto a igual concentración (0,2 g L-1) 46, atribuyendo a la toxicidad del compuesto y de la dosis empleada el comportamiento de la bacteria pues referenciaron hasta 98 % de degradación para concentraciones menores de 0,1 g L-1. Los resultados mostraron que el procedimiento empleado fue capaz de evaluar de una manera rápida la capacidad de degradar de los microorganismos de interés, lo que permite su empleo como método de cribado dirigido a la selección de bacterias con alta capacidad de degradación de clorofenoles.
Hasta la fecha, no existen reportes de rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal aisladas de especies de Scleria, por lo que los resultados obtenidos serían la primera comunicación sobre este hallazgo. De igual modo, no se tienen antecedentes de rizobacterias aisladas de Scleria, C. rotundus y C. dactylon que crezcan utilizando 4-clorofenol, 2,4-diclorofenol y 2,4-D como únicas fuentes de carbono.
CONCLUSIONES
Se obtuvieron 51 aislados de la rizosfera de tres plantas herbáceas crecidas en suelos contaminados con compuestos fenólicos e hidrocarburos, lo que evidencia la utilidad práctica de estas plantas como fuente de bacterias con características promisorias para usos de biorremediación de suelos.
La herbácea C. dactylon aportó la mayor cantidad de aislados productores de acetoína y de ácidos orgánicos, así como bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico, características deseadas para formular los biofertilizantes.
El 92 % de los aislados bacterianos creció en presencia del herbicida 2,4-D como única fuente de carbono lo cual sugiere su capacidad para degradarlo.
Las herbáceas Scleria sp. y C. dactylon aportaron la mayor proporción de aislados rizosféricos capaces de utilizar los clorofenoles intermediarios de la degradación del 2,4-D (2,4-DCF y 4-CF) como única fuente de carbono.
De las ocho bacterias seleccionadas siete mostraron capacidad de degradar el 2,4-DCF, principal intermediario de la degradación del 2,4-D y materia prima para su obtención.
RECOMEDACIONES
A partir de los resultados alcanzados en este trabajo, se recomienda evaluar la capacidad de los aislados obtenidos como estimuladores del crecimiento vegetal. Estos aislados también podrán ser empleados para mitigar el estrés causado a los cultivos por la deficiencia de nutrientes, así como en la sustitución de fertilizantes químicos.
Evaluar las capacidades de estos aislados para la descontaminación de suelos tratados con el herbicida 2,4-D u otros plaguicidas de base fenólica.
