Evaluación del germoplasma de tomate (Solanum L. sección Lycopersicon) conservado Ex Situ en Cuba utilizando prueba In Vitro para predecir las respuestas a altas temperaturas

Screening of ex situ preserved tomato (Solanum L. section Lycopersicon) germplasm in Cuba by using in vitro tests to predict high temperature responses

 

Dra.C. Marilyn Florido^I, Ms.C. Dagmara Plana^II, Dra.C. Marta Alvarez^III y Dr.C. C. Moya^III, Ms.C. Regla M. Lara^IV, Dr.C. A. Caballero^V,

I Investigadora Auxiliar, email: [e-mail]

II Investigadora Agregada

III Investigadores Titulares

IV Especialista del departamento de Genética y Mejoramiento Vegetal

V Investigador Titular del departamento de Matemática Aplicada, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), gaveta postal 1, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.

 

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ABSTRACT

This research work was conducted with the aim of evaluating thermotolerance at tissue level in a representative sample of ex situ preserved tomato (Solanum L. section Lycopersicon subsection Lycopersicon) germplasm in Cuba, besides identifying the most tolerant accessions to be used in plant breeding programs. Thus, cell viability was measured by reducing tetrazolium salt to formazan through dehydrogenase enzyme action in 122 tomato accessions, which were classified for their thermotolerance, taking into account three well known controls: Nagcarlang, Amalia and AN-104-1. Concerning the ex situ preserved germplasm in Cuba, there are thermotolerant accessions, mainly from S. lycopersicum var. Cerasiforme and S. pimpinellifollium, that can be employed in plant breeding programs, to obtain good-behaving varieties and hybrids under these conditions.

Key words: cell viability, heat tolerance, tomato, screening

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RESUMEN

El presente trabajo se desarrolló con el objetivo de evaluar la tolerancia al calor a nivel de tejido en una muestra representativa del germoplasma de tomate (Solanum L. sección Lycopersicon subsección Lycopersicon) conservado ex situ en Cuba e identificar las accesiones más tolerantes para su empleo en los programas de mejoramiento genético. Para ello, se midió la viabilidad celular por reducción del cloruro de trifenil tetrazolio a formazán mediante la acción de enzimas deshidrogenadas en 122 accesiones de tomate, que se clasificaron por su tolerancia al calor atendiendo a tres controles de comportamiento conocido: Nagcarlang, Amalia y AN-104-1. Se pudo comprobar que en el germoplasma que se conserva ex situ en Cuba existen accesiones tolerantes al calor, fundamentalmente de S. lycopersicum variedad Cerasiforme y S. pimpinellifollium, que pueden ser explotadas en los programas de mejoramiento genético, para obtener variedades e híbridos con buen comportamiento en estas condiciones.

Palabras clave: viabilidad celular, tolerancia al calor, tomate, evaluación

 

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INTRODUCCIÓN

Las altas temperaturas afectan el desarrollo de las plantas de tomate, causando serios daños en las estructuras reproductivas, lo que trae como consecuencia deficiencias en el cuajado de los frutos y disminución de la producción (1). Es por ello que estas condiciones constituyen uno de los factores más importantes que inciden en la baja producción de tomate en ambientes tropicales (2), efecto que se multiplica si coincide con períodos lluviosos en los que se incrementa la incidencia de las enfermedades fungosas y el cáncer bacteriano (3).
La capacidad de adquirir termotolerancia en plantas ocurre en condiciones naturales y es un componente de la tolerancia al calor en condiciones de campo.
En los últimos años, varios ensayos relacionados con el estrés al calor han recibido atención considerable, para cuantificar el nivel de termotolerancia celular adquirida en plantas, siendo la prueba de la viabilidad celular (VC) una de las más estudiadas, medida por la reducción del 2,3,5 cloruro de trifenil tetrazolio (4, 5, 6).
Este método asocia la adaptación al estrés con la viabilidad celular y evalúa la cadena de transporte electrónico mitocondrial, basado en el principio de la reducción de la sal de tetrazolio a formazán por acción de las enzimas respiratorias deshidrogenasas. Este ha sido ampliamente utilizado como estimado de la termotolerancia celular en plantas. Así, ya se ha aplicado este procedimiento, para evaluar las diferencias en el grado de tolerancia al calor en accesiones de trigo, pitahaya y girasol (4, 6, 7). Igualmente, otros lo utilizaron para determinar la viabilidad en callos de caña de azúcar sometidos a estrés salino (8) y, además, para evaluar daños por sequía en maíz y algodón (9, 10). Sin embargo, no se han encontrado informes de su uso en el monitoreo de la tolerancia al calor en tomate.
Es por ello que se desarrolló el presente trabajo, con el objetivo de evaluar la tolerancia al calor mediante la valoración in vitro de la viabilidad celular, en una muestra representativa de germoplasma de tomate (Solanum L. sección Lycopersicon) conservado en Cuba.

Materiales y Métodos

El estudio se realizó sobre una muestra de germoplasma de la colección de tomate (Solanum L. sección Lycopersicon subsección Lycopersicon) conservado ex situ en el país, integrada por diferentes especies (Tabla I), donde se incluyeron variedades, líneas, prospecciones y especies silvestres, 48 de ellas procedentes de la colección de trabajo del INCA, 47 del banco de germoplasma del Instituto de Investigaciones Fundamentales en Agricultura Tropical (INIFAT) y 27 de la colección de trabajo de la Estación Experimental “La Mayora” del Consejo Superior de Investigaciones Científicas de España (CSIC). Estas accesiones representan el 14,28 % de las presentes en la colección nacional, pues en total se cuenta con 854 accesiones (11).

Para su desarrollo, se pregerminaron semillas de las 122 accesiones de tomate en placas de Petri con agua destilada hasta la emergencia de las radículas. Posteriormente, estas se transfirieron a cepellones de 196 alveolos de 30 cm3 de capacidad, que contenían una mezcla de cachaza: zeolita y suelo Ferralítico Rojo compactado (12) en proporción 1:2:1, a razón de seis plantas por accesión, mediante un diseño completamente aleatorizado. Los cepellones se ubicaron en cuartos de crecimiento a temperatura controlada de 25 ± 2°C, humedad relativa del 80 %, fotoperíodo de 16/8 h luz/oscuridad e intensidad de luz de 200 µmol fotones.m-2.s-1.
A los 15 días después de germinadas las plántulas, se tomaron al azar muestras de hojas que se transportaron al laboratorio para realizarles el análisis de viabilidad celular correspondiente. Para el análisis se escogió la temperatura que mejor diferenciación presentó en evaluaciones previas de VC, efectuadas con diferentes tratamientos de calor en los cultivares Nagcarlang y Campbell-28 (datos no mostrados). Estos ensayos se realizaron dos veces en el tiempo.
Para el análisis de VC por reducción del cloruro de 2,3,5 trifenil tetrazolio (TTC), se tomaron muestras al azar de la segunda hoja verdadera de las diferentes accesiones en estudio y se les extrajeron tres discos de aproximadamente 45 mm de diámetro. Los discos de hojas se ubicaron en viales de 10 mL que contenían 100 µL de agua destilada, para evitar la deshidratación del tejido. Se colocaron seis viales a 43°C durante 90 minutos en baño de María termostatado, mientras los seis viales controles se mantuvieron a 25°C.
Posterior al tratamiento térmico, a las diferentes muestras se les añadió 2 mL de solución de TTC (0,8 % m/v disueltos en tampón fosfato 0,05 M pH 7,4 y 0,5 mL.L-1 de TWEEN-20), que fueron infiltrados en el tejido con ayuda de una bomba de vacío, aproximadamente durante dos minutos, considerándose infiltrados cuando permanecieron en el fondo del vial después de realizado el vacío. A continuación, estos se taparon y ubicaron en total oscuridad a 25°C toda una noche. Al día siguiente, la solución se drenó y los discos foliares se removieron y enjuagaron con agua destilada. Seguidamente, se les agregó 2,5 mL de etanol al 95 %, para extraer el formazán producido por reducción del TTC y los tubos se retornaron a la oscuridad por 24 h a 25°C.
La cantidad de formazán se determinó en un espectrofotómetro a 530 nm (Zuzi UV 4200) y la VC por el porcentaje de reducción del TTC a formazán, utilizando la fórmula descrita a tal efecto (4):
VC (%)= DO estrés x 100
DO control
Donde:
DO estrés: densidad óptica de tratamientos de estrés (43°C durante 90 min.) a 530 nm
DO control: densidad óptica de tratamientos controles (25°C durante 90 min.) a 530 nm.
Los datos de VC (%) se procesaron tomando los valores promedio y el intervalo de confianza para cada accesión, que se clasificaron de acuerdo con las clases establecidas en base a los intervalos de confianza de tres controles de comportamiento conocido.
Como control tolerante se utilizó la accesión Nagcarlang, de reconocida tolerancia al calor por sus altos porcentajes de fructificación, la respuesta fisiológica a este estrés y sus elevados valores de viabilidad del polen (13); como control intermedio se utilizó la variedad Amalia, obtenida por programa de mejoramiento genético en el INCA, la cual presenta tolerancia intermedia al calor, mientras la variedad AN-104-1, recientemente introducida, se empleó como control susceptible, por presentar poca adaptación al clima cubano, así como valores bajos de germinación y fertilización del grano de polen (3).
Se formaron tres clases, cuyos límites se establecieron según los intervalos de confianza correspondientes a los tres controles seleccionados y se adicionaron nuevas clases, para ubicar las accesiones cuyos valores quedaban fuera de los intervalos de confianza de los controles, lo que permitió realizar la clasificación de las 122 accesiones, ubicándolas de acuerdo con sus intervalos de confianza para el carácter VC en las clases pre-establecidas para estos.

Resultados y Discusión

 

El análisis de VC por reducción del TTC mostró diferencias apreciables en las tres accesiones escogidas como controles (Nagcarlang, Amalia y AN-104-1), empleando sus intervalos de variación para la formación de las clases 1, 3 y 5 (Tabla II), y creándose tres clases nuevas (2, 4 y 6), con el fin de abarcar todo el rango de variación del carácter para las 122 accesiones en estudio.

De acuerdo con los resultados, solo 24 accesiones no pudieron ser clasificadas estrictamente en una clase (Tabla III), ya que por sus intervalos de confianza abarcaron dos clases contiguas; en cambio, las 98 accesiones restantes (80,33 % de las evaluadas) presentaron una ubicación definida dentro de las seis clases establecidas.
Como se observa en la Tabla III, el análisis de VC por reducción del TTC mostró diferencias apreciables en el comportamiento de las accesiones. Este carácter varió entre 38,59-85,79 %, con un valor medio de 66,59 %, el cual se encuentra en el intervalo de confianza de la variedad Amalia.
Dentro de las clases formadas se destaca la número 1, compuesta por las accesiones de S. lycopersicum P-1073 y P-1896, Mex-12, P-1634 y P-531 de S. lycopersicum variedad Cerasiforme y BG-56 de S. pimpinellifollium, que presentaron porcentajes de VC en el rango de variación de la accesión Nagcarlang de reconocida tolerancia al calor (13).
La clase 2 quedó conformada por 45 accesiones, donde se incluyeron las de S. lycopersicum variedad Cerasiforme y S. pimpinellifollium, así como algunas prospecciones realizadas en el país, que presentaron características intermedias entre las accesiones de las clases 1 y 3.
En la clase 3 se ubicaron conjuntamente con la variedad Amalia, 34 accesiones de S. lycopersicum, entre las que se encontraron Sapo Grande, variedad local de Holguín, así como A-32-1, L-10-3, Lignon, INCA-17, INCA-9(1) y Mariela, obtenidas en diferentes programas de mejoramiento genético del país y que presentan adaptación intermedia a las condiciones tropicales (3, 14, 15).
La clase 4 quedó representada por 21 accesiones, donde se incluyeron las variedades INCA-33, Campbell-28, HC-3880 y MP-1, mientras la clase 5 se formó por 13 accesiones con comportamiento similar a la AN-104-1. De igual forma, las variedades CC-2781, Ciudad Real, MP-1 y Santa Clara se ubicaron en esta clase, la que presentó susceptibilidad al calor evaluado por este método, solo superada por la accesión C-28, procedente de la Estación Experimental “La Mayora” de Málaga, España, que se ubicó en la clase 6, por presentar el más bajo valor de VC.
Es de destacar que el método de VC evaluado por la reducción del TTC a formazán, por acción de las deshidrogenasas, ha sido ampliamente utilizado, como un estimado de viabilidad del tejido en las células de las plantas, para evaluar la tolerancia al calor en cultivos como trigo, girasol y pitahaya (4, 6, 7), daños por frío en plántulas de arroz (16) y tolerancia a la salinidad en caña de azúcar (8); en cambio, no se han encontrado estudios de VC relacionados con el monitoreo de la tolerancia a estrés ambientales en tomate.
Estos resultados demuestran que la prueba de VC, medida a través del método de reducción del TTC, puede ser de gran ayuda en el monitoreo del germoplasma de tomate, para detectar accesiones con tolerancia al calor en el cultivo, siempre y cuando exista correspondencia entre estos y los estudios a nivel de planta completa, y confirmaron que existen aún fuentes de tolerancia al calor en el germoplasma de tomate, sobre todo en accesiones pertenecientes a S. lycopersicum variedad Cerasiforme y S. pimpinellifollium, que no han sido explotadas para incrementar el grado de tolerancia al calor de las variedades comerciales que se utilizan actualmente.

 

Referencias

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3. Álvarez, M.; Florido, M.; Plana, D. y Moya, C. Informe final del proyecto: Búsqueda y empleo de marcadores en tomate para la tolerancia al estrés de calor y a nematodos PNCT Biotecnología Agrícola. Código: 00300176. INCA. 2005. Cuba.
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Recibido: 12 de marzo de 2009
Aceptado: 31 de Julio de 2009