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INTRODUCCIÓN
Stevia rebaudiana Bertoni es una planta herbácea de la familia Asteraceae y originaria del Paraguay. Es conocida como el único edulcorante natural no calórico y es aproximadamente 300 veces más dulce que la sacarosa. Su importancia es especialmente relevante en las condiciones de la sociedad actual donde la demanda se mueve hacia los alimentos más naturales y por otro lado al incremento mundial de enfermedades asociadas a desorden nutricional como Diabetes mellitus (Landázuri y Tigrero, 2009; Ritu y Nandini, 2016; Hossain et al., 2017; Ruiz et al., 2017).
Esta planta se propaga naturalmente por semillas. Sin embargo, el bajo nivel de germinación de las semillas y la pérdida de la viabilidad son factores limitantes para el cultivo de esta especie a gran escala (Khalil et al., 2014; Kilam et al., 2015; Shahverdi et al., 2017).
La micropropagación y propagación por estacas o esquejes constituyen alternativas para contrarrestar estas desventajas. Son ampliamente utilizadas y poseen factibilidad desde el punto de vista económico, de calidad de los propágulos producidos y de satisfacción de la demanda de esta planta (Autade et al., 2014; Oviedo-Pereira et al., 2015). No obstante, es importante establecer la adecuada agrotecnia del cultivo y evaluar los rendimientos de biomasa bajo las condiciones naturales de calidad de los propágulos producidos (Pal et al., 2013; Angelini y Tavarini, 2015).
En Cuba el cultivo de Stevia rebaudiana es reciente y existe muy poca información sobre el manejo agrotécnico necesario en las condiciones edafoclimáticas del país para la producción de hoja seca a escala industrial. Por ello, se hacen necesarios los estudios relacionados con el cultivo de la planta a nivel de cantero y campo en especial de las variables agrotécnicas de mayor impacto en el rendimiento.
Por consiguiente, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la frecuencia de poda en la producción de biomasa y contenido de esteviolglicósidos de Stevia rebaudiana Bertoni var. Morita II en las condiciones edafoclimáticas en cantero, en la provincia de Ciego de Ávila.
MATERIALES Y MÉTODOS
El experimento se desarrolló en el área de Adaptación del Centro de Bioplantas, Universidad de Ciego de Ávila Máximo Gómez Báez.
Material vegetal
Como material vegetal se utilizaron esquejes (brotes con una longitud de aproximadamente 8-10 cm), procedentes de plantas madre de S. rebaudiana de origen in vitro con 120 días de cultivo, las cuales fueron previamente cultivadas en bolsas de polietileno de 1.2 litros de capacidad, que contenían como sustrato una mezcla de suelo rojo y humus de lombriz (1:1 v/v) (Figura 1).
Figura 1 Plantas madre de Stevia rebaudiana procedentes del cultivo in vitro, utilizadas para la obtención de esquejes.
Efecto de la frecuencia de poda en la producción de biomasa vegetal
El experimento se realizó en el mes de octubre de 2018. Para esto se utilizó un cantero de 1.0 x 25.0 x 0.6 m (ancho x largo x profundidad) con suelo Ferralítico Rojo Compactado (Hernández et al., 1999), enriquecido con cachaza en dosis estimada de 20 ton ha-1. El suelo fue mullido manualmente y cubierto en su superficie con polietileno negro para asegurar el control de las plantas indeseables.
Previo a la plantación, los esquejes se pusieron en contacto por la base con polvo enraizador compuesto por Ácido Naftalen Acético (ANA) más Ácido Indol Butírico (AIB) (2000 mg kg-1 c/u) de manera individual e inmediatamente se enterraron en el sustrato a una profundidad de 1-2 cm aproximadamente.
Los esquejes se plantaron en el cantero a doble hilera, en disposición tres bolillo a una distancia de 30 x 35 cm para un total de 165 plantas por cantero y una densidad estimada de 95 238 plantas ha-1 (Figura 2). El riego se realizó cada tres días por aspersión por un tiempo de 2-3 horas (Reis et al., 2016).
Figura 2 Preparación de cantero para la siembra y distancia de plantación utilizadas en esquema tres bolillo.
Se seleccionaron al azar 40 plantas por tratamiento. Se identificaron los tratamientos que consistieron en diferentes frecuencias de poda:
Plantas no podadas (Control)
Plantas podadas cada 30 días.
Plantas podadas cada 60 días.
Plantas podadas cada 90 días.
Las evaluaciones se realizaron durante un ciclo de cultivo de 180 días. Con la frecuencia de poda cada 30 días se realizaron seis podas, tres podas para el tratamiento cada 60 días y dos para cada 90 días. Las plantas no podadas se usaron como control. Se evaluaron un total de 160 plantas, 40 plantas para cada tratamiento (n= 40). Para las podas se cortaron las plantas (ramas y tallos) a una distancia de 10 cm del suelo (Figura 3).
Variables evaluadas
Las evaluaciones se realizaron en cada poda y se describen a continuación:
Altura de la planta: se midió la altura de la planta a partir de los 30 días del corte del ápice para la formación de brotes laterales. Se utilizó una cinta métrica y el resultado se expresó en centímetros (cm).
Número de ramas: se cuantificó el número de ramas por planta.
Porcentaje de floración: se observó la presencia o no de flores por planta por tratamiento para el cálculo del porcentaje de plantas con flores durante un año con frecuencia mensual.
Número de hojas: se cuantificó el número de hojas por rama por planta.
Masa fresca de las hojas y los tallos por planta: las hojas se separaron de las ramas de la planta. Se determinó la masa de las hojas y de los tallos en balanza SARTORIUS TE 412. Se expresó en gramos (g) por planta.
Masa seca de las hojas y los tallos por planta: el total de las hojas de cada planta y los tallos se secaron en estufa (HS 62A) a 70°C durante 72 h. Se determinó la masa en balanza SARTORIUS TE 412 y se expresó en gramos (g) por planta.
Rendimiento de masa seca por hectárea: se estimó a partir de la variable masa seca de las hojas por planta y la cantidad de plantas por hectárea. Se expresó en toneladas por hectárea (t ha-1).
Efecto sobre el contenido de esteviolglicósidos
Extracción y cuantificación de extractos ricos en esteviolglicósidos
Se cuantificó el contenido de esteviolglicósidos en hojas secas de S. rebaudiana recolectadas en cada poda y tratamiento. Las hojas se secaron en la estufa (HS 62A) a 70°C durante 72 h y trituraron en un molino (modelo Mikro-Feinmuhle-Culatti, MFC). Se realizó un extracto acuoso clarificado para cada tratamiento. Se calentaron 10 ml de agua destilada hasta 100 °C y se le añadió 1 g del polvo de hojas secas, con un tamaño de partículas de 0.7 µm y se mantuvieron las proporciones masa/volumen: 1:10 (m/v).
La extracción se realizó durante 3 h en estático. Luego se centrifugó a 21 891 g durante 20 min (centrífuga modelo Heal Force). El precipitado se desechó y el sobrenadante se clarificó con carbón activado (2%) (Arguello-Valle, 2017), para eliminar pigmentos que pudieran interferir en la determinación de esteviolglicósidos. Se agitó por 20 min en agitador vortex (modelo IKA GENIUS3) y se centrifugó a 21 891 g durante 20 min. Esta operación se realizó tres veces. Se utilizaron tres réplicas por poda y tratamiento.
Posteriormente, a 210 nm se determinó la absorbancia de los extractos crudos acuosos clarificados. Las muestras se diluyeron 400 veces. Se realizaron tres determinaciones por cada réplica. Posteriormente estos valores de absorbancia se extrapolaron en una curva de calibración realizada a 210 nm para la mezcla de patrones de esteviósido y rebaudiósido A. El resultado se expresó en mg esteviolglicósidos g-1 MS.
Procesamiento estadístico
En el procesamiento de los datos se emplearon las pruebas estadísticas de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Levene para comprobar los supuestos de distribución normal y homogeneidad de varianzas, respectivamente. Al cumplirse estos supuestos, se aplicó la prueba de análisis de varianza (ANOVA) de efectos fijos y al encontrarse diferencias significativas se aplicó la prueba de comparaciones múltiples DHS de Tukey para p<0.05. En todos los casos se utilizó como procesador estadístico el Statistical Package for Social Sciences versión 21.0.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto de la frecuencia de poda en la producción de biomasa vegetal
Las plantas de S. rebaudiana podadas presentaron tallos más robustos y un follaje más exuberante con un mayor número de ramas que las plantas control. Sin embargo, éstas últimas alcanzaron mayor altura y una ligera tendencia a inclinarse.
La altura de la planta de S. rebaudiana mostró diferencias significativas con respecto al control (Figura 4 A). La poda cada 90 días demostró que las plantas de S. rebaudiana bajo las condiciones y época de estudio alcanzan una altura de 47.0 cm, significativamente superior a los otros tratamientos. Sin embargo, las plantas no podadas o control alcanzaron mayor crecimiento, con 58 cm de altura. Las plantas podadas cada 30 y 60 días no mostraron diferencias significativas. La frecuencia de poda realizada a las plantas cada 30 y 60 días después de plantadas, constituyó un factor limitante para esta variable agronómica.
Respecto al número de ramas por planta, de S. rebaudiana (Figura 4 B) se observó el mayor resultado con la poda cada 60 días (33.8 ramas/planta). Este valor alcanzado fue significativamente superior al resto de los tratamientos. Sin embargo, el tratamiento de poda cada 30 días y el tratamiento control no presentaron diferencias significativas.
Con las podas realizadas cada 60 días (tres podas en total) se pudieron apreciar los mayores valores, con 4000 hojas por planta (Figura 4 C). Cifra significativamente superior al resto de los tratamientos evaluados y al control. Considerando que el esteviósido, se extrae de las hojas de las plantas de Stevia (Montoro et al., 2013; Ahmad et al., 2016; Hinojosa et al., 2017), esta variable puede ser relevante. Además, en las evaluaciones del crecimiento y desarrollo de las plantas, una de las variables más importantes es el número de hojas y el área foliar, ya que se encuentran muy relacionados con la eficiencia fotosintética de los cultivos. Sin embargo, las expresiones fenotípicas de las plantas pueden afectarse por factores ambientales como radiación solar, precipitaciones y temperaturas ya que inciden en los procesos de fotosíntesis, transpiración, alargamiento celular y crecimiento. También influyen la densidad de plantas, así como, la variación de la época de siembra (Angelini y Tavarini, 2015).
En correspondencia con el resultado anterior, la poda cada 60 días fue la más efectiva con valores de 164.73 g de masa fresca por planta (Figura 4 D). La poda realizada cada 30 días no fue positiva para variable agronómica de masa fresca de las hojas por planta, y alcanzó los menores valores con 113.27 g, sin diferencia significativa con el control.
Similares resultados a los anteriores se lograron en la variable masa fresca de los tallos por planta (Figura 4 E). La frecuencia de poda cada 60 días generó los mejores resultados (161.31 g por planta). Del mismo modo, no se evidenciaron diferencias significativas cuando se compararon los resultados del control con la frecuencia de poda cada 30 días.
La masa seca de las hojas es una variable dependiente del número de hojas por planta, de la masa fresca y de la hidratación de las plantas (Kumar et al., 2016). Las respuestas de los resultados de esta variable fueron similares a las mencionadas (Figura 4 F). Los mayores valores se obtuvieron con la frecuencia de poda cada 60 días con valores de 12.5 g por planta, seguida por la frecuencia de poda cada 90 días con valores de 10.20 g por planta y sin diferencias significativas la frecuencia de poda cada 30 días y el control, con los menores valores.
En cuanto a la masa seca de los tallos por planta de S. rebaudiana en condiciones de cantero (Figura 4 G) se pueden apreciar valores significativamente superiores con la frecuencia de poda cada 60 días con 16.57 g por planta. Esta variable es dependiente del número de tallos por planta y de la masa fresca de los tallos (Suárez y Quintero, 2015).
La frecuencia de poda cada 60 días, resultó superior al resto de los tratamientos. Lo cual no se correspondió con los resultados informados por Hossain et al. (2017) los cuales plantean el momento de poda cada 90 días. Sin embargo, Almaguer et al. (2018) señalaron que la poda debe estar entre 40-60 días.
Según los cálculos establecidos a partir de la densidad de plantas por hectárea (ha) y la masa seca de hojas cosechadas por planta en cada uno de los tratamientos se pudo calcular el rendimiento de masa seca por hectárea (Figura 4 H). El rendimiento más alto se alcanzó con el tratamiento de poda cada 60 días con valores de 1.19 t ha-1, seguido del tratamiento de poda cada 90 días con valores de 0.97 t ha-1. De manera general, los rendimientos que se alcanzaron se aproximaron a los señalados por Moraes et al. (2013) quienes, en la Universidad de Misisipi, EEUU, alcanzaron rendimientos de hoja seca en una primera cosecha con intervalo de 60 y 90 días con un valor de 1104.04 kg ha-1 y 1444.54 kg ha-1, respectivamente.
Figura 4 Efecto de la frecuencia de poda en la producción de biomasa vegetal de Stevia rebaudiana var. Morita II en condiciones de cantero. A) Altura de la planta. B) Número de ramas por planta. C) Número de hojas por planta. D) Masa fresca de las hojas por planta. E) Masa seca de las hojas por planta. F) Masa fresca de los tallos por planta. G) Masa seca de los tallos por planta. H) Rendimiento de hojas secas por hectárea. Barras con letras diferentes indican diferencias significativas según pruebas de ANOVA y Tukey DHS para p≤0.05 y n= 40.
La floración en las plantas control se comenzó a observar a partir del mes de noviembre de 2018 hasta el mes de febrero de 2019. En los tratamientos se observó una disminución del número de meses en los cuales las plantas florecieron (Tabla 1). Sin embargo, el mayor porcentaje de floración se alcanzó cuando las plantas se podaron cada 90 días. El resultado puede estar relacionado con el tiempo que tuvieron las plantas para su recuperación, es decir, para su crecimiento y desarrollo. No obstante, la floración solo se observó en los meses de noviembre a febrero en los que los días son más cortos, las noches son más largas y las temperaturas son más frías. La floración es independiente de la frecuencia de poda, siendo más dependiente del fotoperiodo, de la época del año y de las bajas temperaturas (Shahid-Akba et al., 2014). Cuando la planta presenta mayor incidencia de floración el desarrollo vegetativo es menor porque va energéticamente hacia la floración y no al desarrollo de la biomasa (Singh et al., 2014).
Efecto sobre el contenido de esteviolglicósidos
Los mejores resultados en cuanto al contenido de esteviolglicósidos se obtuvieron en el tratamiento de plantas podadas cada 60 días (255.39 mg g-1 MS), con diferencias significativas respecto a la frecuencia de poda cada 30 y 90 días y al tratamiento control sin podar (Tabla 2, Figura 5). Estos resultados se correspondieron con los alcanzados en las variables masa fresca y seca de las hojas. Los esteviolglicósidos, en esta planta se encuentran concentrados en las hojas. En este sentido, Jiménez et al. (2010) evaluaron el contenido de esteviósido y rebaudiósido A en una población de S. rebaudiana cultivada comercialmente y refirieron valores promedios de 91.14 mg de esteviósido por gramo de masa seca y entre 31.10 a 90.02 mg de rebaudiósido por gramo de masa seca. Bayraktar et al. (2016) han referido que la cantidad de esteviolglicósidos por planta en campo es de 23.06 mg por gramo de masa seca. Atendiendo a lo anterior los resultados de este trabajo podrían considerarse elevados. No obstante, S. rebaudiana presenta una alta variabilidad en el contenido de esteviósido y rebaudiósido A debido a que este es un carácter poligénico (Jiménez et al., 2010). Estos efectos de variabilidad pueden ser mitigados cuando se propaga asexualmente (esquejes, micropropagación).
Tabla 2 Efecto de la frecuencia de poda en el contenido de esteviolglicósidos en extractos acuosos clarificados de Stevia rebaudiana var. Morita II en condiciones de cantero.
Los resultados revelaron que la mejor frecuencia de poda de las plantas de S. rebaudiana fue cada 60 días. Los resultados de las variables agronómicas evaluadas fueron superiores a los obtenidos con las podas cada 30 y 90 días, con excepción de las variables altura de la planta y porcentaje de floración.
En Cuba, la planta de S. rebauidiana es poco conocida y poco usada como edulcorante natural. Sin embargo, las condiciones ambientales son propicias para su producción. Se ha informado de su cultivo en la Estación Experimental de Plantas Medicinales de San Antonio de los Baños, provincia Mayabeque (Rodríguez et al., 2007).
