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INTRODUCCIÓN
Los polifenoles son metabolitos secundarios presentes en todas las plantas vasculares, y constituyen una gran familia de compuestos altamente diversos con variada actividad biológica (Grootaert et al., 2015). Miles de compuestos fenólicos se han caracterizados y agrupado en varias clases. Según Munin y Edwards-Lévy (2011), las variaciones están dadas esencialmente por el grado de oxidación, hidroxilación, metilación, glicosilación y posibles conexiones con otras moléculas (metabolitos primarios: carbohidratos, lípidos, proteínas, entre otros).
A estos compuestos se han atribuido actividades farmacológicas y médicas relacionadas con la prevención y/o mejora del estado de salud. Entre estas se destacan efectos vasodilatadores, anticarcinogénicos, antiinflamatorios, bactericidas, estimuladores de la respuesta inmune, antialérgicos, antivirales, estrogénicos e inhibidores de la fosfolipasa A2, de la cicloxigenasa, lipoxigenasa, glutatión reductasa y xantina oxidasa (Middleton et al., 2000). Además, estos compuestos tienen utilidad para prevenir enfermedades metabólicas como la obesidad y la diabetes (Carpene et al., 2015).
El cacao (Theobroma cacao L.) y sus derivados han recibido una atención diferenciada por su contenido de polifenoles. Los polifenoles de interés en el cacao son los del grupo de flavonoides, como las catequinas (37%), antocianinas (4%) y procianidinas (58%). Los flavonoides se destacan por su baja toxicidad y elevada acción antioxidante y su capacidad de inhibir la peroxidación lipídica al reducir radicales libres y quelar metales (Negaresh y Marín, 2013). Son conocidos los diversos usos medicinales del cacao y el chocolate: antioxidante, antinflamatorio antiparasitario, diurético, tonificante, anticelulítico e hipoglucemiante (Giraldo et al., 2017).
Junto a la extracción directa a partir de materia vegetal o la síntesis química, se ha desarrollado el cultivo de células vegetales como una prometedora alternativa para la producción de compuestos bioactivos de difícil obtención o poco rentables (Pérez- Alonso y Jiménez, 2011). En este sentido, el empleo del cultivo de tejidos para la producción de metabolitos secundarios se ha referido por varios autores (Verpoorte et al., 2002; Espinosa-Leal et al., 2018) y en particular de compuestos fenólicos (Gonçalves y Romano, 2018). Como la acumulación de metabolitos activos es genotipo específico, es necesaria una apropiada selección de las especies y luego los órganos de dónde tomar los explantes para la obtención por ejemplo de callos (Murthy et al., 2014; Ochoa-Villarreal et al., 2016).
Las investigaciones para la obtención de polifenoles del cacao se han realizado mayormente en planta natural (Padilla et al., 2008; Hii et al., 2009; Sotero et al., 2011; Ordoñez et al., 2019; Indiarto et al., 2019) y productos derivados (Hii et al., 2009). A partir del cultivo in vitro ha sido abordada a partir de callos, raíces, hojas, peciolos, cotiledones (Marziah et al., 1993) y callos con estructuras embriogénicas obtenidos de explantes florales (Quiñones-Galvez et al., 2016).
En estudios histológicos a partir del cultivo in vitro de explantes florales se ha relacionado la distribución de estos compuestos con la respuesta embriogénica del callo (Gallego et al., 2016). Además, se ha demostrado que la respuesta a la producción de polifenoles es genotipo-dependiente (Quiñones et al., 2013; Gallego et al., 2016). Estudios previos informaron que el clon ‘UF-650’ es promisorio para la obtención de metabolitos secundarios, entre ellos fenoles totales y taninos que difunden al medio de cultivo (Fajardo et al., 2015). Sin embargo, no se han identificado ni cuantificado los compuestos fenólicos presentes.
Por otra parte, aún son insuficientes los trabajos relacionados con la obtención de estos compuestos en el cultivo in vitro y el empleo de métodos más eficientes para la identificación de la presencia de polifenoles en estos tipos de muestra. Atendiendo a lo anterior, el presente trabajo tuvo como objetivo determinar el contenido de polifenoles totales en callos de Theobroma cacao clon ‘UF-650’.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se llevó a cabo en el Centro de Estudios de Biotecnología Vegetal (CEBVEG) de la Universidad de Granma, Cuba.
Material vegetal
Hojas y botones florales de plantas adultas de Theobroma cacao clon ‘UF-650’ se recolectaron en el Banco de Germoplasma de la Estación Experimental III Frente, Santiago de Cuba. La identificación de la especie se realizó en el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad de Granma según la Norma Ramal de Salud Pública 309 (NRSP, 1992), confirmada por el especialista de la estación experimental y depositada con el número 3012 del herbario del Jardín Botánico Cupaynicú, serie Catasús. Para la obtención de los callos se utilizaron estaminoides y pétalos de botones florales inmaduros y hojas jóvenes.
Formación de callos
Previo al establecimiento in vitro, las hojas se lavaron en solución de detergente al 1.0% (m/v) en agitación (zaranda) durante 15 minutos, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Posteriormente, se sumergieron en solución al 2.0% (v/v) de hipoclorito de sodio (NaClO), en condiciones asépticas durante 15 minutos. Finalmente, se hicieron tres enjuagues con agua destilada estéril. Con ayuda del bisturí, se tomaron como explantes secciones de aproximadamente 1.0 cm2 de la zona más cercana a la nervadura central.
Los botones florales fueron sumergidos en solución de detergente al 1.0% (m/v) durante 30 minutos con agitación (zaranda), seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril. Luego en área aséptica, se sumergieron en solución de NaClO (2.0%) (v/v) durante 20 minutos, seguido de cuatro enjuagues con agua destilada estéril. Para su establecimiento en condiciones asépticas, se extrajeron los pétalos y estaminoides.
El medio de cultivo estuvo compuesto por: Sales MS (Murashige y Skoog, 1962) (4.32 g l-1), vitaminas LB (López-Báez et al., 1993) (10 ml l-1), mio-inositol (100 mg l-1), glicina (3.0 mg l-1), sacarosa (40 g l-1), kinetina (0.25 mg l-1), ácido 2,4-Diclorofenoxiacético (2,4-D) (2.0 mg l-1) y agar E (BioCen) (6.0 g l-1). El medio de cultivo fue distribuido, en frascos de 25 ml de capacidad, a razón de 10 ml por frasco. Antes de la esterilización en autoclave, se ajustó el pH del medio de cultivo a 5.7.
El pesaje de los reactivos utilizados en la preparación del medio de cultivo se realizó en la balanza analítica (SARTORIUS). La esterilización del instrumental y del medio de cultivo se efectúo en autoclave vertical a 121 °C y 1.2 kg cm-2 de presión durante 15 minutos. La manipulación del material vegetal se realizó en cabinas de flujo laminar (FASTER), y se empleó para la desinfección etanol al 70% (v/v).
Los pétalos y estaminoides se colocaron a razón de cinco explantes por frasco de cultivo y los segmentos de hoja a razón de dos explantes por frasco, para un total de 50 frascos por cada tipo de explante. La incubación se realizó en oscuridad a 25 ±2 °C. A los 28 días de cultivo se cuantificó el número de explantes que formaron callos y se expresó como porcentaje de callogénesis. Los callos fueron mantenidos bajo sus mismas condiciones de cultivo por tres meses con el objetivo de aumentar la biomasa fresca para obtener extractos a partir ellos y se evaluó el grado de desarrollo según escala referida por Díaz-López et al. (2015). Los resultados fueron expresados como porcentaje de callos en el grado de desarrollo.
Contenido de polifenoles
Para obtener extractos de los callos e identificar cualitativamente la presencia de polifenoles se emplearon callos de tres meses de cultivo provenientes de diferentes explantes en las condiciones descritas previamente. Se siguió el método propuesto por Folin-Ciocalteu (Suárez-Peregrin, 1972). Se tomó un 1.0 g de callo obtenido a partir de cada tipo de explante y se le añadieron 10 ml de una mezcla de acetona/agua (1:1 v/v), se mantuvo durante 24 horas en frascos cerrados herméticamente a temperatura ambiente, en la oscuridad. Los extractos obtenidos se filtraron (0.45 µm) y de cada uno se tomó una alícuota de 1.0 ml, a la cual se le adicionaron dos gotas de reactivo de Folin-Ciocalteu (Panreac®) y dos gotas de hidróxido de sodio (NaOH) 30% (m/v), se agitó y dejó reposar durante cinco minutos. El ensayo fue positivo si se observó la aparición de coloración azul.
El contenido de polifenoles totales se estimó por espectrofotometría UV/Visible (Jenway 6305), siguiendo la metodología de determinación colorimétrica de fenoles solubles en material vegetal, mediante el reactivo Folin-Ciocalteu (Ainsworth y Guillespie, 2007).
Se realizó previamente la curva de calibración con patrón pirocatecol p.a (Sigma-Aldrich) con ocho puntos, en el rango de concentraciones de 0 a 50 µg ml-1. Se utilizaron las siguientes soluciones: solución de carbonato de sodio (CaCO3) 0.7 M, solución stock de pirocatecol 500 mg l-1(en solvente acetona/agua 1:1 v/v) y solución de trabajo de pirocatecol 50 mg l-1 (se diluyeron 10 ml de la solución stock de pirocatecol a 100 ml con la mezcla acetona/agua (1:1 v/v).
Aleatoriamente se escogieron muestras de callos hasta obtener 1.0 g de masa fresca proveniente de los diferentes explantes, se le añadieron 10 ml de una mezcla de acetona/agua (1:1 v/v) para formar extractos provenientes de cada tipo de explante (tres extractos). Luego de transcurridas 48 horas en maceración, el extracto obtenido se filtró (Milipore 0.45 µm). Después se tomó 1.0 ml del filtrado de cada extracto, se le agregaron 2.0 ml de reactivo Folin-Ciocalteu y, a los dos minutos, se adicionaron 8.0 ml de la solución de CaCO3 (0.7 M). Se dejó desarrollar color, de igual forma que se hizo para la curva de calibración con patrón pirocatecol. Las lecturas fueron realizadas a λ=760 nm, luego de transcurridos 30 minutos para desarrollo de color, para cada punto, y se realizaron tres lecturas por punto.
El contenido de compuestos fenólicos expresados en µg de pirocatecol por gramo de masa fresca, se determinó por medio de la ecuación: Contenido = ((Cex· Vex)/Pm)·1000. Donde, Pm es la masa de la muestra (g), Vex es el volumen del extracto utilizado, y Cex es la concentración encontrada en el extracto (según curva de calibración).
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se usó el programa STATGRAPHICS Centurion XV (Trial versión 15.2.06). Para comprobar la normalidad de los datos del contenido de polifenoles totales se realizó la prueba de Kormogorov- Smirnov; mientras, la prueba de Cochran se utilizó para verificar la homogeneidad de varianzas. Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) para determinar la significación y la prueba de Tukey cuando se detectaron diferencias significativas, al 95% de probabilidad.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Formación de callos
La callogénesis se observó a partir de los 15 días de cultivo en explantes florales. Este resultado se corresponde con lo informado por Díaz-López et al. (2015), quienes observaron un inicio de la callogénesis a los 14 días en explantes florales en cinco clones venenzolanos (‘SCA-6’, ‘OC-61’, ‘OC-77’, ‘CHO-41’y ‘PORC’). A los 28 días, se obtuvo un 86.13% de formación de callos a partir de pétalos y 83.46% a partir de estaminoides. Sin embargo, en explantes de hojas, este evento comenzó a partir del quinto día; pero estos callos presentaron un lento desarrollo, por lo que se observó a los 28 días sólo un 55% de formación de callos. Resultados similares con mayor porcentaje de formación de callos en explantes florales (85%) que en hojas (65%) informó Pancaningtyas (2015) en el clon ‘Sulawesi 1’, de Indonesia.
Los callos obtenidos a partir de pétalos y estaminoides fueron color amarillo crema, de consistencia friable, formados de forma general a partir de la base del explante (Figura 1 b y c). Los resultados se correspondieron con los descritos previamente por Rodríguez et al. (2004) en este clon, pero solo a partir de estaminoides, con la formación de callos de color amarillo-crema a partir de la base del explante.
Los resultados concuerdan además con lo informado por autores como Díaz-López et al. (2015) quienes, utilizando explantes florales, observaron en callos formados de estaminoides provenientes de diferentes cultivares venezolanos, una coloración amarillo crema y consistencia compacta. Por otra parte, a partir de pétalos, observaron callos de apariencia y consistencia más friable y con la misma coloración amarillo crema.
En esta investigación, los callos a partir de estaminoides, presentaron en ocasiones, zonas nodulares que se tornaron de color pardo, al parecer por la acumulación de polifenoles. Al respecto, autores como Gallego et al. (2016), han observado que callos compactos, contienen de forma aleatoria, polifenoles en todo el tejido y plantean que la capacidad embriogénica parece estar relacionada con el balance, concentración y distribución de polifenoles.
Figura 1. Callos de Theobroma cacao L. clon ‘UF-650’ obtenidos a los 3 meses de cultivo a partir de tres tipos de explantes. a. hojas, b. pétalos, c. estaminoides.
Los callos obtenidos de pétalos y estaminoides no mostraron estructuras embriogénicas. Respecto a ello, Ikeuchi et al. (2013) clasifican los callos friables y nodulares o compactos, como aquellos que típicamente no son ni embriogénicos, ni organogénicos.
A partir de hojas, se observaron tanto callos friables como nodulares; o en un mismo callo, se presentaron zonas tanto nodulares como friables (Figura 1 a). Los callos obtenidos a partir de hojas, generalmente, tuvieron poco desarrollo debido a un crecimiento lento, resultado de una limitada multiplicación. Esta respuesta pudo estar dada por la acción de compuestos fenólicos en las zonas nodulares, en las cuales se ha inhibido la actividad auxínica que promueve el desarrollo del callo. Los flavonoides pueden ser inhibidores del transporte de auxinas (Peer y Murphy, 2007; Zhou et al., 2016) y modulan la actividad de proteínas (Zhou et al., 2016).
A los tres meses de cultivo, se obtuvo un 80.74, 70.73 y 58% de callos que alcanzaron grado 3 de desarrollo, provenientes de pétalos, estaminoides y hojas, respectivamente, de los cuales se escogieron al azar, para la obtención de extractos.
Contenido de polifenoles
El ensayo cualitativo para la identificación de la presencia de polifenoles (Figura 2), resultó positivo para todas las muestras evaluadas, al desarrollarse una coloración azul en todos los casos. El método para la identificación de polifenoles totales Folin- Ciocalteu se fundamenta en su carácter reductor. Se utiliza el mismo principio que la técnica utilizada para la cuantificación utilizando como reactivo una mezcla de ácidos fosfowolfrámico y fosfomolíbdico en medio básico, que se reducen al oxidar los compuestos fenólicos, que origina óxidos azules de wolframio (W8O23) y molibdeno (Mo8O23) (Kuskoski et al., 2005). Para la cuantificación el medio básico es la solución de CaCO3 (0.7 M) y para la identificación el medio básico es una solución de NaOH al 30% (7.5 M), lo cual permite una mayor sensibilidad del método al utilizarse una base más fuerte y más concentrada que aumenta la velocidad de la reacción y su capacidad para la detección de la presencia de polifenoles, siendo más rápido y económico. Esto garantiza que se pueda hacer una correcta discriminación de los mismos antes de pasar a la determinación cuantitativa.
Estos resultados corroboran lo informado por Alemanno et al. (2003) que a través de un estudio histoquímico en explantes florales y callos obtenidos a partir de estos en T. cacao, observaron presencia de polifenoles que estuvieron localizados fundamentalmente en la epidermis. Otros autores como Ricchelle et al. (2001), Hii et al. (2009), Negaresh y Marín (2013) y Quiroz-Reyes et al. (2013), identificaron polifenoles en cacao y en productos derivados. La presencia de dichos compuestos es común en esta especie.
Figura 2. Resultado de ensayo de identificación cualitativa de polifenoles en extractos obtenidos a partir de callos de hojas, estaminoides y pétalos de Theobroma cacao L. clon ‘UF-650’.
Mediante la cuantificación de compuestos fenólicos por espectrofotometría UV/Visible, usando como patrón pirocatecol según el protocolo descrito por Ainsworth y Gillespie (2007), se demostró el cumplimento de la linealidad y exactitud en el intervalo de concentración de 0 a 50 µg l-1 (y = 0.0241x - 0.0018; R² = 0.9994).
El mayor contenido de compuestos fenólicos expresado como µg de pirocatecol por gramo de muestra se obtuvo en callos de estaminoides (11. 208 µg g-1) (Tabla 1), con diferencias significativas respecto a los otros dos tipos de explantes. Esta respuesta pudo deberse a que en callos de estaminoides se observaron zonas nodulares, duras, de coloración parda, por el proceso de acumulación de compuestos fenólicos (Gallego et al., 2016).
En el caso de los pétalos, al ser más homogéneos en su coloración y consistencia friable, presentaron más actividad de multiplicación celular, lo que resulta en menor acumulación de polifenoles en las células (Hopkins, 1999; Isah, 2019). Gran parte de los compuestos fenólicos producidos pudieron ser de bajo peso molecular y difundidos al medio de cultivo; por lo cual no se cuantificaron en el callo. Tanto el contenido, como la composición de polifenoles pudo variar en dependencia del origen y grado de desarrollo de los callos. Esto está en correspondencia con lo informado por Pérez-Alonso y Jiménez (2011), quienes plantearon que la composición química de un callo, suele variar dependiendo de su fuente de explante o tejido materno y la edad del callo en sí. La biosíntesis de metabolitos secundarios suele estar restringida a estados específicos del desarrollo y a períodos de estrés. Por ello, si se emplearan los callos de este clon para la producción de compuestos fenólicos sería necesario seleccionar las condiciones de cultivo que propicien un incremento en su contenido.
Sin embargo, los resultados difirieron de los informados por Quiñones et al. (2013) que al estudiar el contenido de fenoles en el cultivo de callos embriogénicos de cacao, a partir de nucelas, estaminoides y pétalos; pero con ácido clorogénico como patrón, no observaron diferencias entre el contenido en callos de pétalos y estaminoides. Estos autores obtuvieron para el clon ‘UF-654’, 4.5 y 4.2 mg g-1, en callos formados a partir de estaminoides y pétalos respectivamente, según patrón ácido clorogénico, valores superiores a los alcanzados en este trabajo. Por otra parte, estudios realizados por Pancaningtyas (2015) en el clon ‘Sulawesi 1’, pero en base a patrón ácido gálico, obtuvieron fenoles totales (1.0%), flavonoides totales (3.2%) y catequinas totales (4.2%) en extractos de callos de explantes florales y en extractos de callos a partir de explantes hojas, con porcentajes de 0.67, 2.1 y 7.0% de fenoles totales, flavonoides totales y catequinas totales, respectivamente.
Tabla 1. Contenido de polifenoles (expresados como µg g-1 de pirocatecol por gramo de muestra) en muestras de callos de Theobroma cacao L. clon ‘UF-650’ obtenidos a partir de hojas jóvenes y botones florales.
En la literatura científica consultada, existen pocos trabajos referidos a identificación y cuantificación in vitro de estos compuestos fenólicos en T. cacao. Generalmente, los estudios realizados en cacao están son en planta natural, el chocolate y productos derivados. Por ejemplo, autores como Ortega et al. (2007) observaron que el cacao contiene un elevado nivel de fenoles y flavonoides en comparación con el Té negro, el Té verde y el vino rojo.
Aunque las concentraciones de fenoles totales son bajas si se comparan con registros de otras partes de la planta de T. cacao, los resultados mostrados, son promisorios en cuanto a la actividad biológica variada que pudieran mostrar los compuestos obtenidos in vitro a partir de los callos. Distintos autores han determinado que existe una correlación lineal positiva entre el contenido de fenoles totales y la capacidad antioxidante (Indiarto et al., 2019; Ordoñez et al., 2019; Ebuehi et al., 2019).
En este sentido, Padilla et al. (2008), cuantificaron polifenoles a partir 1.0 g de muestra de semilla de cacao y obtuvieron una concentración de 6.66 ± 0.044 AGE g/100g (ácido gálico equivalente g/100g). Por otra parte, Sotero et al. (2011), estudiando cuatro especies de la familia Sterculiaceae: Theobroma cacao L., Herrenia nitida (Poepp) Schultes, Theobroma grandiflorum (Willd. Ex Spreng) Schum y Theobroma bicolor (Humb y Bompl); obtuvieron la mayor concentración de polifenoles en semillas de cacao con 12101.46 mg/100 g, referido a patrón catequina. También, Indiarto et al. (2019) cuantificaron concentraciones en semillas de cacao de 207.14-721.83 mg g-1 AGE.
Se comprobó que es posible la producción de polifenoles en los tres tipos de callos evaluados, los que pueden servir como punto de partida para la implementación de técnicas alternativas para el incremento de su producción mediante cultivo in vitro. Dado a los elevados costos en la obtención de metabolitos secundarios por vías tradicionales y de síntesis química, resultan de gran interés los estudios encaminados a la producción de metabolitos secundarios utilizando métodos biotecnológicos. Por tanto, las técnicas de cultivo in vitro, son ahora indispensables no sólo para la producción de plantas libres de microorganismos patógenos, rápida multiplicación de cultivares de interés y transformación del genoma de la planta; sino también, para la producción de metabolitos secundarios derivados de plantas (Debnarh et al., 2006; Altpeter et al., 2016).
Por otra parte, generalmente para estudios preliminares de contenido de metabolitos secundarios, generalmente se emplean métodos de tamizaje fitoquímico para comprobar la presencia de familias de compuestos en las muestras. Ello persigue como finalidad guiar ensayos tanto biológicos, como químicos previos al empleo de análisis químico de tipo cuantitativo. El proceso de selección del método depende del tipo de compuesto que se necesita producir, si el producto de interés es un pigmento, puede ser empleado un método espectrométrico; si no, otros basados en la aproximación química son necesarios (Ochoa-Villarreal et al., 2016; Espinosa-Leal et al., 2018).
En el presente trabajo se empleó como método de identificación de polifenoles totales, una variante de la técnica de Folin- Ciocalteu (Suárez-Peregrin, 1972). En ella se utiliza como medio básico una solución de hidróxido de sodio al 30% que aumenta la sensibilidad de la técnica, capaz de detectar muy bajas concentraciones de polifenoles y que puede sustituir al tamizaje fitoquímico, previo a la utilización de métodos de cuantificación, en extractos provenientes de cultivo in vitro. Además, emplea poco tiempo y es de bajo costo. No se encontró en la literatura científica consultada la utilización anterior de esta técnica para este fin.
CONCLUSIONES
Callos obtenidos de tres tipos de explantes en Theobroma cacao L. clon ‘UF-650’ contienen polifenoles totales. La mayor concentración (11. 208 µg g-1) expresados como pirocatecol, se obtiene a partir de callos de estaminoides. Este resultado es una referencia para el escalado en medios de cultivo líquidos de la producción de polifenoles totales, que puede ser asistido por técnicas de ingeniería metabólica.
