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Introducción
Una de las primeras causas de muerte en el mundo desde el año 2020 es la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), causada por el Síndrome respiratorio agudo severo asociado a coronavirus de tipo 2 (SARS-CoV-2), por tanto, la detección rápida y precisa de este virus es crucial para mitigar su propagación en la población.1,2 La prueba de oro, para su detección, es la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).3 Sin embargo, los esfuerzos recientes en el diagnóstico se han centrado en el desarrollado de pruebas rápidas, sensibles y específicas, debido al bajo costo de estos métodos y a la rapidez para brindar un diagnóstico primario en el punto de atención médica fuera del laboratorio.4
La inmunocromatografía e inmunofluorescencia constituyen los principios moleculares de algunos de los ensayos de detección de antígenos virales.5 La principal ventaja de este tipo de pruebas, es que se obtiene un resultado inmediato y a un coste mucho más reducido, en comparación con la RT-PCR. Sin embargo, presentan como limitación importante, que son menos precisas que la técnica estándar, al requerir de mayor carga viral para resultar positivas.6
Cuba, en el contexto de la pandemia de COVID-19, ha realizado grandes esfuerzos para contar con métodos de diagnóstico que permitan realizar la detección de los casos, su seguimiento y el monitoreo de las medidas de control en el país. El contar con métodos rápidos y económicos ha sido una prioridad y es por ello que en este trabajo se evalúa el desempeño de cinco estuches de detección de Ag SARS-CoV-2.
Métodos
Se utilizaron muestras correspondientes a individuos hospitalizados o internados en centros de aislamiento en varios municipios de La Habana y Pinar del Río, con resultados negativos y positivos a la infección por SARS-CoV-2, confirmados mediante la RT-PCR, así como muestras de otras infecciones virales no SARS-CoV-2. A los individuos en estudio se les tomaron muestras de exudado nasal y nasofaríngeo para la confirmación por RT-PCR como técnica de referencia y para el estudio de los ensayos de detección de antígenos (tabla 1).
Tabla 1 Características de los ensayos a evaluar
| Tipo de ensayo | Producto/Nombre | Casa comercial | País |
|---|---|---|---|
| Ensayos inmunocromatográficos |
|
ABBOTT | Alemania |
| CPM - Compagnia per la Medicina S.R.L. | Italia | ||
| CORE Technology Co. LTD | China | ||
| KEWEI - Beijing Kewei Clinical Diagnostic Reagent INC. | China | ||
| Ensayo de inmunofluorescencia | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co. Ltd | Alemania |
Para la evaluación de los ensayos de Ag ABBOTT, CORE y KEWEI la recolección de las muestras se hizo con los insumos de cada estuche. Para el estudio de los sistemas CPM y WANTAI SARS-CoV-2 (IFA) se utilizaron medios de transporte viral (BTV, BIOCEN, Cuba y CITOSWAB VTM, China), para el traslado de las muestras y su procesamiento en el laboratorio. Este trabajo fue desarrollado en el mes de noviembre de 2020 y en el período comprendido entre febrero y junio de 2021.
Para la realización de la RT-PCR se utilizaron los estuches RIDA®GENE SARS-CoV-2 (R-Biopharm, Alemania) y SENTINEL DIAGNOSTICS (Milán, Italia), siguiendo el protocolo descrito por los fabricantes. La RT-PCR se realizó en el Laboratorio Nacional de Referencia del Instituto Pedro Kourí (IPK).
Se estudiaron 587 muestras que se describen a continuación:
Panel de muestras negativas al SARS-CoV-2 mediante RT-PCR: 229 muestras para estudio de especificidad clínica, procedentes del diagnóstico del IPK.
Panel de muestras positivas al SARS-CoV-2 mediante RT-PCR: 358 muestras de pacientes/individuos pertenecientes a diferentes criterios clínico-epidemiológicos y de laboratorio (Contactos, Sospechosos, Evolutivos, Vigilancia y muestras de Confirmación).
Análisis estadístico
Se utilizaron métodos estadísticos según la Regulación no. 47-2007 Requisitos para la evaluación del desempeño de los diagnosticadores del Centro para el Control Estatal de Medicamentos, Equipos y Dispositivos Médicos (CECMED).12 Se calcularon los valores de sensibilidad clínica, especificidad clínica y analítica, prueba de concordancia, índice de Kappa y valores predictivos positivo y negativo (VPP y VPN), utilizando todas las muestras y estratificándolas según criterios clínico-epidemiológicos y de laboratorio (casos sospechosos, evolutivos y muestras con Ct<30).
Para el cálculo de los parámetros se utilizó la aplicación LabCal V1.0.13 Los resultados obtenidos se redondearon a dos cifras significativas y no se utilizaron cifras decimales. A todos estos parámetros se les calculó el intervalo de confianza al 95 % (IC 95 %).
Consideraciones éticas
La presente investigación fue parte de la validación de los ensayos diagnósticos recibidos en el IPK antes de su introducción en el Sistema de Salud. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de las Investigaciones del IPK en cumplimiento de la Declaración de Helsinki (CEI-IPK 65-20).
Las muestras clínicas positivas a otros agentes virales no SARS-CoV-2 que producen otras Infecciones Respiratorias Agudas (IRA), se encontraban debidamente almacenadas en los Laboratorios Nacionales de Referencia del Departamento de Virología del IPK. Los resultados de dichas muestras se encontraban custodiados en bases de datos al que solo tienen acceso los miembros y responsables de cada laboratorio.
Todos los participantes tuvieron el compromiso de salvaguardar la confidencialidad de los individuos y de los pacientes positivos al SARS-CoV-2. El estudio se realizó siguiendo las Buenas Prácticas Clínicas y de Laboratorio y las instrucciones que el fabricante de los estuches propone. Se emplearon métodos para la realización de las pruebas de laboratorio y estadísticas reconocidos a nivel internacional (Referencias de esas pruebas). Los participantes en el caso de los individuos convalecientes de COVID-19 fueron informados de sus resultados.
Resultados
Evaluación de los ensayos inmunocromatográficos: ABBOTTT, CPM, CORE Y KEWEI
Las tablas 2 y 3 muestran los valores de los parámetros calculados para los ensayos inmunocromatográficos de detección de Ag SARS-CoV-2, en comparación con el método de referencia (RT-PCR), a partir del panel de muestras totales (positivas y negativas), teniendo en cuenta solo las muestras provenientes de pacientes sintomáticos con menos de cinco días desde la fecha de inicio de los síntomas.
Tabla 2 Desempeño de los ensayos inmunocromatográficos calculados a partir el total de muestras positivas y negativas
| PRD-Ag | N (total) |
Se%% (IC 95%) |
Es%% (IC 95%) |
VPP%% (IC 95%) |
VPN% (IC 95%) |
Conc% (IC 95%) |
Kappa (IC 95%) |
| 110 | 89 (75-96) | 89 (78-95) | 85 (71-93) | 92 (82-97) | 89 (81-94) | 0,78 (0,66-0,90) | |
| 186 | 69 (61-76) | 98 (93-100) | 99 (97-100) | 47 (36-58) | 75 (69-81) | 0,48 (0,35-0,61) | |
| 82 | 88 (72-95) | 79 (63-89) | 80 (64-70) | 87 (71-95) | 83 (73-90) | 0,66 (0,48-0,82) | |
| 72 | 33 (18-49) | 97 (92-100) | 92 (78-100) | 59 (47-72) | 65 (54-76) | 0,31 (0,09-0,53) |
Leyenda: Se: Sensibilidad; Es: Especificidad; VPP: Valor predictivo positivo; VPN: Valor predictivo negativo; Conc: Concordancia
Tabla 3 Desempeño de los ensayos inmunocromatográficos a partir de muestras provenientes de pacientes sintomáticos con menos de cinco días desde la fecha de inicio de los síntomas
| PRD-Ag |
Se% (IC 95%) |
Es% (IC 95%) |
VPP% (IC 95%) |
VPN% (IC 95%) |
Conc% (IC 95%) |
Kappa (IC 95%) |
|
| 86 | 91 (75-98) | 92 (81-98) | 88 (72-96) | 94 (83-99) | 92 (83-96) | 0,83 (0,71-0,96) | |
| 69 | 93 (83-100) | 98 (93-100) | 96 (89-100) | 95 (89-100) | 96 (91-100) | 0,91 (0,81-0,100) | |
| 64 | 89 (71-97) | 81 (63-91) | 78 (60-90) | 91 (74-98) | 84 (73-92) | 0,69 (0,51-0,87) | |
| 26 | 75 (54-96) | 90 (71-100) | 92 (78-100) | 69 (44-94) | 81 (66-96) | 0.62 (0,31-0,92) |
Leyenda: Se: Sensibilidad; Es: Especificidad; VPP: Valor predictivo positivo; VPN: Valor predictivo negativo; Conc: Concordancia
Al analizar la sensibilidad clínica de las técnicas utilizando el panel de muestras totales positivas a la RT-PCR del SARS-CoV-2, se obtuvo que 40 de las 45 muestras positivas empleadas para la evaluación del estuche ABBOTT, resultaron positivas por este método; 100/145 resultaron positivas al ensayo CPM. De las 40 muestras positivas analizadas para el ensayo CORE, 35 resultaron positivas y para el ensayo KEWEI 12/36 fueron positivas. De estos resultados se obtuvieron valores de sensibilidad que oscilaban en el rango entre 33 y 89 %, siendo más bajo para el ensayo KEWEI con un valor del 75 %. Para interpretar los resultados de concordancia obtenidos entre los estuches inmunocromatográficos y la técnica de referencia RT-PCR se tuvo en cuenta la escala de valoración del índice de Kappa, según Molinero en 2011.14 En este sentido, el estuche KEWEI tuvo una concordancia baja, mientras que el ensayo CPM presentó una concordancia moderada. Con los estuches ABBOTT y CORE se logró una concordancia buena.
Al estratificar las muestras y teniendo en cuenta solo los pacientes sospechosos, con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas, observamos un mejor desempeño de cada estuche, quedando en primer lugar el ensayo CPM con un 93 % de sensibilidad. El grado de concordancia, según la escala de valoración del índice de Kappa para los estuches ABBOTT y CPM fue muy buena, teniendo en cuenta el criterio evaluado. No así para los estuches CORE y KEWEI, con los que se obtuvo una concordancia buena.
Evaluación del ensayo de inmunofluorescencia WANTAI SARS-CoV-2 (IFA).
Para la evaluación del ensayo WANTAI-SARS-CoV-2 (IFA) se utilizaron muestras de exudado nasofaríngeo en medio de transporte viral y se seleccionaron las muestras de pacientes sintomáticos, con menos de cinco días desde la fecha de inicio de los síntomas e individuos/pacientes con muestras colectadas a los cinco días del primer PCR positivo. En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos del desempeño de este ensayo.
Tabla 4 Desempeño del ensayo WANTAI SARS-COV-2 (IFA) calculado a partir de diferentes criterios clínicos-epidemiológicos
| Grupos por criterios |
Se% (IC 95%) |
Es% (IC 95%) |
VPP% (IC 95%) |
VPN% (IC 95%) |
Conc% (IC 95%) |
Kappa (IC 95%) |
|
Total de muestras (N=145) |
94 (90-99) |
92 (85-100) |
95 (91-100) |
90 (83-98) |
93 (90-98) |
0,86 (0,78-0,95) |
|
Sospechosos (N=96) |
95 (85-100) |
92 (85-100) |
83 (67-98) |
98 (94-100) |
98 (87-99) |
0,84 (0,70-0,97) |
|
Evolutivo 5to día (N=73) |
95 (89-100) |
92 (85-100) |
91 (83-99) |
96 (91-100) |
93 (89-99) |
0,87 (0,78-0,97) |
Leyenda: Se: Sensibilidad; Es: Especificidad; VPP: Valor predictivo positivo; VPN: Valor predictivo negativo; Conc: Concordancia
Para el panel de muestras totales analizadas, se obtuvo que de las 92 muestras positivas por la RT-PCR, 87 resultaron positivas por el estuche WANTAISARS-COV-2 (IFA), para una sensibilidad del 94 %, valor que aumentó hasta un 95 % para el resto de los criterios evaluados. Por otra parte, la especificidad alcanzada fue muy homogénea para todos los grupos de criterios estudiados, con un valor del 92 %. La concordancia establecida para esta prueba en todas las condiciones según el índice de Kappa se considera como muy buena.
Discusión
Contar con un diagnóstico precoz del SARS-CoV-2 es una herramienta imprescindible para la conducción de la pandemia de COVID-19. La RT-PCR con una eficiencia analítica ≥ 96 %, es la prueba estándar de oro para el diagnóstico del nuevo coronavirus. Sin embargo, demanda de mayor tiempo para la obtención de un resultado si la comparamos con las pruebas rápidas de detección de Ag SARS-CoV-2.15,16,17 Varios reportes acerca de la efectividad analítica de estas últimas pruebas, han arrojado valores de sensibilidad que varían entre un 70,6 % y 100 %, y una especificidad muy elevada que oscila entre un 96 % y un 100 %.18
Los ensayos inmunocromatográficos son diseñados para emplearse en pacientes sintomáticos y con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas. Por ello, cuando se utilizó el panel de muestras totales los resultados en cuanto a la sensibilidad, no fueron como como los recomendados por la OMS en 2020 (≥80 %), excepto para los ensayos CORE y ABBOTT, con los que se obtuvieron un 88 % y 89 %, respectivamente. Esto puede estar influenciado por el hecho, de que, entre las muestras positivas escogidas había tanto pacientes sintomáticos como individuos asintomáticos, así como casos evolutivos en los que se desconocían la fecha de inicio de los síntomas (en el caso de ser sintomáticos); no así para los estuches ABBOTT y CORE, con los que se diagnosticaron solo individuos sintomáticos. Sí se alcanzaron los valores de sensibilidad recomendados por la OMS cuando se estratificaron los resultados teniendo en cuenta los casos sospechosos con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas, excepto en el ensayo KEWEI que quedó por debajo del 80 %.19)
Con respecto a las indicaciones de los fabricantes de cada ensayo, con ABBOTT se obtuvieron valores de sensibilidad y especificidad por debajo de los reportados por los fabricantes cuando evaluaron los casos sospechosos con menos de siete días desde el inicio de los síntomas (98,1 y 99,8 % respectivamente). Para el ensayo CPM se obtuvieron resultados muy similares a los obtenidos por el productor del estuche al evaluar, igualmente, los casos sospechosos (92,67 % de sensibilidad y 98,29 % de especificidad). Los resultados alcanzados con CORE y KEWEI fueron más bajos que aquellos descritos por los fabricantes (sensibilidad del 98,1 y 96,18 % y especificidad del 99,6 y 100 %, respectivamente).
Los resultados obtenidos en el presente trabajo coinciden con informes anteriores sobre el rendimiento del ensayo ABBOTT, que constituye una de las principales pruebas usadas a nivel mundial para el diagnóstico del SARS-CoV-2 mediante ensayos de detección de Ag. Domínguez y cols. reportaron un estudio con los test rápidos de antígenos PanbioTM (ABBOTT) para la detección del SARS-CoV-2 en centros residenciales, en el que obtuvieron una sensibilidad del 95 % y una especificidad del 100 %.20 Por otra parte, los resultados de sensibilidad en la evaluación del ensayo ABBOTT desarrollado por Gras y cols. en España, fueron inferiores a los obtenidos en el presente trabajo (61,1 % para el total de muestras y 71,4 % para pacientes sintomáticos con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas). Sin embargo, la especificidad reportada por estos autores, bajo las mismas condiciones descritas para la sensibilidad, resultó superior a la obtenida en el presente estudio, con valores del 99,7 % y 99,6 %, respectivamente.21
Por otra parte, se obtuvo un desempeño favorable cuando se evaluó el panel de muestras totales con el ensayo WANTAI SARS-CoV-2 (IFA), el que mejoró cuando se realizó la estratificación de las muestras. Estos resultados indican que esta prueba debe utilizarse para la detección de casos sospechosos y que presentan una carga viral elevada. Así mismo la detección de positivos entre los casos evolutivos del quinto día fue muy favorable, lo que amplía la utilidad de este ensayo más allá de las recomendaciones de sus productores. Sin embargo, los valores de especificidad obtenidos en cada criterio evaluado son inferiores al mínimo recomendado por la OMS, aunque superior al 90 %. Los resultados obtenidos en el presente trabajo fueron inferiores a los descritos por los fabricantes (96,6 % de sensibilidad y 96,9 % de especificidad) para el panel de muestras totales. Dos estudios en España y Chile apoyados en la evaluación del desempeño de la PRD-Ag 2019-nCoV Ag Test Fluorescence de China, basada igualmente en el principio de IFA, revelaron una sensibilidad del 79,4 y 94,7 %, una especificidad del 95,7 y 100 %, cuando utilizaron muestras de pacientes sintomáticos con menos de siete días desde el inicio de los síntomas. Para ambas investigaciones estos parámetros disminuyeron al emplear muestras de individuos asintomáticos y un panel de muestras totales (sintomáticos/asintomáticos), respectivamente.22,23
Las PRD-Ag no son tan precisas como las pruebas moleculares, pero son más accesibles en términos de disponibilidad y facilidad de uso, y se pueden utilizar como un diagnóstico primario en el punto de atención médica (los llamados points of care) fuera del laboratorio.24 Los ensayos inmunocromatográficos evaluados en el presente trabajo demostraron ser herramientas útiles para un diagnóstico precoz del SARS-CoV-2 en pacientes sintomáticos con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas (sospechosos). Esto permite que dichos pacientes puedan recibir la atención adecuada por el sistema de salud y a la vez seguir medidas orientadas por las autoridades sanitarias como el autoaislamiento y el rastreo de contactos.
Por otra parte, el ensayo WANTAI SARS-CoV-2 (IFA) no cuenta con la bondad de un diagnóstico primario en el punto de atención médica, pues precisa de instrumental y personal de laboratorio especializado. Esto constituye una desventaja en el escenario clínico-epidemiológico de la pandemia en Cuba. Sin embargo, esta prueba mostró mejor desempeño con respecto a los ensayos inmunocromatográficos estudiados. Esto puede deberse a que es un método de inmunodetección “en sandwich” que se basaen la unión específica entre Ag-Ac y que permite la obtención de una señal amplificada, es decir, cuanta más concentración de Ag haya en una muestra (muestras con menor Ct/ pacientes sospechosos) mayor es el complejo Ag-Ac que se forma, dando lugar a una mayor intensidad de la señal de fluorescencia en el Ac de detección.
En el contexto actual, ninguna prueba es perfecta cuando se trata de los indicadores de precisión, accesibilidad, asequibilidad y puntualidad de los resultados. Para la elección de un ensayo diagnóstico se deben tener en cuenta dichos indicadores, así como la prevalencia de la enfermedad (COVID-19) en la población sometida a prueba.
En función del desempeño obtenido con los ensayos inmunocromatográficos evaluados en este estudio, proponemos su uso para el diagnóstico del SARS-CoV-2 en el punto primario de atención médica en pacientes sintomáticos (sospechosos) con menos de cinco días desde el inicio de los síntomas. La prueba WANTAI SARS-CoV-2 (IFA) mostró un desempeño satisfactorio e incluso consideramos que puede ser utilizado para el seguimiento de casos evolutivos del SARS-CoV-2. Los ensayos estudiados suponen herramientas útiles para un diagnóstico rápido y ¨preciso¨ del nuevo coronavirus, sin embargo, se requiere continuar las investigaciones para la búsqueda de métodos que contengan un desempeño favorable en el diagnóstico de individuos asintomáticos con baja carga viral.
