CIENCIA ANIMAL

Efecto de Aspergillus oryzae en la fermentación ruminal de una dieta de heno de alfalfa:concentrado con la utilización de la técnica de simulación de rumen (Rusitec)

0000-0001-5426-9660Areadne Sosa^{1  *}  , 0000-0002-1887-4529Cristina Saro^{2  3}  , 0000-0002-9764-0404I. Mateos^{2  3}  , 0000-0002-4195-3305A. Díaz^{2  3}  , 0000-0001-8639-4693Juana Galindo¹  , 0000-0002-4221-9057María D. Carro⁴  , 0000-0002-4000-7704María J. Ranilla^{2  3} 

¹Instituto de Ciencia Animal, Apartado Postal 24, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

²Departamento de Producción Animal. Facultad de Veterinaria, Universidad de León, 24071 León, Spain

³Instituto de Ganadería de Montaña, CSIC-Universidad de León, Finca Marzanas s/n, 24346 Grulleros, Spain

⁴Departamento de Producción Agraria, Escuela Técnica Superior de Ingeniería Agronómica, Agroalimentaria y de Biosistemas, Universidad Politécnica de Madrid, Ciudad Universitaria, 28040 Madrid, Spain

Resumen

Se ha demostrado que los productos microbianos de alimentación directa modifican los indicadores de fermentación ruminal y tienen efectos beneficiosos en el comportamiento de los rumiantes. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de Aspergillus oryzae en la fermentación ruminal de una dieta de heno de alfalfa:concentrado (65:35) con el sistema de fermentación continua Rusitec. Cuatro fermentadores correspondieron al control y cuatro recibieron 50 mg de cultivo liofilizado de A. oryzae que se mezcló con alimento. El tratamiento con A. oryzae (p <0.001 a p=0.039) aumentó el acetato, los ácidos grasos de cadena corta totales (AGCC), la producción de AGCC menores y la proporción acetato:propionato (Ac:Pr). La adición de A. oryzae disminuyó (p <0.001) los valores de pH y aumentó (p<0.001) la concentración de amoníaco-N. No hubo diferencias entre los tratamientos en la producción de metano (p=0.230). La inclusión de A. oryzae no afectó (de p=0.386 a p=0.865) la materia seca y la desaparición de fibras. El fluido ruminal de los fermentadores de A. oryzae no afectó (de p=0.465 a p=0.938) la producción de gas (de p=0.131 a p=0.942) ni los AGCC totales de sustratos puros. El aumento de acetato, AGCC menores y la producción de AGCC totales indican que la cepa A. oryzae estimuló la fermentación ruminal de una dieta de heno de alfalfa:concentrado (65:35) con el sistema de fermentación continua Rusitec.

Palabras-clave: fermentadores continuos; productos microbianos de alimentación directa; degradabilidad de la fibra; ácidos grasos volátiles

El uso de productos microbianos de alimentación directa como aditivos para piensos es una estrategia para optimizar la eficiencia de producción de rumiantes y puede utilizarse como alternativa al uso de antibióticos como promotores del crecimiento (^{Shen et al. 2018}, ^{Mamuad et al. 2019} y ^{Sklyar y Gerun 2020}). Entre las especies microbianas que se utilizan para este propósito se encuentra el hongo Aspergillus oryzae. Este microorganismo aumentó la cantidad de bacterias celulolíticas, bacterias viables totales y poblaciones de hongos (^{Beharka y Nagaraja 1998} y ^{Sun et al. 2014}). La estimulación de estas poblaciones ruminales conduce al aumento de la concentración de AGCC y la síntesis de proteínas microbianas (^{Seo et al. 2010} y ^{Sun et al. 2017}). En el ganado lechero, se demostró mejora de los indicadores productivos con la inclusión de A. oryzae en la dieta (^{Sucu et al. 2018} y ^{Sallam et al. 2019}).

La mayoría de las investigaciones para evaluar el efecto de este aditivo microbiano se realizan en condiciones in vivo o utilizando cultivos de microorganismos ruminales, como sistema in vitro. Pocos estudios evalúan el efecto de A. oryzae en sistemas de fermentación continua (^{Frumholtz et al. 1989} y ^{Newbold et al. 1991}), que es una opción que genera información útil a corto plazo para determinar la eficiencia del organismo en estudio (^{Martínez et al. 2009} y ^{Wagner et al. 2018}).

Además, la mayor parte de estos experimentos se han realizado con productos comerciales basados en extracto de fermentación de A. oryzae secado en una base insoluble de salvado de trigo (^{Yohe et al. 2015}). Existe información limitada acerca de la aplicación de cultivos vivos de este microorganismo y su potencial como modificador de la fermentación ruminal ha recibido mucho menos atención. Además, en los países tropicales, los sistemas de alimentación animal, específicamente para el ganado lechero, se basan en pastos y forrajes de bajo valor nutritivo que no cubren los requerimientos de estos animales. Los productos de aditivos microbianos en el mercado internacional tienen alto precio que hace que sea imposible importarlos para los países en desarrollo de América Latina, por lo que es esencial obtener aditivos propios para responder a situaciones generadas en la producción animal.

Como estrategia para mejorar el uso de los recursos disponibles para aumentar la eficiencia productiva de los rumiantes, el objetivo de este estudio fue evaluar el efecto del cultivo vivo de A. oryzae como activador de la fermentación ruminal en el sistema de fermentación continua Rusitec, alimentado con una mezcla de heno de alfalfa y concentrado.

Materiales y Métodos

El protocolo experimental se aprobó por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de León (Proyecto AIB2010NZ-00190). Se utilizó personal capacitado para el cuidado y manejo de las ovejas, de acuerdo con las pautas españolas para la protección de animales experimentales (Decreto Real 53/2013 del 1 de febrero, sobre la protección de los animales utilizados para experimentación u otros fines científicos).

Se realizó un ensayo de incubación de 10 días, con la utilización de ocho fermentadores Rusitec, con un volumen efectivo de 600 mL cada uno, con un diseño completamente al azar. Cuatro fermentadores correspondieron al control y cuatro recibieron 50 mg de cultivo de A. oryzae (cepa H/6.28.1 de la colección del Instituto Cubano de Investigación de Derivados de la Caña de Azúcar, ICIDCA). El cultivo se obtuvo por crecimiento en caldo de extracto de malta (Fluka) durante siete días. La selección de la dosis se basó en los resultados de ^{Sosa et al. (2010)}.

El procedimiento de incubación general fue el descrito por ^{Czerkawski y Breckenridge (1977)}. El primer día del experimento cada fermentador se inoculó con 250 mL de líquido ruminal filtrado, 250 mL de saliva artificial (pH 8.4) (^{McDougall 1948}) y 80 g de contenido de rumen sólido suministrado en una bolsa de nailon (tamaño de poro de 100 µm). El contenido ruminal se obtuvo de cuatro ovejas Merino canuladas en rumen, alimentadas con la misma dieta administrada a los fermentadores. Los contenidos ruminales de cada oveja se obtuvieron inmediatamente antes de la alimentación de la mañana. Las fracciones sólidas y líquidas se recogieron en recipientes separados. El contenido se mezcló y se filtró a través de cuatro capas de gasa. Ambas fracciones se transfirieron al sistema in vitro en 30 minutos, tal como lo describieron ^{Carro et al. (1992)}.

Cada fermentador recibió 20 g de sustrato de materia seca al día, que se colocaron en bolsas de nailon. El sustrato estaba compuesto por 13 g de heno de alfalfa (65%) y 7 g de concentrado (35%). Los ingredientes y la composición química del sustrato se muestran en la tabla 1. Se cortó el heno de alfalfa (piezas de aproximadamente 0.5 cm), y el concentrado se molió a través de un tamiz de 4 mm. Ambos componentes del alimento se pesaron de forma independiente y se mezclaron cuidadosamente antes de aplicar los tratamientos experimentales. Las cuatro bolsas correspondientes a los tratamientos con A. oryzae recibieron 50 mg de microorganismo que se mezcló con el sustrato. El flujo a través de los fermentadores se mantuvo mediante infusión continua de saliva artificial (pH 8.4) de ^{McDougall (1948)} a una proporción de 610 mL/d (escala de dilución del 4.24% / h).

Table 1 Ingredient composition and chemical analysis of experimental diets fed to donor sheep and used as substrates for the Rusitec fermenters 

Ingredients	g/kg of dry matter
Alfalfa hay	650
Barley	75,0
Gluten feed	71,0
Wheat middlings	70,0
Soybean meal	47,0
Palmkern meal	40,0
Wheat	18,0
Corn	11,0
Mineral-vitamin premix^1	18,0
Chemical composition
Organic matter	928
Neutral detergent fiber	507
Acid detergent fiber	248
Crude protein	131

¹ Declared composition (g/kg mineral/vitamin premix): Vitamin A, 600,000 IU; Vitamin D3, 120,000 IU; Vitamin E, 1 g; Vitamin Bl, 33 mg; Niacine, 1.5 g; S, 5 g; IK, 300 mg; SO₄Fe, 1 g; ZnO, 4 g; MnO, 2 g; CoSO₄, 60 mg; Na₂SeO₃, 30 mg; Ethoxyquin, 30 mg.

El segundo día se retiró la bolsa de nailon con contenido de rumen sólido y se suministró una nueva bolsa con sustrato. En los días siguientes y hasta el final del experimento, se retiró la bolsa que había pasado 2 días en los fermentadores y se introdujo una nueva bolsa con alimentación para lograr un tiempo de incubación de 48 h.

Muestreo, procedimientos analíticos y análisis estadísticos. En cada fermentador se midió el pH diariamente antes de la alimentación. Todos los días se recogió el efluente líquido en un recipiente que contenía 20 mL de solución de ácido sulfúrico (20%; vol:vol) para mantener los valores de pH por debajo de 2. Después de 7 días de adaptación, se recogieron muestras de gas, AGCC y la determinación de amoniaco-N en los días 8, 9 y 10, siguiendo los procedimientos descritos por ^{Martínez et al. (2009)} La bolsa de nailon recogida de cada fermentador se lavó dos veces con 40 mL de fluido del fermentador y luego se lavó con agua fría durante 20 minutos en una lavadora. La desaparición aparente de la materia seca después de 48 h de incubación se calculó a partir de la pérdida de peso después del secado en la estufa a 60 ºC durante 48 h y los residuos se analizaron para determinar el contenido de fibra detergente neutra y de fibra detergente ácida, según ^{Van Soest et al. (1991)}, en un analizador de fibra ANKOM220 (Ankom Technology Corporation, Fairport, NY, EE. UU.), para estimar la desaparición de la fibra detergente neutra y de la fibra detergente ácida.

Las muestras de efluentes se analizaron para AGCC individuales por cromatografía de gases, según lo indicado por ^{Carro et al. (1992)} y amoniaco-N por el método de ^{Weatherburn (1967)}. La producción de gas (L/d) se midió con un medidor de gas de tipo tambor (modelo TG1; Ritter Apparatebau GmbH, Bochum, Alemania). La cantidad de metano producido (mmol/d) se calculó multiplicando el gas producido por la concentración de metano que se determinó por cromatografía de gases como describen ^{Carro et al. (1992)}.

Se estudiaron los cambios adaptativos en la población microbiana de fermentadores para el tratamiento con A. oryzae a través del fluido de cada fermentador como inóculo para cultivos discontinuos y de la medición de la respuesta en pH final, producción de gas y AGCC. La actividad fermentativa del fluido se probó con tres sustratos puros (Sigma-Aldrich Química SA, Madrid, España): almidón (mezcla de 40% de maíz, 40% de trigo y 20% de almidón de papa), celulosa y xilano de avena. El último día de la prueba Rusitec se mezclaron 300 mL de líquido de dos pares de fermentadores de cada tratamiento, con la obtención de dos inóculos para el control y dos para el tratamiento con A. oryzae. Se mezclaron 600 mL de cada inóculo con 150 mL de saliva artificial enriquecida con N (1 L de saliva artificial que contenía 472 mg de NH₄Cl y 791 mg de tripticasa), y 40 mL de la mezcla final fueron dispensados anaeróbicamente (con lavado continuo con CO₂) en frascos de suero de 120 mL que contienen 400 mg de uno de los sustratos descritos anteriormente. Se incubaron 12 botellas (tres botellas para cada sustrato y tres botellas sin sustrato) por cada inóculo. Los frascos se taparon e incubaron a 39 °C por 9 h para celulosa y durante 6 h para el resto de sustratos. Se midió la cantidad de gas producido, se abrieron las botellas, se midió inmediatamente el pH y muestras de 0.8 mL se añadieron a 0.5 mL de una solución desproteinizante (20 g de ácido metafosfórico y 0.6 g de ácido crotónico por litro) para el análisis de AGCC.

Los datos se analizaron utilizando el procedimiento PROC MIXED de SAS (versión 9.4) (^{SAS 2013}), para un diseño completamente al azar. Los efectos incluidos en el modelo fueron tratamiento, día de incubación y la interacción entre los tratamientos y el día de incubación, y el fermentador como un efecto aleatorio.

Resultados y Discusión

El efecto de A. oryzae en los indicadores de la fermentación en los fermentadores Rusitec se muestra en la tabla 2. En el presente estudio se observaron aumentos de la producción de acetato y AGCC totales (p=0.022 y p=0.039, respectivamente), con la inclusión del hongo, lo cual es consistente con lo informado por otros autores (^{Wiedmeier et al. 1987}, ^{Frumholtz et al. 1989}, ^{Fondevila et al. 1990}, ^{Newbold et al. 1991} y ^{Sun et al. 2017}), así como el aumento (p <0.001) en la relación acetato:propionato (^{Wiedmeier et al. 1987} y ^{Frumholtz et al. 1989}). Los AGCC representan el principal suministro de energía metabolizable para rumiantes y, por lo tanto, un aumento en su producción sería nutricionalmente favorable para el animal huésped. También se observó aumento (p <0.001 a p = 0.038) en la producción de AGCC menores después de la inclusión del aditivo. Específicamente, la producción de los AGCC ramificados se debe a la desaminación y descarboxilación de aminoácidos de cadena ramificada. A. oryzae es altamente proteolítico (^{Kumura et al. 2011} y ^{Su et al. 2011}) y podría ser la actividad proteolítica del hongo lo que contribuye a la formación de estos compuestos. El aumento de estos isoácidos es un aspecto relevante porque hay factores de crecimiento para las bacterias fibrolíticas del rumen como Ruminococcus albus y Fibrobacter succinogenes (^{Hardy 1987}).

Table 2 Effect of A. oryzae on SCFA production (mmol/d), acetate:propionate ratio (Ac:Pr, mol/mol), pH, ammonia-N concentration (mg/d) and methane production (mmol/d) 

SCFA	Control	A. oryzae	SEM	p value
Total SCFA	58.8	65.9	2.23	0.039
Acetate	31.4	35.7	1.21	0.022
Propionate	9.76	10.3	0.390	0.348
Butyrate	9.82	10.5	0.370	0.238
Isobutyrate	0.54	0.69	0.022	<0.001
Isovalerate	1.80	2.09	0.060	0.003
Valerate	3.45	3.87	0.132	0.038
Caproate	2.09	2.78	0.094	<0.001
Ac:Pr	3.22	3.47	0.033	<0.001
pH	6.77	6.69	0.014	<0.001
Ammonia-N	146	193	6.0	<0.001
Methane	20.9	22.3	0.77	0.230

Con la adición de A. oryzae, los valores de pH disminuyeron (p <0.001) pero permanecieron cerca de la neutralidad. Esta disminución en el pH podría atribuirse al aumento en la producción de AGCC totales. El aumento (p<0.001) en la concentración de amoníaco-N coincide con los resultados de ^{Frumholtz et al. (1989)}, quienes observaron aumentos del 30% en este tema. Varios autores encontraron que la inclusión de A. oryzae estimula la producción de amoníaco-N por microorganismos del rumen (^{Arambel et al. 1987}, ^{Frumholtz et al. 1989} y ^{Martin y Nisbet 1990}), lo que sugiere que los aditivos microbianos favorecen la proteólisis in vitro.

Al añadir A. oryzae no se observó diferencia en la producción de metano (p = 0.230) (tabla 2). Se ha informado que los aditivos microbianos pueden reducir la metanogénesis ruminal (^{Sharma 2005}). ^{Frumholtz et al. (1989)} informaron una disminución en la producción de metano al agregar un extracto de fermentación de A. oryzae en los fermentadores Rusitec que fue consistente con el aumento de la producción de productos reducidos como el butirato y el valerato. Estos autores utilizaron dosis más altas de extracto de fermentación de A. oryzae (250 mg en fermentador con un volumen efectivo de 850 mL). En el presente estudio se observó un aumento en la relación acetato:propionato y, en consecuencia, no se espera una reducción en el metano. Por lo tanto, la formación de metano en la fermentación ruminal está estrechamente asociada con el perfil de AGCC formados, el propionato compite con el metano como sumidero de hidrógeno en la fermentación ruminal, mientras que la formación de acetato libera hidrógeno que puede ser utilizado por los metanógenos para convertir CO₂ en metano (^{Ungerfeld 2020}). La diferencia con otros estudios podría deberse a la cepa y las dosis utilizadas. ^{Newbold y Rode (2006)} afirman que las respuestas de los cultivos de levadura en los fermentadores Rusitec fueron muy variables y dependieron de la cepa utilizada, lo que puede estar relacionado con diferencias en la actividad metabólica de las cepas. ^{Jiao et al. (2018)} también demostraron la influencia de la cepa y la dosis en estudios con levadura en cultivo discontinuo de microorganismos ruminales.

Los resultados del efecto de A. oryzae en la desaparición de la dieta se muestran en la tabla 3. La inclusión de hongos no afectó (de p=0.386 a p=0.865) la materia seca ni la desaparición de fibra. Entre los efectos beneficiosos de este aditivo está su capacidad para estimular la degradabilidad de la fibra, que se demostró en investigaciones in vitro (^{Arambel et al. 1987}) e in vivo (^{Wiedmeier et al. 1987}). En estudios anteriores, ^{Newbold et al. (1991)} observaron que A. oryzae estimuló la desaparición de la materia seca en las 24 horas de fermentación, pero no a las 48 horas. Esto probablemente ocurrió por una tasa mejorada en lugar de la extensión de la digestión (^{Fondevila et al. 1990}). En el presente estudio, se retiraron las bolsas de alimentación después de 48 horas y esto podría explicar la falta de efecto observado en la materia seca y la desaparición de la fibra. Por otro lado, el aumento en la producción de SCFA totales a las 24 horas coincide con la hipótesis de que A. oryzae mejoró la tasa de digestión cuando se agregó al alimento en los fermentadores Rusitec.

Table 3 Effect of A. oryzae on diet disappearance 

Diet dissapearance (g/kg)	Control	A. oryzae	SEM	p value
Dry matter	572	570	0.6	0.865
Neutral detergent fiber	275	270	1.2	0.756
Acid detergent fiber	185	171	1.1	0.386

La tabla 4 muestra el efecto del inóculo de los fermentadores Rusitec en la fermentación de sustratos puros. Para todos los sustratos no hubo diferencias en la producción de gas (p=0.824, p=0.938 y p=0.465 para almidón, xilano y celulosa, respectivamente) entre los fermentadores de control y aquellos con A. oryzae.

Table 4 Effect of inoculum from fermenters Rusitec on pH, gas (mL) and SCFA production (mmol) and the Ac:Pr ratio (mmol/mmol) in fermentation of pure substrates¹ 

Sustrate and item	Control	A. oryzae	SEM	p value
Starch
Gas production	26.7	26.4	1.09	0.824
pH	6.84	6.92	0.017	0.007
Total SCFA	3.91	3.91	0.059	0.942
Acetate	2.06	2.13	0.033	0.187
Propionate	0.63	0.55	0.013	0.002
Butyrate	0.73	0.68	0.010	0.007
Isobutyrate	0.03	0.04	0.001	<0.001
Isovalerate	0.12	0.13	0.002	0.005
Valerate	0.22	0.21	0.003	0.029
Caproate	0.12	0.17	0.006	<0.001
Ac:Pr	3.28	3.85	0.045	<0.001
Xylan
Gas production	14.4	14.5	0.54	0.938
pH	7.16	7.17	0.023	0.761
Total SCFA	3.75	3.80	0.079	0.682
Acetate	2.08	2.17	0.044	0.190
Propionate	0.62	0.55	0.016	0.018
Butyrate	0.59	0.56	0.015	0.274
Isobutyrate	0.03	0.04	0.001	0.002
Isovalerate	0.11	0.12	0.002	0.010
Valerate	0.21	0.20	0.004	0.163
Caproate	0.12	0.16	0.006	<0.001
Ac:Pr	3.37	3.93	0.066	<0.001
Cellulose
Gas production	15.2	15.8	0.547	0.465
pH	7.26	7.26	0.014	1.000
Total SCFA	3.26	3.43	0.074	0.131
Acetate	1.70	1.86	0.038	0.012
Propionate	0.55	0.51	0.017	0.152
Butyrate	0.56	0.55	0.015	0.546
Isobutyrate	0.03	0.04	0.001	<0.001
Isovalerate	0.10	0.12	0.002	0.003
Valerate	0.20	0.20	0.004	0.783
Caproate	0.11	0.15	0.006	<0.001
Ac:Pr	3.07	3.64	0.060	<0.001

¹ Starch and xylan were incubated for 6 h and cellulose for 9 h

En el caso del almidón, se observó que el fluido ruminal que contiene A. oryzae aumentó el pH (p=0.007), lo que confirmó el efecto estabilizador de este organismo en el pH ruminal en dietas con alto contenido de concentrado. Varios estudios informaron que A. oryzae mejora la utilización de lactato por bacterias ruminales capaces de fermentar lactato (Megasphaera elsdenii y Selenomonas ruminantium) (^{Beharka y Nagaraja 1998}). ^{Waldrip y Martin (1993)} demostraron que el hongo proporciona factores de crecimiento (es decir, azúcares, aminoácidos y vitaminas) que requieren estas bacterias.

Los cultivos discontinuos inoculados con fluido ruminal de fermentadores alimentados con A. oryzae produjeron cantidades mayores (de p<0.001 a p=0.010) de AGCC ramificados y aumentaron (p <0.001) la producción de caproato y la relación Ac: Pr con todos los sustratos puros que los inoculados con fluido de los fermentadores control (tabla 4). Para el sustrato de almidón y xilano, hubo disminución (p=0.002 y p=0.018, respectivamente) en la producción de ácido propiónico con el fluido ruminal correspondiente a A. oryzae. En el caso de la celulosa, este tratamiento causó un aumento (p=0.012) de ácido acético.

La falta de efecto del inóculo de los fermentadores Rusitec en la fermentación de sustratos puros parece indicar que la cepa de A. oryzae o la dosis utilizada en el presente estudio no pueden inducir los cambios adaptativos en la población microbiana en fermentadores con A. oryzae. Estos resultados sugieren que el microorganismo se debe suministrar diariamente para mantener su efecto en el ecosistema ruminal.

Conclusiones

El aumento de acetato, ácidos grasos volátiles menores y la producción de ácidos grasos volátiles totales indican que la cepa de A. oryzae estimuló la fermentación ruminal de una dieta con heno de alfalfa:concentrado (65:35) en el sistema de fermentación continua Rusitec. Los resultados apoyan el desarrollo de futuras investigaciones in vivo.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo financiero recibido del MCYT de España (proyecto AGL2008-04707-C02-02) y del MAE-AECID (Proyecto PCI-Iberoamérica A/4951/06). A. Sosa y A. Díaz agradecen haber recibido becas del MAEC-AECID.

REFERENCIAS

Arambel, M.J., Wiedmeier, R.D. & Walters, J.L. 1987. "Influence of donor animal adaptation to added yeast culture and/or Aspergillus oryzae fermentation extract on in vitro rumen fermentation". Nutrition Reports International, 35(3): 433-436, ISSN: ‎0029-6635, Available: http://pascal-francis.inist.fr/vibad/index.php?action=getRecordDetail&idt=7473530.

Beharka, A.A. & Nagaraja, T.G. 1998. "Effect of Aspergillus oryzae extract alone or in combination with antimicrobial compounds on ruminal bacteria". Journal of Dairy Science, 81(6): 1591-1598, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(98)75725-X.

Carro, M.D., Lebzien, P. & Rohr, K. 1992. "Influence of yeast culture on the in vitro fermentation (Rusitec) of diets containing variable portions of concentrates". Animal Feed Science and Technology, 37(3-4): 209-220, ISSN: 0377-8401, DOI: https://doi.org/10.1016/0377-8401(92)90005-Q.

Czerkawski, J.W. & Breckenridge, G. 1977. "Design and development of a long-term rumen simulation technique (Rusitec) ". British Journal of Nutrition, 38(3): 371-384, ISSN: 0007-1145, DOI: https://doi.org/10.1079/BJN19770102

Fondevila, M., Newbold, C.J., Hotten, P.M. & Orskov, E.R. 1990. "A note on the effect of Aspergillus oryzae fermentation extract on the rumen fermentation of sheep given straw". Animal Science, 51(2): 422-425, ISSN: 1357-7298, DOI: https://doi.org/10.1017/S0003356100005584.

Frumholtz, P.P., Newbold, C.J. & Wallace, R.J. 1989. "Influence of Aspergillus oryzae fermentation extract on the fermentation of a basal ration in the rumen simulation technique (Rusitec) ". The Journal of Agricultural Science, 113(2): 169-172, ISSN: 0021-8596, DOI: https://doi.org/10.1017/S002185960008672X.

Giraldo, L.A., Ranilla, M.J., Tejido, M.L. & Carro, M.D. 2007. "Influence of exogenous fibrolytic enzymes and fumarate on methane production, microbial growth and fermentation in Rusitec fermenters". British Journal of Nutrition, 98(4): 753-761, ISSN: 0007-1145, DOI: https://doi.org/10.1017/S0007114507744446.

Hardy, C. 1987. Los microorganismos del rumen y su actividad. In: Bioquímica nutricional: Fisiología digestiva y metabolismo intermediario en animales de granja. Ruiz, R. et al (Eds.). Ed. EDICA, Instituto de Ciencia Animal, Mayabeque, Cuba, p. 115-142.

Jiao, P.X., He, Z.X., Ding, S., Walker, N.D., Cong, Y.Y., Liu, F.Z., Beauchemin, K.A. & Yang, W.Z. 2018. "Impact of strain and dose of live yeast and yeast derivatives on in vitro ruminal fermentation of a high-grain diet at two pH levels". Canadian Journal of Animal Science, 98(3): 477-487, ISSN: 1357-7298, DOI: https://doi.org/10.1139/cjas-2017-0079.

Kumura, H., Ishido, T. & Shimazaki, K. 2011. "Production and partial purification of proteases from Aspergillus oryzae grown in a medium based on whey protein as an exclusive nitrogen source". Journal of Dairy Science, 94(2): 657-667, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2010-3587.

Mamuad, L.L., Lee, S.S. & Lee, S.S. 2019. "Recent insight and future techniques to enhance rumen fermentation in dairy goats". Asian-Australasian Journal of Animal Science, 32(8): 1321-1330, ISSN: 1976-5517, DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.19.0323.

Martin, S.A. & Nisbet, D.J. 1990. "Effects of Aspergillus oryzae fermentation extract on fementation of amino acids, bermudagrass and starch by mixed ruminal microorganism in vitro". Journal of Animal Science, 68(7): 2142-2149, ISSN: 0021-8812, DOI: https://doi.org/10.2527/1990.6872142x.

Martínez, M.E., Ranilla, M.J., Ramos, S., Tejido, M.L. & Carro, M.D. 2009. "Effects of dilution rate and retention time of concentrate on efficiency of microbial growth, methane production, and ruminal fermentation in Rusitec fermenters". Journal of Dairy Science, 92(8): 3930-3938, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2008-1975.

McDougall, E.I. 1948. "Studies on ruminant saliva. 1. The composition and output of sheep's saliva". Biochemical Journal, 43(1): 99-109, ISSN: 1470-8728, DOI: https://doi.org/10.1042/bj0430099.

Newbold, C.J. & Rode, L.M. 2006. "Dietary additives to control methanogenesis in the rumen. International Congress Series, 1293: 138-147, ISSN: 0531-5131, DOI: https://doi.org/10.1016/j.ics.2006.03.047.

Newbold, C.J., Brock, R. & Wallace, R.J. 1991. "Influence of autoclaved or irradiated Aspergillus oryzae fermentation extract on fermentation in the rumen simulation technique (Rusitec)". The Journal of Agricultural Science, 116(1): 159-162, ISSN: 0021-8596, DOI: https://doi.org/10.1017/S0021859600076267.

Sallam, S.M., Abdelmalek, M.L., Kholif, A.E., Zahran, S.M., Ahmed, M.H., Zeweil, H.S., Attia, M.F., Matloup, O.H. & Olafadehan, O.A. 2019. "The effect of Saccharomyces cerevisiae live cells and Aspergillus oryzae fermentation extract on the lactational performance of dairy cows". Animal Biotechnology, 1-7, ISSN: 1049-5398, DOI: https://doi.org/10.1080/10495398.2019.1625783.

SAS (Statistical Analysis Systems). 2013. SAS Procedures Guide Release, 9.4 Edition. SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA.

Seo, J.K., Kim, S.W., Kim, M.H., Upadhaya, S.D., Kam, D.K. & Ha, J.K. 2010. "Direct-fed microbials for ruminant animals". Asian-Australasian Journal of Animal Science, 23(12): 1657-1667, ISSN: 1976-5517, DOI: https://doi.org/10.5713/ajas.2010.r.08.

Sharma, R.K. 2005. "Nutritional strategies for reducing methane production by ruminants". Indian Journal of Research, 4(1): 1-12, ISSN: 2250-1991, DOI: https://doi.org/10.36106/paripex.

Shen, Y., Wang, H., Ran, T., Yoon I., Saleem, A.M. & Yang, W. 2018. "Influence of yeast culture and feed antibiotics on ruminal fermentation and site and extent of digestion in beef heifers fed high grain rations". Journal of Animal Science, 96(9): 3916-3927, ISSN: 0021-8812, DOI: https://doi.org/10.1093/jas/sky249.

Sklyar, O.I., & Gerun, I.V. 2020. "Effect of additives and various microorganisms оn fermentation in the rumen". Scientific Messenger of LNU of Veterinary Medicine and Biotechnologies. Series: Veterinary Sciences, 22(97): 175-180, ISSN: 2518-1327, DOI: https://doi.org/10.32718/nvlvet9728.

Sosa, A., Galindo, J., Bocourt, R., Rodríguez, R., Albelo, N. & Oramas, A. 2010. "Effect of Aspergillus oryzae on the rumen fermentation of Pennisetum purpureum cv. Cuba CT-115 through the in vitro gas technique". Cuban Journal of Agricultural Science, 44(1): 151-155, ISSN: 2079-3480.

Su, G., Ren, J., Yang, B., Cui, C. & Zhao, M. 2011. "Comparison of hydrolysis characteristics on defatted peanut meal proteins between a protease extract from Aspergillus oryzae and commercial proteases". Food Chemistry, 126(3): 1306-131, ISSN: 0308-8146, DOI: https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2010.11.083.

Sucu, E., Moore, C., Van Baale, M.J., Jensen, H., Sanz-Fernandez, M.V. & Baumgard, L. 2018. "Effects of feeding Aspergillus oryzae fermentation product to transition Holstein cows on performance and health". Canadian Journal of Animal Science, 99(2): 237-243, ISSN: 0008-3984, DOI: https://doi.org/10.1139/cjas-2018-0037.

Sun, H., Wu, Y.M., Wang, Y.M., Liu, J.X. & Myung, K.H. 2014. "Effects of Aspergillus oryzae culture and 2-hydroxy-4-(methylthio)-butanoic acid on in vitro rumen fermentation and microbial populations between different roughage sources". Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 27(9): 1285-1292, ISSN: 1011-2367, DOI: http://dx.doi.org/10.5713/ajas.2013.13742.

Sun, H., Wu, Y., Wang, Y., Wang, C. & Liu, J. 2017. "Effects of addition of Aspergillus oryzae culture and 2‐hydroxyl‐4‐(methylthio) butanoic acid on milk performance and rumen fermentation of dairy cows". Animal Science Journal, 88(4): 602-609, ISSN: 0021-8812, DOI: https://doi.org/10.1111/asj.12646.

Ungerfeld, E.M. 2020. "Metabolic hydrogen flows in rumen fermentation: principles and possibilities of interventions". Frontiers in Microbiology, 1: 589, ISSN: 1664-302X, DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2020.00589.

Van Soest, P.J., Robertson, J.B. & Lewis, B.A. 1991. "Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber, and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition". Journal of Dairy Science, 74(10): 3583-3597, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(91)78551-2.

Wagner, B.K., Wenner, B.A., Plank, J.E., Poppy, G.D. & Firkins, J.L. 2018. "Investigation of ammonium lactate supplementation on fermentation end products and bacterial assimilation of nitrogen in dual-flow continuous culture". Journal of Dairy Science, 101(9): 8032-8045, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.2017-14358.

Waldrip, H.M. & Martin, S.A. 1993. "Effects of an Aspergillus oryzae fermentation extract and other factors on lactate utilization by the ruminal bacterium Megasphaera elsdenii". Journal of Animal Science, 71(10): 2770-2776, ISSN: 0021-8812, DOI: https://doi.org/10.2527/1993.71102770x.

Weatherburn, M.W. 1967. "Phenol hypoclorite reaction for determination of ammonia". Analytical Chemistry, 39(8): 971-974, ISSN: 0003-2700, DOI: https://doi.org/10.1021/ac60252a045.

Wiedmeier, R.D., Arambel, M.J. & Walters, J.L. 1987. "Effect of yeast culture and Aspergillus oryzae fermentation extract on ruminal characteristics and nutrient digestibility". Journal of Dairy Science, 70(10): 2063-2068, ISSN: 0022-0302, DOI: https://doi.org/10.3168/jds.S0022-0302(87)80254-0.

Yohe, T.T., O’Diam, K.M. & Daniels, K.M. 2015. "Growth, ruminal measurements, and health characteristics of Holstein bull calves fed an Aspergillus oryzae fermentation extract". Journal of Dairy Science, 98(9): 6163-6175, ISSN: 0022-0302, DOI: http://dx.doi.org/10.3168/jds.2015-9313.

Recibido: 05 de Mayo de 2020; Aprobado: 04 de Junio de 2020

^*Email:[e-mail]