CIENCIA DE LOS PASTOS

Análisis de forma de cladodio del clon de cactus de forraje Giant Sweet (Nopalea cochenillifera) con el uso de puntos de referencia anatómicos

L. R. R. Lucena^{1  *}  , M. L. M. V. Leite¹  , V. J. L. P. Simões¹  , J. L. P. S. Izidro¹  , J. B. Simplício¹ 

¹Universidade Federal Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Serra Talhada, Serra Talhada, PE, CEP: 56909-535, Brasil

RESUMEN

El cactus tiene alto potencial como forraje alternativo en regiones semiáridas, debido a su gran capacidad para la producción de fitomasa, grandes reservas de agua y facilidad de propagación. Para la mayoría de las plantas, uno de los factores clave de la producción de biomasa es el área foliar, ya que esto determina la capacidad de absorción y uso de la radiación solar en el proceso fotosintético. En el cactus de forraje esta función se realiza en las cladodios. El objetivo de este estudio fue comparar la forma de los cladodios de Nopalea cochenillifera utilizando puntos de referencia anatómicos. Se utilizó un diseño de bloques al azar con tres réplicas en el clon de cactus forrajero, “Giant Sweet”. Para determinar la forma media de los cladodios, se recolectaron 174 de ellos al azar, se fotografiaron y se almacenaron en archivos de imagen jpeg. Las imágenes se marcaron con 12 indicadores anatómicos. Se usaron análisis de formas estadísticas, discriminantes y de conglomerados para evaluar las diferencias, discriminar y comparar grupos de formas de cladodios. El método de agrupación encontró tres grupos de cladodios. Para los cladodios, la tasa de aciertos general creada por el análisis de la función discriminante fue de 97,7%. El análisis de forma, presentó alto poder discriminante y puede considerarse como descriptores potenciales para identificar el orden de los cladodios, por lo que no es necesario ir al campo, y disminuir costos y tiempo para este proceso.

Palabras-clave: cactus; análisis multivariado; Nopalea cochenillifera; análisis de formas

INTRODUCCIÓN

Las especies adaptadas a ambientes áridos y semiáridos, como los cactus forrajeros (Nopalea spp. y Opuntia spp.), pueden contribuir al aumento del rendimiento de la biomasa en las áreas agrícolas, mejorando así la eficiencia del uso de los recursos naturales locales (^{Diniz et al. 2017}).

Los cactus ofrecen forraje alternativo en regiones semiáridas debido a su gran capacidad para la producción de fitomasa, alto valor energético, riqueza en contenido de carbohidratos no fibrosos, grandes reservas de agua y facilidad de propagación (^{Freire et al. 2018} y ^{Pereira et al. 2018}). El forraje de cactus presenta metabolismo fotosintético de CAM (metabolismo ácido de las crasuláceas), con cierre de estomas durante el día y asimilación de carbono en la noche, lo que proporciona mayor capacidad de adaptación a los factores abióticos (^{Santos et al. 2016} y ^{Souza Filho et al. 2016}). Para la mayoría de las plantas, uno de los factores clave de la producción de biomasa es el área foliar, ya que esto determina la capacidad de absorción y uso de la radiación solar en el proceso fotosintético. El cactus de forraje posee cladodios que son los que asumen esta función (^{Lucena et al. 2018}).

La variedad de adaptaciones anatómicas y morfofisiológicas que poseen los cactus forrajeros contribuye al gran éxito agroecológico de este cultivo, ya que su uso altamente eficiente del agua los hace adecuados para las condiciones ambientales con altas tasas de evaporación atmosférica y contenido reducido de agua en el suelo. (^{Hartzell et al. 2018}).

En los últimos años, el estudio cuantitativo de la biología de la forma anatómica también se ha movido hacia la morfometría a través del estudio de la variación de la forma y su covariación con otras variables (^{Adams et al. 2004}). Un enfoque común para el análisis de formas, la morfometría geométrica, cuantifica la forma utilizando coordenadas de puntos de referencia para registrar las posiciones relativas de los puntos morfológicos, las curvas de contorno y las superficies.

Se han realizado análisis de formas morfométricas y geométricas con el uso de un conjunto de puntos de referencia de dos o tres dimensiones (un conjunto de coordenadas características de una forma) en cada especie, con registros de las posiciones relativas de las ubicaciones correspondientes anatómicamente (^{Adams et al. 2004}). A partir de estas coordenadas, se obtuvo un conjunto de variables de forma que se pueden usar en el análisis estadístico multivariado para abordar una amplia gama de cuestiones biológicas que incluyen patrones de variación de forma y sus cambios (^{Rohlf 1999}).

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue comparar la forma de los cladodios de Nopalea cochenillifera con el uso de indicadores anatómicos y análisis estadístico de formas.

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se llevó a cabo desde marzo de 2016 hasta octubre de 2018. Según la clasificación de Köppen, el clima de la región es BSwh, llamada clima semiárido, caliente y seco. La precipitación media anual, la temperatura del aire y la humedad relativa son 632.2 mm, 26 ºC y 60%, respectivamente (Leite et al. 2019), con una demanda atmosférica de 1,800 mm año^-1, lo que resulta en un déficit de 1,143 mm año^-1 (^{Silva et al. 2015}).

Los suelos locales son típicos Haplic Cambisol Ta Eutrophic (clasificación estadounidense), y se recogieron muestras para el análisis de los primeros 20 cm. El análisis mostró que tenía las siguientes características: pH (agua) = 7.20; P (extractor Mehlich I) = 40 mg dm^-3; K ⁺ = 0,45; Ca^{2 +} = 5,3; Mg^{2 +} = 1,1 y Al³⁺=0.0 cmolc dm^-3, respectivamente (^{Leite et al. 2017}). Luego, se aplicó la fertilización orgánica con 40 t ha^-1 de estiércol bovino.

Se utilizó un diseño de bloques al azar con tres réplicas, con el clon Giant Sweet del cactus forrajero Nopalea cochenillifera (L.) Salm-Dyck. La unidad experimental (área de 8,4 m²; 4,2 m x 2,0 m) estaba compuesta por tres surcos de cactus, con un espacio entre filas de 1,40 (85714 plantas ha^-1). Se adoptó un sistema que asemeja un mazo de barajas, con los cladodios plantados a lo largo del surco, con una planta superpuesta a la otra. Se eliminaron las malas hierbas del área y esta se mantuvo sometida a condiciones naturales de lluvia durante todo el ciclo del cultivo. Las evaluaciones se realizaron a los 720 días de la siembra.

Para determinar la forma media de los cladodios, se recolectaron al azar 174 cladodios, 52 cladodios primarios, 52 secundarios, 50 terciarios y 20 cuaternarios. Todos los cladodios se fotografiaron con una cámara Sony DSC-P200, y se utilizó una distancia estándar (45 cm) para todas las imágenes. Se marcaron 12 puntos de referencia anatómicos en cada imagen (figura 1).

Figure 1 Anatomic landmarks of cladode of Nopalea cochenillifera Giant Sweet clone (a) primary cladode; b) secondary cladode; c) tertiary cladode and d) quaternary cladode). 

Se utilizó el software Image J para extraer los valores de coordenadas de píxeles de las imágenes. Para garantizar la estandarización, las imágenes se rotaron y se tradujeron mediante las coordenadas de Procrustes (^{Rohlf 1999}), formando 174 matrices numéricas bidimensionales. Las variables estudiadas se enumeran en la tabla 1.

Table 1 Morphological variables 

Variables	Notation	Variables	Notation
Distance between 1 and 2	D1	Distance between 7 and 8	D4
Distance between 3 and 4	D2	Distance between 9 and 10	D5
Distance between 5 and 6	D3	Distance between 11 and 12	D6

El análisis de conglomerados de Ward se utilizó para evaluar la diferencia entre las clases de cladodios (^{Hair et al. 2010}). El análisis de varianza se utilizó para comparar los diferentes grupos, después de que se detectaron diferencias con la prueba de Tukey, que se utilizó en el nivel del 5%. Se empleó el análisis discriminante para encontrar las funciones de las variables observadas que explican las diferencias entre las clases de cladodios y los clasifican por órden de ramificación (^{Hair et al. 2010}). Las pruebas de T^² Hotteling y James se utilizaron para comparar las formas de los cladodios mediante el análisis estadístico de formas (^{Amaral et al. 2007}), utilizando los puntos de referencia anatómicos descritos en la figura 1. El análisis de los datos se realizó a través del paquete estadístico de formas y de conglomerados del R-project (^{R Equipo Básico de Desarrollo 2017}).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La figura 2 y la tabla 2 muestran la formación de tres grupos de cladodios por análisis de conglomerados de Ward, que se diferencian por orden de crecimiento (primario, secundario y tercer grupo de la combinación de terciario y cuaternario). Este comportamiento se explica por la estructura morfológica de la planta, ya que los cladodios primarios y secundarios en esta fase son los principales responsables al garantizar el soporte y la fijación de toda la planta, mientras que los cladodios terciarios y cuaternarios se encuentran en las etapas iniciales de desarrollo (^{Queiroz et al. 2015}). ^{Ferreira et al. (2003)} encontraron diferencias entre nueve grupos de clones del cactus de forraje Opuntia ficus-indica Mill. ^{Valdivia et al. (2008)} informaron la formación de dos grupos principales de cladodios de Opuntia spp, uno caracterizado por cladodios que tenían espinas blancas, frágiles, y estriadas longitudinales y el segundo grupo con cladodios sin espinas.

Table 2 Analysis descriptive by groups of cladode order of Nopalea cochenillifera Giant Sweet clone 

Variables	Cladode groups (Mean±SD)
	Primary	Secondary	Tertiary and quaternary	p-value
D1	1644.0±44.96^a	1611.0±53.40^b	1152.0±81.46^c	<0.0001
D2	603.0±70.00^a	462.0±115.72^b	404.5±72.26^c	<0.0001
D3	858.0±64.54^a	660.4±124.97^b	583.7±66.62^c	<0.0001
D4	932.3±48.33^a	768.3±74.47^b	646.8±51.11^c	<0.0001
D5	849.9±76.58^a	768.1±76.64^b	577.6±83.48^c	<0.0001
D6	647.3±82.93^a	620.3±100.65^b	411.6±90.11^c	<0.0001

SD- standard deviation; mean followed of same letters in row did not differ statistically by Tukey test at 5%.

Figure 2 Cluster of cladodes of Nopalea cochenillifera according to their orders. 

Las características de los cladodios relacionadas con la longitud, el ancho y el perímetro, presentan fuertes correlaciones con las variables del rendimiento de fitomasa de las plantas, caracterizándose por respuestas de variables cruciales para la especie y son confiables para la supervisión del comportamiento de los clones de cactus forrajeros y/o para la selección de clones con altos rendimientos productivos.

Las funciones discriminantes para cada orden de ramificación de cladodios mostraron que las variables D1, D3, D4 y D5 eran las que más contribuían a la discriminación entre órdenes (tabla 3). Este fenómeno puede explicarse por la estructura fisiológica de los cladodios, donde el primario y el secundario son más largos (D1) y más anchos (D3, D4 y D5) que el terciario y el cuaternario porque los cladodios primario y secundario son los principales responsables de la sustentación de la planta y la distribución de nutrientes y agua para otros órganos, lo cual explica también su mayor contribución en los índices de área fotosintética y área de cladodios debido a su mayor disponibilidad de superficie de asimilación (^{Queiroz et al. 2015} y ^{Mendoza-Orozco et al. 2018}).

Table 3 Discriminant function by cladode order of Nopalea cochenillifera Giant Sweet clone 

Variables	Discriminant function by cladode order
	Primary	Secondary	Tertiary	Quaternary
Intercept	-3047.93	-3296.69	-1713.47	-1340.66
D1	2.735	2.829	2.043	1.803
D2	-0.092	-0.105	-0.081	-0.084
D3	0.775	0.820	0.580	0.522
D4	0.712	0.775	0.571	0.508
D5	0.762	0.777	0.569	0.512
D6	-0.130	-0.128	-0.114	-0.111

La contribución de estas variables a la discriminación entre órdenes es comprensible, ya que existen diferencias considerables en los anchos (D3, D4 y D5), longitudes (D1) y en la forma de los cladodios entre los cuatro tipos de órdenes. El análisis de la función discriminante clasificó correctamente 49 cladodios primarios de 52, 51 de 52 secundarios, mientras que las tasas de aciertos para cladodios terciarios y cuaternarios fueron del 100% (tabla 4). La tasa media de aciertos en general fue del 97,7%, lo que indica que no se ha explicado solo el 2,3% de la variación observada. Los cladodios primarios y secundarios no clasificados en sus respectivos órdenes (tres primarios y uno secundario) se debieron al hecho de que estos son cladodios en crecimiento. Los cladodios primarios y secundarios son los principales responsables de la sustentación y la fijación de la planta y, por esta razón, los cladodios son más similares que los de tercer y cuarto orden (^{Queiroz et al. 2015})

Table 4 Classification of cladodes of Nopalea cochenillifera by discriminant function 

Observed	Predicted by model
	Primary	Secondary	Tertiary	Quaternary
Primary	49	3	0	0
Secondary	1	51	0	0
Tertiary	0	0	50	0
Quaternary	0	0	0	20

Los cladodios primarios y secundarios tenían formas medias más largas y anchas que los terciarios y cuaternarios. Solo hubo una pequeña diferencia entre los cladodios primarios y los secundarios en términos de ancho, aunque los primarios fueron ligeramente más anchos. Los cladodios terciarios y cuaternarios tenían similar forma, aunque los terciarios eran más anchos y un poco más largos (figura 3).

Figure 3 Mean shape of cladodes of Nopalea cochenillifera according to their orders 

Las mayores medidas de ancho y longitud se obtuvieron de los cladodios primarios y se redujeron secuencialmente con el número de orden (figura 3). Los cladodios primarios y secundarios tenían los anchos y longitudes mayores según su edad, ya que eran los cladodios más antiguos de la planta y, por lo tanto, los responsables de mantener otros cladodios, flores y frutas, así como el transporte de nutrientes y sustancias orgánicas necesarias para la subsistencia de la planta (^{Queiroz et al. 2015} y ^{Mendoza-Orozco et al. 2018}).

Las pruebas de T^² Hotteling y James mostraron diferencias entre la forma media de los cladodios primarios en relación con los de otros órdenes (tabla 5). La forma de los cladodios secundarios difirió en relación con los cladodios terciarios y cuaternarios. También hubo diferencias entre la forma de los terciarios y cuaternarios (tabla 5). Los cladodios primarios y secundarios tenían formas elípticas similares. Los cladodios primarios y secundarios son responsables del sustento de la planta, y pronto requieren una forma elíptica para sostener toda la formación de la planta, de lo contrario no soportaría su peso y caería al suelo. Los estudios de las especies Opuntia ficus-indica (^{Hernández et al. 2010}), Nopalea (^{Amorim et al. 2015}) y Opuntia stricta (^{Lucena et al. 2018}) también informaron que la forma del cladodio se describe mejor como una elipse.

Table 5 Comparison of cladodes order shape of Nopalea cochenillifera Giant Sweet clone 

Comparison	T^² of Hotteling Test		James Test
	Statistical Test	p-value	Statistical Test	p-value
Primary x Secondary	9.853	<0.0001	242.175	0.0099
Primary x Tertiary	13.143	0.0081	325.166	0.0008
Primary x Quaternary	13.073	0.0009	526.821	0.0001
Secondary x Tertiary	4.217	0.0073	104.769	0.0083
Secondary x Quaternary	5.323	<0.0001	284.937	<0.0001
Tertiary x Quaternary	2.100	0.0179	88.297	<0.0001

^{Mottese et al. (2018)}, con estudios de similitudes en las características fenotípicas de los géneros Opuntia, observó que los análisis de este tipo ayudan a comprender las características de las plantas y son útiles para los clones de trazabilidad en diferentes regiones.

Los valores más altos del área de cladodios permiten mayor área fotosintética, además de proporcionar mayor acumulación de agua, presentaron alta capacidad de retención de agua en las células del parénquima y en las grandes vacuolas del clorénquima. ^{Scalise et al. (2016)}, al estudiar la dinámica de los cladodios de crecimiento de Opuntia ficus-indica, mostró que los largos períodos de sequía provocaron reducción en el tamaño y la tasa de crecimiento de los cladodios. Por otro lado, en situaciones donde la disponibilidad de agua fue regular durante el ciclo, el crecimiento de los cladodios fue bastante receptivo.

La tasa de asimilación líquida es el índice que expresa la correlación entre el área de cladodios y la producción de materia seca de la planta, es decir, la fotosíntesis líquida. Representa la ganancia de carbono de una especie a través de la fotosíntesis líquida, es decir, cuanto puede aumentar la masa seca por unidad de área de cladode en el tiempo (^{Huber et al. 2018}).

Las tasas de asimilación del líquido se pueden ver comprometidas en dependencia de la posición en que se inserten los cladodios en la planta, pero también de la dimensión y opacidad de la superficie del cladodio, debido al bloqueo físico de los rayos solares. Estas disminuciones de energía luminosa afectan negativamente el flujo de fotoasimilados en cactus del género Nopalea (^{Nobel y Zutta 2008}). La tasa de asimilación del líquido se comporta de manera inversa a los valores del índice del área de cladodios. Según ^{Queiroz et al. (2015)}, en la medida que aumenta el índice de área de cladodios, los valores de la tasa de asimilación del líquido disminuyen de manera circunstancial según sus auto-sombra. Por lo tanto, los índices fisiológicos y productivos de los cactus están influenciados por la morfología de cada clon.

La caracterización morfológica de las especies de Nopalea cochenillifera es indispensable porque podría ayudar a reconocer mecanismos fisiológicos y bioquímicos que confieren resistencia a ambientes extremos. El análisis de forma realizado parece ser un procedimiento adecuado para reconocer las diferencias morfológicas entre los órdenes de cladodios de Nopalea cochenillifera. Sólo unas pocas características cuantitativas morfológicas son significativamente diferentes entre los grupos de orden de cladodios. La longitud y el ancho deben ser una característica confiable para usarse como marcador morfológico en la caracterización del orden de cladodios de Nopalea cochenillifera, debido a que las pequeñas diferencias de esta característica son estadísticamente significativas.

Estas variables, derivadas del análisis de forma, presentaron alto poder discriminatorio y pueden considerarse como posibles descriptores para identificar el orden de los cladodios e incluso para diferenciar los cactus de forraje, por lo que no es necesario ir al campo, generar costos y tiempo para este proceso.

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Recibido: 20 de Marzo de 2019; Aprobado: 28 de Junio de 2019

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