CIENCIA ANIMAL

Estabilidad de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 en diferentes condiciones de temperatura

Grethel Milián^{1  *}  , Ana J. Rondón¹  , M. L. Pérez²  , Yordanys Martínez¹  , R. Boucourt⁴  , Marlen Rodríguez¹  , A. Beruvides¹  , Yadileiny Portilla³ 

¹Universidad de Matanzas. Autopista Varadero Km 3 ½, Matanzas, Cuba.

²Universidad Estatal Amazónica. Km. 2 ½. Vía a Tena (Paso Lateral), Puyo, Pastaza. Departamento de Ciencias de la Tierra. Ecuador.

³Universidad Autónoma de España, Madrid, España.

⁴Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24. San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba.

RESUMEN

En la producción intensiva pecuaria no se cuenta con todas las condiciones de almacenamientos para la conservación de productos biológicos. De ahí que se propone como objetivo de esta investigación verificar la estabilidad de tres aditivos zootécnicos: SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 a temperatura ambiente (24± 3 ºC) y en refrigeración (4±8 ºC). Para ello se realizaron tres experimentos: 1) calidad microbiológica de los aditivos, 2) viabilidad de las endosporas y 3) dinámica de pH. Los resultados obtenidos revelaron la no presencia de microorganismos contaminantes en los aditivos, tales como coliformes fecales y totales, Pseudomonas auruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella. El conteo de levaduras (<10³mL) y hongos (<10UFC.mL^-1), permisibles para productos de consumo animal. La viabilidad de endosporas no mostró diferencias en ambas temperaturas (16 Log UFC.mL^-1). Sin embargo, el pH arrojo diferencias (P<0.05) entre la hora inicial y el séptimo día para ambas temperaturas [ambiente: C-31:6.38/5.70; C-34:6.38/5.74; E-44:6.38/5.77 y refrigeración: C-31:6.38/4.52; C-34:6.38/4.50; E-44:6.38/4.49]. Se concluye que no existe diferencia para ambas temperaturas, lo que hace viable la conservación de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 en ambas condiciones.

Palabras-clave: conservación de productos biológicos; Bacillus subtilis; viabilidad de endosporas

INTRODUCCIÓN

En la actualidad se trabaja por lograr buenas prácticas que garanticen un mejor aprovechamiento de los alimentos por parte de los animales con el fin de incrementar la productividad (^{Toledo et al. 2018}). Dentro de estas prácticas se encuentra la administración de microrganismos seguros y estables para aumentar la resistencia a enfermedades y mejorar el estado nutricional de los animales. Los probióticos se postulan como una alternativa potencial de reemplazo a los antibióticos utilizados como subterapéuticos, a modo de promotores de crecimiento. Su ventaja es que no dejan residuos en los huevos ni en la carne de las aves y no generan riesgo de resistencia antibiótica en la microbiota humana (^{Arteaga et al. 2018}). Sin embargo tienen como desventaja sus altos precios y estabilidad en el tiempo (^{Pérez y Sablón 2017}).

La elección de un método adecuado de conservación, resulta importante para mantener intactas las características de cualquier producto biológico e idoneidad (^{Caicedo y Valle 2017}). Se conoce de la existencia de diferentes métodos de conservación de productos con efecto probióticos como son la liofilización, microencapsulación, y el secado por aspersión, entre otras, con el fin de mantener sus características extrínsecas (^{Zhang et al. 2015} y ^{Rueda et al. 2016}). Según ^{Rodríguez et al. (2016)} y ^{Molina (2016)} uno de los elementos que afecta la supervivencia de los microorganismos y conservación en el tiempo es la temperatura y el pH. Estos dos indicadores se reportan como métodos de conservar la viabilidad de productos biológicos (^{Montañez y Castro 2006}). De ahí que el objetivo de esta investigación consistió en verificar la estabilidad de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 en condiciones de temperatura ambiente y refrigeración.

MATERIALES Y MÉTODOS

Producción de los aditivos zootécnicos. Los aditivos zootécnicos se obtuvieron en el Centro de Estudios Biotecnológicos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Matanzas. Se siguió la metodología propuesta por ^{Milián et al. (2017b)}. Se trabajó con las cepas C-31, C-34 y E-44 de Bacillus subtilis sub especie subtilis aislada e identificadas por ^{Milián et al. (2014)}.

Para verificar la estabilidad de estos aditivos zootécnicos a temperaturas ambiente (24 ± 3 ºC) y en refrigeración (4±8 ºC), se hizo la prueba de estante, se tomaron 15 frascos de ambas temperaturas y se procedió a medir los siguientes parámetros:

1. Calidad microbiológica de los aditivos. Para aseverar la calidad microbiológica de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 para su uso en animales, se procedió al conteo de microorganismos contaminantes según las normas vigentes, descritas para los estudios de calidad Microbiológica de los Alimentos de Consumo Humano y Animal NC-ISO según ^{Bennett y Lancette (2007)} (tabla 1). Este muestreo se realizó en ambas temperaturas, las muestras fueron tomadas al inicio (1er día) y final del experimento (180 días).

Table 1 Microbiological tests for determining contaminant microorganisms 

Microbiological tests	Reference NC- ISO
Recount of total and fecal coliforms	4832: 2010
Recount of Pseudomonas auruginosa	4833-1: 2014
Recount of Staphylococcus aureus	6888-1: 2003
Recount of Bacillus cereus	4833-1: 2014
Counting of Salmonella in 25 mL	6579: 2008
Counting of Enterobacterias	4832: 2010
Recount of viable yeasts per mL	7954:2002
Recount of fungi	7954:2002

2. Viabilidad de las endosporas. Se tomaron las muestras a los 1, 7, 30, 60, 90 y 180 días) y se sembraron en placas con agar nutriente. La incubación se realizó a 37 ºC durante 24 horas en condiciones de aerobiosis. El conteo de microorganismos se realizó a través del número de unidades formadoras de colonias (UFC). Se determinó por conteo visual de colonias en placas con agar nutriente.

3. Dinámica del pH. Para determinar la dinámica del pH en ambas temperaturas, se tomaron muestras a los 1, 7, 30, 60, 90 y 180 días, y se efectuaron tres repeticiones. La medición de los valores de pH se realizó en un pHmetro digital (Sartorius Meter PP-25).

Procesamiento estadístico. Para el análisis de los datos se utilizó el software estadístico INFOSTAT, versión 2012 (^{Di Rienzo et al. 2012}). Los análisis de varianza se realizaron para verificar diferencias entre las medias, con nivel de significación de P < 0.05. La prueba ^{Duncan (1955)} se aplicó para realizar las comparaciones múltiples entre las medias, en los tratamientos viabilidad de las endosporas y dinámica de pH.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Calidad microbiológica de los aditivos zootécnicos. Los resultados del estudio de calidad microbiológica de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44, en las dos temperaturas estudiadas: ambiente (24 ± 3 ºC) y refrigeración (4±8 ºC) no arrojaron la presencia de agentes microbianos contaminantes. Los recuentos de levaduras y hongos estuvieron en los rangos permisibles (levaduras: <10³ mL y hongos: < 10UFC.mL^-1) para el consumo de productos biológicos.

Estos resultados se pueden asociar a la capacidad que tiene el género Bacillus de producir una amplia variedad de sustancias antimicrobianas, todas de naturaleza proteica, que difieren en su modo de acción y estructura química, las que se vierten hacia el exterior de las células, lo que permite establecerse y de esta forma inhibir la presencia de microrganismo patógenos en un producto biológico, así como, la producción de peróxido de hidrógeno, el cual se reconoce como inhibidor del crecimiento de bacterias Gram negativas.

Dicha investigación se corresponde con lo que declararon ^{Flores et al. (2015)} acerca de los aditivos zootécnicos, que si bien es cierto que los Lactobacillus, levaduras u otro grupo de microorganismos pueden tener un potencial probiótico, es imprescindible evaluar su calidad microbiológica, durabilidad en el tiempo y componentes de cada producto que se emplee.

En tal sentido, investigaciones realizadas por ^{Milián et al. (2017a)} y ^{Rodríguez (2017)} informaron que una de las ventajas del género Bacillus es la capacidad de producir bacteriocina de tipo LFB 112 y los lipopéptidos Surfactin y Mycosubtilin los cuales inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas, tales como E. coli, Salmonella spp., C. perfringens, Streptococcus spp., S. aureus, Pasteurella multocida, y P. aeruginosa. Los resultados se encuentran en línea con lo antes referido, ya que no se observó la presencia de ninguno de estos patógenos en los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44, por lo que se puede deducir que las bacteriocinas producidas por B. subtilis hicieron su efecto.

Resultados homólogos a los derivados en este trabajo, fueron los reportados por ^{Molero et al. (2017)}, al evaluar la calidad microbiológica y vida útil de bebidas probióticas fermentadas a base de lactosuero, donde obtuvieron alto nivel de inocuidad, gracias a un recuento bajo de aerobios mesófilos y ausencia de coliformes totales, fecales y S. aureus.

Estudios similares realizaron ^{Rondón (2009)} y ^{Pérez et al. (2016)} a los aditivos zootécnicos PROBIOLACTIL® y PROBIOLEV® donde obtuvieron resultados análogos a esta investigación. El recuento de coliformes fecales y totales, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, y Bacillus cereus, en todos los casos fue negativo; hongos (< 10 UFC/mL^-1), levaduras (<10³/mL) y Salmonella spp. (no presencia).

Los niveles de levadura obtenidos para los tres aditivos están en el rango permisible (<10³mL), se infiere que su acción inhibitoria tuvo un efecto en la calidad de los aditivos como agente antibacteriano. Las levaduras presentan en sus paredes celulares oligosacáridos de manano (MOS), los que limitan la adherencia de las lectinasas a los carbohidratos y reducen la colonización de patógenos como E. coli y Salmonella spp. Muchos autores refieren el accionar de las levaduras como inhibidores de microorganismo patógenos (^{Alcázar et al. 2016} and ^{Rodríguez 2017}).

Viabilidad de las endosporas. La viabilidad de las endosporas en los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44, no arrojan diferencias significativa en cuanto al conteo de endosporas (16 Log UFC.mL^-1) en las temperaturas ambiente (25 ± 3 ºC) y refrigeración (4±8 ºC). Esto se explica por la capacidad que tienen las endosporas bacterianas de sobrevivir en condiciones extremas. Reportes de ^{Espitia et al. (2014)} así lo demuestran, cuando definieron que las esporas de Bacillus contienen una gran cantidad de proteínas pequeñas que resisten a cambios bruscos de temperaturas, accionar frente a ácidos, formaldehidos y a técnicas de conservación entre otros.

^{Caicedo y Chacón (2017)} refieren que las cepas de B. subtilis posee un mecanismo de percepción de cuórum (quorum sensing) que consiste en la percepción de la densidad celular, es decir que permite a las bacterias actuar de manera coordinada, dando la característica de supervivencia ayudándolas a mantenerse en la naturaleza, ya que responde a las condiciones ambientales debido a la disponibilidad de nutrientes. Este mecanismo se debe gracias a los péptidos que son los que controlan la expresión de genes involucrados en la esporulación.

Otras investigaciones en el campo de la viabilidad de las endosporas son reportadas por ^{Raisman y González (2013)} quienes refieren que cepas de Bacillus sphaericus y Bacillus permians bajo determinadas condiciones, la viabilidad de las esporas es tan prolongada, que cabe la posibilidad de plantearse que las mismas puedan sobrevivir indefinidamente.

Se reportan mundialmente la existencia de muchos métodos para conservar la viabilidad de los productos biológicos. Dentro de estos métodos se encuentra la criopreservación la cual resulta adecuada y es, después del método de liofilización, el más conveniente para garantizar la viabilidad de bacterias en el tiempo (^{Bagatolli 2017}).

^{De Araujo (2016)} referenció que la microencapsulación bajo la técnica de secado por aspersión, es una alternativa para mantener la integridad de las cepas probióticas. Sus estudios reportan 72% y 70% de supervivencia de bacilos y lactobacilos, respectivamente.

^{Gutiérrez (2016)} definió que una de la técnica más utilizada en la industria para conservar productos biológicos, por su alta reproducibilidad y economía, es el secado por aspersión. Dicho autor cuando microencapsuló a cepas de Bacillus megaterium, Bacillus sphaericus y Bacillus polymyxa; Lactococcus lactis y Lactobacillus delbruecki sub bulgaricus, logro una viabilidad por 30 días de almacenamiento.

Dinámica del pH. Los resultados del comportamiento del pH se muestran en la figura 1. Para los tres aditivos se observa como baja el valor del pH al 7 día con respecto a su valor inicial en las dos temperaturas [ambiente (25 ± 3 ºC) y refrigeración (4±8 ºC)] y a partir de ahí se mantiene estable hasta el final del muestreo.

La literatura que aborda la temática de los probióticos expone que una de las características de los aditivos con cultivos de Bacillus spp. es de favorecer el incremento de los lactobacilos. Por lo que la presencia de bacterias ácido lácticas (BAL) pudiera incidir en este resultado. Además la producción de enzimas o algún tipo de metabolito secundario producido por el bacilo. ^{Nguyen (2017)} y ^{Nguyen y Nguyen (2017)} plantearon que las BAL son altas productoras de ácidos orgánicos, los cuales disminuyen el pH y previenen la colonización por bacterias indeseables.

pH ^a,b,c different letters differ at *P<0.05 (^{Duncan 1955}), SE±0.01

Figure 1 Dynamics of pH of the zootechnical additive SUBTILPROBIO® C-31, C-34 and E-44 at room temperature (25 ± 3 ºC) and refrigeration (4±8 ºC) 

^{Adedeji et al. (2011)} y ^{López et al. (2013)} definen que el pH se relaciona directamente con los procesos degradativos que ocurren durante la conservación. En este sentido, cuando un producto biológico alcanza valores de pH entre 3,8 y 4,2 se logra su estabilidad. Esta condición hace que ocurra una restricción de la actividad de las enzimas proteolíticas y la supresión de enterobacterias y Clostridium. El producto evaluado está en el rango 4 y 5.

^{Powthong y Suntornthiticharo (2015)} refieren que la presencia de las BAL en los productos biológicos garantiza la seguridad y estabilidad para su uso en la alimentación animal. Las BAL son microorganismos que tienen diversas aplicaciones y una de las más importantes lo constituye la biopreservación y la calidad de las características sensoriales de los alimentos. Lo referido por dichos autores se corrobora con los resultados obtenidos por ^{Milián et al. (2013)}, al evaluar los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 en indicadores microbiológicos in vivo en pollos de ceba EB24, donde obtuvieron incrementos en el conteo de Lactobacillus spp. y disminución de los coliformes a nivel de los ciegos a los 21, 35 y 42 días de muestreo.

Investigaciones reportadas por ^{Rendó et al. (2014)} refieren que cuando el producto biológico obtenido es adecuado, los azúcares del medio se convierten en ácido láctico y acético principalmente, responsable de la pronta caída del pH, el cual inhibe el crecimiento de microorganismos patógenos que son los causantes de grandes pérdidas de alimentos biológicos para animales. Los resultados emanados en está investigación permiten correlacionar lo antes expuesto, ya que el medio de cultivo que se utilizó para la elaboración de los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44, se formuló con: miel final como fuente de carbono, que aporta glucosa, fructosa y sacarosa (^{Milián et al. 2017b}).

Los resultado obtenidos a lo largo de la investigación se encuentran en línea con los reportes de ^{Pérez et al. (2011)} cuando evaluaron la estabilidad en el tiempo del PROBIOMEX®, producto de exclusión competitiva a base de bacterias lácticas y Bacillus spp., con resultados favorables y similares con los obtenidos en esta investigación. Esta mezcla demostró una elevada capacidad de crecimiento y estabilidad durante el almacenaje por un periodo de 30 días en las mismas condiciones de refrigeración y ambiente.

Fueron similares los resultados obtenidos por ^{García et al. (2013)}, cuando evaluaron el aditivo zootécnico PROBICID y demostraron que se puede utilizar y almacenar a 30 ºC hasta 6 meses.

Los resultados de esta investigación arrojan la posibilidad real que tienen los aditivos zootécnicos SUBTILPROBIO® C-31, C-34 y E-44 para su conservación en ambas temperaturas hasta los 180 días, ya que no se producen afectaciones biológicas o químicas que interfieran en su calidad.

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Recibido: 12 de Noviembre de 2018; Aprobado: 02 de Julio de 2019

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