INTRODUCCIÓN
En Cuba se consume un promedio anual de 72 kg de arroz (Oryza sativa L.) por persona, uno de los más altos en América Latina 1. Las importaciones del grano cubren el 66 % de la demanda nacional 2. Esta problemática motivó el desarrollo de nuevas variedades de arroz, más resistentes a los fitopatógenos y con mayor potencial de rendimiento. El cultivar de arroz “INCA LP-7”, desarrollado en el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), es un ejemplo de ello y ocupa el 8 % del área total dedicada al cultivo en el país (682 ha) 3.
El arroz tiene la capacidad fisiológica de absorber solo 50 kg N ha-1 (4. El resto del fertilizante nitrogenado que se aplica al cultivo produce graves problemas de contaminación 5. El empleo de Bacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal (BPCV) se ha venido empleando como una alternativa a la fertilización mineral 6. Los rizobios son BPCV que se han estudiado por la asociación simbiótica que realizan con las plantas leguminosas 7. Sin embargo, en los últimos años se ha constatado que estos microorganismos también promueven el crecimiento de las gramíneas como el arroz 8.
Actualmente, no existen evidencias científicas en Cuba sobre la presencia de los rizobios como parte de la rizosfera de plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7”, lo cual dificulta el desarrollo de bioproductos a base de estos microorganismos que permitan disminuir la fertilización mineral al cultivo e incrementar los rendimientos. El objetivo de esta investigación fue caracterizar posibles rizobios provenientes de la rizosfera de plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7”.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se emplearon 16 aislados bacterianos, provenientes de la rizosfera de plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7” que, presuntivamente, pertenecen al grupo de los rizobios 9.
Caracterización cultural y morfo-tintorial de bacterias rizosféricas, provenientes de plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7”
Para la caracterización cultural, los aislados se cultivaron por agotamiento y por triplicado en el medio Levadura Manitol Agar (LMA) 10 con rojo Congo. Las placas se incubaron durante 48 h a 30 °C. Los parámetros a tener en cuenta fueron: el color, la mucosidad y el tamaño de la colonia. Se tomaron como colonias grandes aquellas cuyo diámetro estuvo entre 2-4 mm, colonias medianas entre 1-2 mm y colonias pequeñas cuyo diámetro correspondiera con 1 mm. La caracterización morfo-tintorial se realizó mediante Tinción de Gram y se determinó la morfología de la célula, la respuesta a la tinción y la presencia de endosporas.
Caracterización bioquímica de bacterias rizosféricas, provenientes de plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7”
Ensayo de la cetolactasa
Los aislados bacterianos se cultivaron por agotamiento y por triplicado en medio Levadura-Lactosa-Agar (LLA) 11 y las placas se incubaron a 30 °C durante siete días. Posteriormente, se añadieron 10 mL del reactivo de Benedict sobre el crecimiento bacteriano y se observó cambios de coloración del medio a los 10 min de incubación a temperatura ambiente. El resultado positivo a esta prueba se consideró ante un cambio de coloración del medio de azul a amarillo y negativo si el medio mantenía la coloración azul.
Producción de ácido y base
Los aislados bacterianos se cultivaron por agotamiento y por triplicado en medio LMA con indicador azul de bromotimol (0,5 % en NaOH 0,016N) y las placas se incubaron durante tres días a 30 °C. El cambio de coloración del medio de verde a amarillo se interpretó como la producción de ácido y de color verde a azul, se consideró como la producción de base 12.
Crecimiento en medios de cultivo libre de nitrógeno
Se prepararon suspensiones de los aislados bacterianos. Para ello, se resuspendieron varias colonias en 1 mL de solución salina de NaCl (0,9 % (m/v)) estéril. Cien microlitros de las suspensiones se inocularon en frascos que contenían 10 mL de los medios semisólidos carentes de nitrógeno 13,14. La inoculación se realizó introduciendo la punta de una micro pipeta en el interior de los medios de cultivo y posteriormente se fue liberando la suspensión bacteriana desde el interior del medio hasta su superficie. Se empleó como control positivo frascos que se inocularon con el mismo volumen de un inoculante a base de Bradyrhizobium elkanii ICA 8001, cepa de referencia en la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) en soya (Glicine max L.) 15.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Poblaciones bacterianas rizosféricas del cultivar de arroz “INCA LP-7”, similares desde el punto de vista cultural, difieren en sus características morfo-tintoriales
Todos los aislados produjeron colonias mucosas en medio LMA. Sin embargo, defirieron en tamaño y coloración (Tabla 1). Resultados similares se encontraron en estudios anteriores con colecciones bacterianas provenientes de frijol chileno (Lablab purpureus (L.) Sweet) y de guisante (Pisum sativum) 16,17.
Aislados | Características culturales | Características Morfo-tintoriales | Producción ácido/base | Crecimiento en medios semisólidos libres de nitrógeno | |
---|---|---|---|---|---|
JMV | Rennie | ||||
4S | Medianas, rosado pálido con centro rosa oscuro, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
4U | Grandes, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
1DD1 | Medianas, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
1DD2 | Medianas, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
1AA | Grandes, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
1LL | Grandes, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G+, no esporulados | ND | ND | ND |
3W | Pequeñas, rosado pálido, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
5FF1 | Medianas, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | base | + | + |
5FF2 | Grandes, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G+, no esporulados | ND | ND | ND |
5O | Medianas, traslúcidas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
5P1 | Pequeñas, blanquecinas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
GG1 | Grandes, traslucidas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
GG2 | Medianas, rosado, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
II1 | Pequeñas, traslucidas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
II3 | Grandes, traslucidas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
II2 | Grandes, traslucidas, mucosas | Cocobacilos, G-, no esporulados | ácido | + | + |
El 87,5 % de los aislados resultaron cocobacilos; Gram negativos y no esporulados. Los aislados 1LL y 5FF2, que constituyen el 12,5 % restante, presentaron características culturales e incluso algunas morfológicas similares al resto. Sin embargo, ambos aislados resultaron Gram positivos. Los rizobios, generalmente, son cocobacilos no esporulados y Gram negativos 18, por lo cual los aislados 1LL y 5FF2 se eliminaron de las determinaciones posteriores que se realizaron en esta investigación.
En la rizosfera de las plantas de arroz del cultivar “INCA LP-7” residen posibles rizobios con atributos positivos en la promoción del crecimiento vegetal
La respuesta a la cetolactasa fue el tercer indicador que se empleó para determinar si los aislados bacterianos en estudio pertenecían al grupo de los rizobios, luego de la caracterización cultural y morfo tintorial. Esta determinación fue por mucho tiempo un carácter fenotípico confiable, que permitió diferenciar la familia Rhizobiaceae del género Agrobacterium. Los rizobios y el género Agrobacterium tienen hábitats similares y comparten características culturales y morfo tintoriales 19. Agrobacterium forma colonias mucosas y semitraslúcidas, a los 2-3 días en medio LMA y la tinción de Gram revela células en forma de bacilos Gram negativos y no esporulados. Este género produce agallas o tumores en las raíces y tallo de las plantas, estructuras muy similares a los nódulos que forman los rizobios en las leguminosas 20.
Todos los aislados que se seleccionaron en este trabajo como posibles rizobios, por sus características culturales y morfo tintoriales, resultaron negativos a la prueba de la cetolactasa. Evidencias científicas han permitido modificar la redistribución de numerosas especies de bacterias a otros grupos taxonómicos, pues constituyen excepciones a la norma que hasta ese entonces estuvo establecida. Por ejemplo, según el Manual de Bergey, especies que anteriormente se identificaron como Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi y Agrobacterium vitis son cetolactasa negativo y Agrobacterium tumefaciens es cetolactasa positivo 21.
Los métodos de biología molecular han permitido un mayor esclarecimiento de estos temas, de manera que estas tres especies de Agrobacterium, se encuentran en la actualidad dentro del género Rhizobium22,23. Teniendo en cuenta éstas y otras evidencias científicas, se hace necesario emplear, además de las pruebas fenotípicas convencionales, la secuenciación del ARNr 16S para identificar los aislados bacterianos asociados a las plantas de ambos cultivares de arroz.
La producción de ácido/base fue otro de los criterios fenotípicos que se estudiaron en esta investigación. Excepto el aislado 5FF1, el resto produjo ácido al medio de cultivo. Los ácidos de origen microbiano actúan como sideróforos, moléculas que captan el hierro del suelo 24. Otros permiten la solubilización del fósforo e incrementa su disponibilidad para las plantas 25. El ácido indol 3-acético y el salicílico también constituyen ácidos que producen las BPCV, que incrementan el crecimiento de las plantas 26 e inducen respuestas defensivas en estas contra el ataque de patógenos 27, respectivamente.
Por otra parte, el crecimiento de los aislados bacterianos en medios de cultivo libres de nitrógeno se empleó como un acercamiento a la capacidad de estos para realizar la FBN. El 100 % de los aislados crecieron en los medios JMV y Rennie (Tabla 1). Estos resultados concuerdan con los que publicaron Quim et al. 26, con bacterias asociadas a plantas de arroz.
Los medios semisólidos carentes de nitrógeno se emplean sobre todo para restringir la búsqueda de microorganismos diazotróficos que se aíslan del suelo, rizosfera o del interior de los tejidos de las plantas 27. A partir de aquí, es necesario aplicar técnicas como la amplificación del gen nifH28 y el ensayo de Reducción del Acetileno (ARA) 29, las cuales permiten tener mayor seguridad de la capacidad de las bacterias para fijar el nitrógeno.
La FBN constituye uno de los mecanismos directos que emplean las BPCV para promover el crecimiento de las plantas 30. Los rizobios se han estudiado fundamentalmente por su capacidad para fijar el nitrógeno, en el contexto de la simbiosis con las leguminosas 31. La presencia de este atributo en los aislados de rizobios que se estudiaron en esta investigación permitiría emplearlos como parte de un biopreparado para arroz y así disminuir la aplicación de fertilizante nitrogenado al cultivo.
CONCLUSIONES
En la mayoría de los aislados provenientes de la rizosfera de las plantas de arroz cultivar “INCA LP-7”, se identificaron aspectos fenotípicos presentes en la familia Rhizobiaceae. La caracterización cultural, morfo-tintorial y bioquímica permiten ubicarlos presuntivamente dentro de los géneros Rhizobium, Ensifer o Shinella. Sin embargo, es necesario combinar estos resultados con técnicas moleculares para confirmarlos. Los métodos moleculares y los estudios fenotípicos se complementan entre sí y constituyen lo que hoy se conoce como la taxonomía polifásica, herramienta que permite una mayor integralidad de los estudios taxonómicos de los microorganismos.