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Introducción
El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) pertenece a la familia de factores de crecimiento PDGF/VEGF (platelet-derived growth factor / Vascular endothelial growth factor). Esta proteína es reconocida por los receptores VEGFR1 (Vascular endothelial growth factor receptor 1) y VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2) localizados en la superficie de las células endoteliales, así como por el heparán sulfato y la heparina. Estructuralmente presenta 232 aminoácidos y una masa molecular de 27,042 kDa. Está involucrada en la inducción de la proliferación y migración de células del endotelio vascular, es esencial para la angiogénesis, inhibe la apoptosis e induce la permeabilización de vasos sanguíneos.1
El gen VEGF se encuentra ubicado en el locus 6p21.1, contiene ocho exones y presenta una extensión de 2 770 Kb. La variabilidad de productos génicos de VEGF está dada por el proceso de empalme o splicing alternativo que “sufre” el trascrito primario. La gran familia del VEGF está dada por siete factores denominados: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, factor de crecimiento placentario, y VEGF-F.2,3
Los factores genéticos pueden ser determinantes en los niveles de VEGF, y varios polimorfismos del gen se han correlacionado con variaciones en la producción proteica. Entre los Polimorfismos de Simple Nucleótido (SNPs), reportados en la región 5’ no traducida del gen y relacionado con el proceso de expresión génica, se encuentra VEGF (+405 G>C) (rs2010963).1
Modificaciones en la regulación de la expresión de VEGF están implicadas en varias situaciones, donde el proceso de angiogénesis es crítico, tales como progresión del cáncer, artritis reumatoidea, complicaciones microvasculares de diabetes mellitus tipo 1 y psoriasis.4,5,6,7,8
En el campo reproductivo, se ha reportado el papel del polimorfismo +405G>C del gen VEGF, como un SNP candidato asociado con la patogénesis de pre-eclampsia, endometriosis, pérdida recurrente del embarazo y síndrome de hiperestimulación ovárica.9,10,11,12
Numerosas investigaciones han intentado establecer asociaciones entre la susceptibilidad, resistencia y/o severidad de ciertas enfermedades y la presencia del polimorfismo +405G>C del VEGF, asumiendo el alelo G como factor de riesgo; sin embargo, los resultados han sido variables en diferentes grupos poblacionales del mundo.2
Se reconoce que no existen informes genéticos poblacionales de esta variante en Cuba, por lo cual el presente estudio tiene como objetivo describir las frecuencias génicas y genotípicas del polimorfismo VEGF (+405 G>C) en la población cubana. Este estudio representa una etapa inicial para caracterizar los perfiles inmunogenéticos a nivel molecular en la población, y establecer las bases para posteriores estudios de asociación alélica que se desarrollen en el país.
El objetivo de esta investigación es describir las frecuencias génicas y genotípicas del polimorfismo VEGF (+405 G>C) en la población cubana.
Material y Métodos
Se realizó un estudio observacional, descriptivo, transversal, en el Centro Nacional de Genética Médica, en el período comprendido entre octubre de 2017 y marzo de 2018, en neonatos cubanos a quienes se les realizó el tamizaje neonatal, para caracterizar molecularmente el polimorfismo VEGF (+405 G>C).
Población y muestra
La población de estudio estuvo constituida por el total de recién nacidos vivos en el periodo de noviembre a diciembre de 2017, a los que se les realizó el tamizaje neonatal entre el quinto y décimo días de nacidos para pesquisa de enfermedades metabólicas, establecido por el Programa Cubano de Manejo, Diagnóstico y Prevención de Enfermedades Genéticas. Se incluyeron recién nacidos de ambos sexos y se excluyeron los que presentaron un resultado positivo para el diagnóstico de una de las enfermedades evaluadas. La muestra quedó representada por 162 individuos cubanos de ambos sexos de varias regiones del país. El número muestral estuvo condicionado por el análisis de factibilidad de la investigación. Para su selección se aplicó un muestreo aleatorio simple.
Se utilizaron muestras de sangre seca en papel de filtro conservadas en el banco de ADN del Centro Nacional de Genética Médica, cuyo propósito original era el tamizaje neonatal. Su manipulación fue evaluada y aprobada por el Comité de Ética de la Institución, el que propuso un manejo codificado de la identidad.
Caracterización molecular
Se realizó la extracción manual de ADN en sangre seca en papel de filtro mediante la aplicación de resina Chelating (ácido iminodiacético), según el procedimiento normalizado de operaciones (PNO) de extracción de ADN del Departamento de Biología Molecular de la institución responsable.13 El ADN extraído fue analizado cualitativamente en un gel de agarosa a 1% y posteriormente refrigerado a 4º C hasta su utilización.
Para caracterizar molecularmente al polimorfismo VEGF (+405 G>C) se estandarizó un PCR alelo específico (PCR ARMS: amplificación refractaria de mutaciones específicas). El diseño de los cebadores fue tomado según lo reportado por Boudjenah y otros:14
F1: 5’-CTCACTTTGCCCCTGTCG-3’
F2: 5’-CTCACTTTGCCCCTGTCC-3’
R: 5’-GAGGCGCAGCGGTTAG-3’
Se amplificó una secuencia de 351 pares de bases en un PCR de 25 ciclos (1º desnaturalización a 95° C por 15 min; 2º desnaturalización a 94° C por 45 s; 3º hibridación a 65° C por 45 s y elongación a 72° C por 45 s), que fue identificada en una electroforesis en geles de agarosa a 3 %.
Como control interno de amplificación se utilizó una región del gen FGFR3. Las secuencias del juego de cebadores fueron: 5’-AGGAGCTGGTGGAGGCTGA-3’ y 5’-GGAGATCTTGTGCACGGTGG-3’, con un producto de 164 pares de bases.
Análisis estadístico
Se utilizó el software GENEPOP 4.4 for Windows / Linux / Mac OsX (2015) que implementa diferentes métodos tradicionales de análisis de genética poblacional, así como el paquete estadístico STATISTICA 8.0 for Windows (2007) para el análisis de datos. Se determinaron las frecuencias génicas y genotípicas del polimorfismo VEGF (+405 G>C). Estos datos fueron comparados con los reportados en otras investigaciones al aplicar el test exacto de Fisher. A los valores de la frecuencia esperada se les aplicó la corrección de Levene.15 Se evaluó el equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) y se determinó la existencia o no, de exceso o deficiencia de heterocigóticos. Un valor de p menor a 0,05 fue considerado como estadísticamente significativo.
Resultados
En la Figura 1 se presenta la foto de la electroforesis en geles de agarosa al 3%, mediante la cual se realizó la caracterización molecular del polimorfismo TNFα VEGF (+405G>C) en cada individuo de la población de estudio.
Fig. 1 Fotografía de la electroforesis de ADN en geles de agarosa. En el primer carril se evidencia el Patrón de Peso Molecular de 50pb. Cada dos carriles consecutivos se analiza un caso. El primer y segundo carril de cada muestra, identifica el alelo mutado y el alelo salvaje, respectivamente. La banda de 164 pb representa el control interno de amplificación y la banda de 351 pb representa el gen de interés. Caso 1 y 3: Individuos homocigótico para el alelo G; Caso 2: Individuo homocigótico para el alelo C.
En la Tabla 1, se presentan las frecuencias genotípicas del polimorfismo VEGF (+405G>C).
Tabla 1 Distribución de individuos según el genotipo del polimorfismo VEGF (+405G>C).
( a): Corrección de Levene.
Las frecuencias génicas estimadas para el polimorfismo VEGF (+405G>C) fueron de 0,33 para el alelo G y 0,67 para el alelo C.
Al calcular el equilibrio de HW se obtuvo que el valor de p para el polimorfismo VEGF (+405G>C) fue igual a 0,04. Este valor (p<0,05) determinó el rechazo de la hipótesis nula, y se asumió que la población no se ajustaba al modelo de equilibrio de HW para el gen evaluado.
El análisis estadístico de la población evidenció un déficit de heterocigóticos para el locus en estudio, con un valor de p igual a 0,03, que justificaron el rechazo de la hipótesis nula para esta prueba. Estos resultados condicionaron que la prueba para evaluar un exceso de heterocigóticos no fuese significativa.
DISCUSIÓN
El presente estudio no controla los efectos de la estratificación genética basada en el mestizaje étnico de la población cubana. Según lo reportado por Marcheco y otros,16 la determinación del origen étnico es importante para el desarrollo de los estudios genéticos poblacionales en Cuba, donde existe un origen ancestral muy heterogéneo.
Las frecuencias alélicas del polimorfismo VEGF (+405G>C), pusieron en evidencia que el alelo C era el más frecuente, lo que concuerda con lo reportado internacionalmente en la dbSNP Short Genetic Variations.17
En un estudio global de 92 individuos no relacionados, realizado por el Centro de Estudio de Polimorfismos Humanos (Centre d'Etude du Polymorphisme Human), donde se incluyeron franceses, norteamericanos y venezolanos, se obtuvo una frecuencia génica de 0,80 y 0,20 para los alelos C y G, respectivamente, sin evidencia de diferencias estadísticamente significativas con el presente estudio. La frecuencia de heterocigóticos se comportó muy similar a la presentada en este informe, con 0,32±0,05.18
La aplicación de la Ley de HW contempla un locus de una población determinada en un tiempo dado. Una población puede hallarse en equilibrio de HW para algunos loci y en desequilibrio para otros. Además, las acciones de distintas fuerzas de cambio pueden anularse entre sí, y permitir que la población alcance el equilibrio en un momento determinado. El resultado relacionado con que el gen evaluado no se ajusta a la Ley de HW, puede ser un indicador de que el locus requiere más de una generación para alcanzar el equilibrio, o ser la evidencia de los efectos de la estratificación genética de la población cubana generada por el mestizaje étnico.19
Conclusiones
La caracterización de los perfiles inmunogenéticos a nivel molecular en la población estudiada permitió conocer que el alelo C y el genotipo CC para el polimorfismo VEGF (+405G>C) presentan mayor frecuencia en la población estudiada, mientras que el comportamiento de las frecuencias génicas de VEGF.G y frecuencias genotípicas de los individuos VEGF.GG, lo definen como un alelo de baja prevalencia en la población.
