Identificación de los genes Ty-2 y Ty-3 de resistencia a Begomovirus y su grado de homocigosis en nuevas accesiones de tomate

 

Ms.C. F. Dueñas^I, Dra.C. Marta Álvarez^I y Dr.C. C. Moya^II, Dra.C. Yamila Martínez^III,Dra.C. Belkis Peteira^IV, Yailen Arias^V

I Investigador

II Investigadores Titulares del departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas

III Investigadora Titular

IV Investigadora Auxiliar

V Reserva Científica del departamento de Fitopatología, División de Protección de Plantas, Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), apartado 10, San José de las Lajas, La Habana, Cuba, CP 32700

 

 

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ABSTRACT

The tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is one of the most dangerous Begomovirus affecting tomato productions in Cuba. At present, several genes related to resistance have been described. Ty-1, Ty-2 and Ty-3 are the most widely used genes in plant breeding programs. In Cuba, there is only one Ty-1 gene-carrier called Vyta. This work identified the presence of the band related to Ty-2 gene resistant pattern in two characterized materials. For Ty-3 gene, all genotypes showed the susceptible pattern.

 

Key words: tomato yellow leaf curl geminivirus, genetic resistance

 

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RESUMEN

El virus del encrespamiento amarillo del tomate (TYLCV) es uno de los Begomovirus que más afectan las producciones de tomate en Cuba. Actualmente, se han descrito varios genes relacionados con la resistencia. Ty-1, Ty-2 y Ty-3 son los genes que más se han empleado en los programas de mejoramiento. En Cuba, solo se cuenta con una variedad portadora del gen Ty-1, Vyta. En este trabajo se identificó la presencia de la banda relacionada con el patrón resistente del gen Ty-2 en dos de los materiales caracterizados. Para el gen Ty-3 todos los genotipos presentaron el patrón susceptible.

 

Palabras clave: geminivirus rizado amarillo tomate, resistencia genética

 

 

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INTRODUCCIÓN

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es uno de los cultivos hortícolas más importantes del mundo, siendo el segundo del género debido a su papel fundamental en los hábitos alimenticios de una amplia parte de la población mundial (1).
Este cultivo presenta susceptibilidad a una serie de factores bióticos y abióticos que influyen en los rendimientos de las regiones donde es cultivado, lo cual ha estado favorecido por el proceso de domesticación que ha sufrido la especie a lo largo de los años (2).
Se plantea que el tomate es susceptible a más de 200 fitopatógenos de origen fúngico, bacteriano y viral (3), siendo el virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) uno de los patógenos más agresivos para la hortaliza a nivel global (4).
Ante tales efectos en genotipos cultivados, numerosos programas de mejora genética se han pronunciado en la búsqueda e introgresión de genes relacionados con la resistencia, a partir de las especies silvestres del género (5), pues el desarrollo de variedades resistentes constituye una de las alternativas más interesantes a favor de una agricultura más respetuosa con el medio ambiente y el hombre (6).
En la actualidad, se han introgresado varios genes de resistencia al TYLCV en tomate. Tres de ellos, Ty-1, Ty-2 y Ty-3, han estado involucrados en los diferentes mecanismos que utiliza la planta, para atenuar los efectos provocados por las interacciones que ocurren entre los diferentes aislados de TYLCV y otras especies pertenecientes al género Begomovirus con el cultivo (7).
En Cuba, ante la incidencia de esta virosis, surgió como estrategia el desarrollo de un programa de mejora genética en el cultivo y la obtención de la variedad Vyta, portadora del gen Ty-1, para el manejo y control de la enfermedad (8, 9, 10). Sin embargo, en la región oriental del país se ha descrito la presencia de síntomas de virosis en plantas de esta variedad en los campos de producción (11), lo cual induce a la obtención de nuevos materiales genéticos, para contrarrestar los efectos negativos provocados por la enfermedad portadores de otros genes de resistencia. En la colección de trabajo del INCA se cuenta con nuevas accesiones resistentes a otros linajes de la especie del TYLCV.
Considerando los antecedentes expuestos y la necesidad de contar con nuevas y diversas fuentes genéticas para paliar los efectos nocivos del virus, se plantea como objetivo identificar la presencia de algunos de los genes involucrados con la resistencia y determinar el grado de homocigosis de estos, los cuales serían de gran importancia para el programa de mejoramiento genético del cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal empleado en la investigación fueron accesiones descritas como resistentes a aislados virales de TYLCV (Tabla I), donadas por el Centro de Conservación y Mejora de la Agrobiodiversidad Valenciana (COMAV) de la Universidad Politécnica de Valencia, España, el Asian Vegetable Research and Development Center (AVRDC) de Taiwán, el Instituto de Investigaciones Fundamentales de la Agricultura Tropical (INIFAT), el Instituto de Investigaciones Hortícolas “Liliana Dimitrova” (IIHLD) y el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), estos tres últimos de Cuba (10, 12, 13).
Las semillas, cinco de cada genotipo, se sembraron en un cepellón con sustrato estandarizado (14). Las plántulas se mantuvieron en condiciones semicontroladas en casa de cristal, a una temperatura de aproximadamente 230C, humedad relativa entre el 80-85 % y fotoperíodo natural.
Extracción del ADN e identificación de genes. Para revelar la presencia de los genes Ty-2 y Ty-3, el ADN se extrajo a partir de 5 g de cada material vegetal en el estadio fenológico de cuatro hojas verdaderas. Las muestras se maceraron en mortero con ayuda de nitrógeno líquido (15) y se procesaron tres réplicas con tres repeticiones para cada caso. La calidad del ADN se determinó con una lectura a los 260 nm en un espectrofotómetro Ultroespec Plus Spectrophotometer, Pharmacia LKB.
Para su identificación se emplearon los cebadores, las mezclas de reacción y los programas específicos para cada gen utilizando un termociclador (MJ Research, Inc.).
Gen Ty-2: Se utilizaron los cebadores específicos para su identificación:
TO302F: 5´ TGGCTCATCCTGAAGCTGATAGCGC 3´
TO302R: .5´ AGTGTACATCCTTGCCATTGACT 3´
Las reacciones de amplificación se ajustaron a un volumen final de 25 uL. Se utilizó 1U de la enzima Taq ADN Polimerasa, con 2.5 mM de cada dNTP, 2.5 mM de tampón de reacción 10X (Promega), 1.5 mM de MgCl2 (Promega), 2.5 µM de cada cebador y 100 ng de la muestra. El programa de amplificación consistió en un paso inicial de desnaturalización a 94oC durante 5 min., seguida por 35 ciclos de reacción (30s a 94oC de desnaturalización, 1 min. a 550C de anillamiento de los cebadores y 2 min. a 720C de extensión), seguido por un paso de extensión final durante 10 min. a 720C.
Gen Ty-3: Se utilizaron los cebadores específicos para su identificación:
FLUW-25F: 5´ CAAGTGTGCATATACTTCATATTCACC 3´
FLUW-25R: .5´ CCATATATAACCTCTGTTTCTATTTCGAC 3´
Las reacciones de amplificación se ajustaron a un volumen final de 25 uL. Se utilizó 1U de la enzima Taq ADN Polimerasa, con 2.5 mM de cada dNTP, 2.5 mM de tampón de reacción 10X (Promega), 1.5 mM de MgCl2 (Promega), 2.5 µM de cada cebador y 15 ng de la muestra. El programa de amplificación consistió en un paso inicial de desnaturalización a 940C durante 3 min, seguida por 35 ciclos de reacción (30s a 940C de desnaturalización, 1 min. a 530C de anillamiento de los cebadores y 1 min. a 720C de extensión), seguido por un paso de extensión final durante 10 min. a 720C.
Los productos de la RCP se analizaron, para ambos genes, en geles de agarosa al 1.5 %, utilizándose como patrón de peso molecular el marcador de 100 pb (GIBCO). Los geles se observaron en un trasiluminador UV. Los marcadores para la detección de ambos genes fueron codominantes, por lo que se pudo obtener la información de aquellos genotipos homocigóticos (dominantes o recesivos) y heterocigóticos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

El gen Ty-2 se encuentra localizado en el cromosoma once y es de los más empleados por los programas de mejora genética de tomate para TYLCV en el AVRDC de Taiwán (16), así como en la producción de semilla híbrida de nuevos materiales que salen al mercado internacional de numerosas corporaciones asiáticas (17). Se ha planteado que este confiere tolerancia a algunos linajes de TYLCV presentes en el mundo, como son los de Taiwán, norte de Vietnam, sur de la India e Israel, no así para los linajes del norte de la India, Tailandia, Filipinas y América Central (18). Los resultados de las amplificaciones obtenidas con los cebadores específicos se muestran en la Figura 1.

La banda que se relaciona con el patrón resistente (Ty-2/Ty-2) presenta un tamaño de 950 pb y la del patrón susceptible (ty-2/ty-2) un tamaño de 850 pb aproximadamente. Este gen fue introgresado a partir de la accesión B6013 de la especie silvestre S. habrochaites f. glabratum (12), aspecto que corrobora los resultados para los materiales que mostraron el gen en homocigosis recesiva, pues las especies a partir de las cuales se obtuvieron son diferentes a la portadora del gen (2 ,7).
El análisis de la amplificación del gen Ty-2 mostró que los genotipos Vyta, PIMHIR, Mex-121 A, TY 197, TY1 y Campbell 28 mostraron la banda de menor peso molecular que se corresponde con el fenotipo ty-2/ty-2. Los materiales H 24 y CLN 2116B mostraron el fenotipo Ty-2/Ty-2.
En estudios realizados con los mismos cebadores para los genes Ty-2 y Ty-3 y el marcador TG97, para la identificación del gen Ty-1, se observó que la accesión TY197 no presentó ninguno de los tres genes, planteándose que los genes relacionados con la resistencia a TYLCV en este material como en otros obtenidos en el Volcani Center de Israel a partir de la especie silvestre S. peruvianum es desconocido (7). Este es un genotipo del cual se ha descrito un buen comportamiento ante el aislado viral de TYLCV-Ir de Israel y a otras especies de Begomovirus presentes en Brasil (19).
La presencia de este gen se corroboró en los materiales procedentes de Taiwán y la India (16). El estado homocigótico del gen, en estos materiales, representa un elemento a considerar en los futuros programas de mejoramiento genético de la hortaliza en el país, pues la obtención de nuevos genotipos portadores de este gen o de la combinación con otros, fomentará el desarrollo de una resistencia piramidal y más duradera en los nuevos materiales que se obtengan (20).
Estudios realizados con estos materiales en Cuba mostraron un comportamiento resistente ante condiciones de infección no controlada (inoculación en campo abierto) con el aislado cubano (TYLCV-IL [CU]). Los resultados del diagnóstico evidenciaron la ausencia de los síntomas característicos de la enfermedad y la no replicación viral en los análisis de hibridación de ácidos nucleicos realizados (20).
El gen Ty-3 mostró un patrón fenotípico idéntico para todos los genotipos probados, pues la banda que se observó en el gel se corresponde con la del genotipo recesivo para el gen (ty-3/ty-3) (21).
La banda que se relaciona con el patrón resistente presenta un tamaño de 640 pb y la del patrón susceptible un tamaño de 580 pb aproximadamente.
Este gen proviene de dos accesiones, LA 2779 y LA 1932, de la especie silvestre S. chilense, y está localizado en el cromosoma seis, el cual ha sido muy empleado por el programa de mejora genética para Begomovirus de la Florida, por la resistencia que le confiere al TYLCV y al virus del moteado del tomate (ToMoV) (7).
A diferencia del fenotipo que mostró la accesión TY197 en los análisis moleculares y utilizándose una misma combinación de cebadores para la amplificación del gen, se encontró en una línea seleccionada en Marruecos, obtenida a partir del cruce de TY197 con el híbrido Daniella, que esta presentó el gen Ty-3 en heterocigosis (22). Este hallazgo pudo estar favorecido por la combinación de esta línea con el híbrido, pues estudios anteriores enunciaron que la resistencia de TY197 estaba mediada por la acción combinada de varios genes de resistencia introgresados a partir de S. peruvianum (23). Esta es una accesión que ha tenido un buen comportamiento ante los aislados de Begomovirus presentes en Guatemala y que ha sido utilizada por los programas de mejoramiento genético de la hortaliza en este país, que es afectado al menos por siete Begomovirus de genomas bipartitos (21).
Los resultados de los materiales provenientes de S. pimpinellifolium coinciden con otros obtenidos anteriormente. El programa de mejoramiento para TYLCV comenzó en Israel a partir de la accesión LA 121 de esta especie y se interrumpió, pues se encontraron síntomas y pérdidas en el rendimiento en varios de los materiales obtenidos, por lo que la búsqueda fue reorientada hacia otras especies del género. Sin embargo, algunos programas de los grupos de trabajo de Francia y España han mantenido una búsqueda constante de nuevas fuentes de resistencia en esta especie, pero a otros aislados de TYLC, que son menos agresivos que el de Israel y con mecanismos de evasión al insecto vector (4, 7, 24).
Hasta la actualidad, en relación con los programas de mejora genética a TYLCV, se ha trabajado en la incorporación de genes de resistencia en tomate, los que han sido detectados en accesiones de especies silvestres, que van desde las más cercanas hasta las más alejadas de S. esculentum L. (25). Esto ha permitido que a nivel internacional se esté utilizando la combinación de varios de estos genes en un mismo material vegetal, en función de lograr una resistencia más duradera.
Líneas mejoradas mediante la introgresión de diferentes genes de resistencia a partir de accesiones de las especies S. habrochaites, S. chilense y S. peruvianum, han sido las más utilizadas por el nivel de resistencia que presentan ante Begomovirus con genomas mono y bipartitos, así como por su adaptación a los diferentes agroambientes donde han sido probadas (7).
Contar con genotipos portadores de otros genes de resistencia diferentes a Ty-1 en Cuba permitirá trazar nuevas estrategias de mejoramiento para el programa de mejora de la hortaliza, pues la obtención de híbridos, líneas o variedades a largo plazo permitirá implementar o consolidar un manejo integrado de plagas, donde la presencia de materiales resistentes constituye una de las premisas necesarias para el desarrollo de una agricultura más bondadosa con el agroambiente.
La detección de estos genes de resistencia a partir de la técnica de la RCP constituye un avance importante en los programas que surgen para el manejo de la enfermedad (20), pues permitirá la selección asistida de los nuevos materiales que surjan de programas de mejora en condiciones de homocigosis.

REFERENCIAS

1. Florido, M. Evaluación de la tolerancia al calor en muestras de germoplasma de tomate (Solanum L. sección Lycopersicon subsección Lycopersicon) conservado ex situ en Cuba. (Tesis de Doctorado). La Habana. 2007, 100 p.
2. García, E. La resistencia como estrategia de control de virus causantes de amarilleos en tomate. Tesis de Doctorado. Universidad de Málaga. Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Celular Genética y Fisiología. 2008, 238 p.
3. Fooland, M. Genome mapping and molecular breeding of tomato. International Journal of Plant Genomic , 2007, p. 1-52.
4. Pérez de Castro, A., Diez, M. J., Nuez, F. Inheritance of tomato yellow leaf curl virus resistance derived from Solanum pimpinellifolium UPV 16991. Plant Disease, 2007, vol. 91, p. 879-885.
5. Tsutomu, A.; Takahashi, H.; Kodama, M. y Teraoka, T. Tomato as a model plant for plant-pathogen interactions. Plant Biotechnology, 2007, vol. 24, p. 135-147.
6. González-Cabezuelo, J. M.; Tomás, D. M.; Lorente, I.; Abad, J.; Fernández-Muñoz, R.; Moriones, E. y Lozano, R. Marcadores moleculares ligados a la resistencia a TYLCD en tomate. Acta de Horticultura, 2007, no. 48. Sociedad Española de Ciencias Hortícolas. ISBN: 978-84-690-5619-6.
7. Ji, Y. F.; Schuster, D. J. y Scott, J. W. Ty-3, a Begomovirus resistance locus near the tomato yellow leaf curl virus resistance locus Ty-1 on chromosome 6 of tomato. [Consultado 23-2-2009]. Molecular Breeding, 2007, vol. 20. Disponible en: <http://www.springerlink.com/content/fx6j6g355222000x/>.
8. Quiñónez, M.; Fonseca, D. y Martínez, Y. Caracterización molecular de aislados de campo del virus del encrespamiento amarillo de la hoja del tomate (TYLCV). Protección Vegetal, 2007, vol. 22, no. 1, p. 47-56.
9. Martínez, Y. Emergence of Begomovirus in Cuba. Protección Vegetal, 2008, vol. 23, no. 1, p. 11-15.
10. Piòón, M.; Gómez, O. y Cornide, M. T. RFLP analysis of Cuban tomato breeding lines with resistance to tomato yellow leaf curl virus. Acta Hort., 2005, vol. 695, p. 273-276.
11. Verdecia, A. Validación de la variedad de tomate Vyta para consumo fresco con resistencia a geminivirus en áreas productoras de la provincia Granma (Cuba). Alimentaria: Revista de tecnología e higiene de los alimentos, 2003, no. 344, p. 51-54. Disponible en: <http://dialnet.unirioja. es/servlet/articulo?codigo=621222>.
12. Shagarodsky, T. /et al./. Caracterización de una colección del género Lycopersicon frente a la incidencia del virus TYLC (Tomato Yellow Leaf Curl Virus). En: Taller Internacional sobre Recursos Fitogenéticos. Memorias (IV: 2005, nov 2-4: Sancti Spíritus) p. 63-64 ISBN 959-7131-07-02.
13. Vidavsky, F.; Leviatov, S.; Milo, J.; Rabinowitch, H. D.; Kedar, N. y Czosnek, H. Behaviour of tolerant tomato breeding lines (Lycopersicon esculentum) originated from three different sources (L. peruvianum, L. pimpinellifolium and L. chilense) upon early controlled inoculation by tomato yellow leaf curl virus. Plant Breeding, 2006, vol. 117, p. 165-169.
14. Paneque, V. y Calaña, J. Abonos orgánicos. Conceptos y prácticas para su evaluación y aplicación. La Habana: ACTAF. 2004, 54p.
15. Dellaporta, S. L.; Wood. J. y Hicks. J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter, 1983, vol. 1, p. 19-21.
16. Hanson, P. M.; Green, S. K. y Kuo, G. Ty-2, a gene on chromosome 11 conditioning geminivirus resistance in tomato. Tomato Genetics Crop Rep. 2006, vol. 56, p. 17-18.
17. Green-Seeds. 2007. [Consultado 22-1-2009] Disponible en:<http://www.green-seeds.com>
18. AVRDC. Promising tomato lines resist leaf curl viruses. 2006. News AVRDC. Shanhua, Taiwan: AVRDC–The World Vegetable Center. viii, 196 p.
19. Martín. S.; Ribeiro. S.; Moita, A. W.; Moreira, D. J. y Brito, G. Sources of resistance in Lycopersicon spp. to bipartite whitefly-transmitted geminivirus from Brazil. Euphytica, 2001, vol., 122, no. 1, p. 45-51.
20. Dueñas, F.; Martínez, Y.; Álvarez, M.; Moya, C.; Peteira, B.; Arias, Y.; Diez, M. J.; Hanson, P. y Shagarodsky, T. Caracterización agromorfológica y evaluación de la resistencia al TYLCV en nuevos genotipos de tomate (Solanum lycopersicum L.) como apoyo al programa de mejoramiento genético de la hortaliza para la enfermedad. Cultivos Tropicales, 2008, vol. 29, no. 1, p. 53-60.
21. Mejía, L.; Teni, R. E.; Vidavski, F.; Czosnek, H.; Lapidot, M.; Nakhla, M. K. y Maxwell, D. P. Evaluation of tomato germplasm and selection of breeding lines for resistance to Begomoviruses in Guatemala. Acta Hort., 2005, vol. 695, p. 251-255.
22. Salus, M. S.; Martin, C. T. y Maxwell, D. P. PCR protocol for detection of introgression at 25 cM (Ty-3 locus). UW-Madison Team. 2006, 1-3 p.
23. Lapidot, M. y Friedman, M. Breeding for resistance to whitefly-transmitted geminiviruses. Ann. Appl. Biol., 2002, vol. 140, p. 109-127.
24. Alba, J. M. Herencia de los mecanismos de resistencia a araña roja en tomate (Tesis de Doctorado) Universidad de Málaga. Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Vegetal, 2006, 242 p.
25. Czosnek, H.; Lapidot, M.; Polston, J. y Maxwell, D. Tomato yellow leaf curl virus disease. Management, molecular biology, breeding for resistance. Netherlands: Springler. 2007, 439 p.

Recibido: 7 de octubre de 2008
Aceptado: 2 de febrero de 2009