Artículo original

Incidencia de Potyvirus en localidades productoras de solanáceas en la región occidental de Cuba

Acela Díaz de la-Osa¹  , Madelaine Quiñones-Pantoja²  , Sergio Ricardo-Desdín³  , Annia Hernández-Rodríguez^{1  *} 

¹Departamento de Microbiología y Virología, Facultad de Biología, Universidad de La Habana

²Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), carretera de Jamaica y Autopista Nacional. Apartado 10, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

³Grupo Empresarial GEOCUBA. Cuba

RESUMEN

El género Potyvirus es uno de los más estudiados dentro de los virus vegetales. Este presenta una distribución mundial y afecta a un amplio rango de hospedantes, entre los cuales las solanáceas son las de mayor importancia. Este trabajo tiene como objetivo determinar la incidencia de Potyvirus en solanáceas de importancia agroeconómica en la región occidental de Cuba empleando la técnica de ELISA indirecto. Se recolectaron un total de 1120 muestras de hojas jóvenes de Solanum lycopersicum, Capsicum annuum y Nicotiana tabacum (sintomáticas y asintomáticas), las que fueron evaluadas mediante ELISA indirecto empleando anticuerpos monoclonales. Entre el 34 y el 75 % del material vegetal recolectado resultó positivo. Los mayores valores de incidencia (66 %) se registraron en dos localidades, situadas en los municipios de San Juan y Martínez y San Antonio de los Baños, respectivamente; mientras que otra, ubicada en el municipio Güira de Melena presentó los valores más bajos (35 %).

Palabras-clave: Solanum lycopersicum; Capsicum annuum; Nicotiana tabacum; Potyvirus; incidencia

INTRODUCCIÓN

El Virus Y de la papa (PVY) es una de las especies más patogénicas dentro del género Potyvirus, familia Potyviridae^1,2. Se ha identificado como el responsable de cuantiosas pérdidas en cultivos fundamentales para la economía como Solanum lycopersicum L., Capsicum annuum L., Solanum tuberosum L. y Nicotiana sp. ^3,4. PVY está ampliamente distribuido a nivel mundial y es transmitido de forma no persistente y no circulativa por diferentes especies de áfidos, que se adaptan a una amplia variedad de hábitats ¹.

Es un virus desnudo, con una morfología flexuosa y filamentosa, de 740 nm de largo y 11 nm de diámetro. Presenta un genoma constituido por una cadena simple de ARN de polaridad positiva, de alrededor de 9,7 Kb que contiene dos marcos abiertos de lectura flanqueados por regiones 3´ y 5´ no traducidas ⁵. Los síntomas causados por PVY se relacionan, fundamentalmente, con un mosaico de color, necrosis y arrugamiento de las hojas, aunque pueden variar en correspondencia con la variante viral que produce la infección, las características del hospedante, el momento de la infección o las condiciones ambientales ^6,7.

En la última década, numerosos estudios han manifiestado la gran diversidad genética y biológica de PVY ⁸, conjuntamente con su amplia distribución mundial, con su potencial de recombinación y con su patogenicidad en diferentes ambientes, representan un desafío para la agricultura. Teniendo en cuenta estos antecedentes, se han desarrollado numerosas metodologías que tienen como objetivo, optimizar la detección temprana del virus. Dentro de estas, las técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa están bien documentadas; no obstante, el empleo de esta técnica de forma rutinaria se ve limitado por el número de muestras a evaluar, debido a lo complejo que resulta la extracción del ARN viral ^4,8.

En Cuba, diversos autores han informado de la presencia de PVY afectando a C. annuum y S. tuberosum en las provincias de Artemisa y Mayabeque ^9,10. Estos estudios emplearon, fundamentalmente, métodos tradicionales como la observación de síntomas, con lo cual se conoce de la existencia de cepas de PVY circulantes en diferentes regiones del país, pero se ignora cuál es la distribución e incidencia del virus en las diferentes localidades productoras de solanáceas. Este trabajo tiene como objetivo determinar la incidencia de Potyvirus en solanáceas de importancia agroeconómica en la región occidental de Cuba, empleando un ELISA indirecto.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área objeto de estudio

Se determinaron las coordenadas de las 14 localidades incluidas en el estudio, pertenecientes a las provincias de Pinar de Río y Artemisa, empleando la tecnología de Geo-posicionamiento Global (GPS) con un equipo SR20 (Tabla 1), según el procedimiento descrito por Ricardo-Desdín y colaboradores en 2010 ¹¹.

Tabla 1 Localización geográfica del área objeto de estudio 

Localidad	Ubicación	Coordenadas en WGS-84*						Coordenadas Planas (m)
		Latitud			Longitud			X	Y
1	Consolación del Sur^1	23	31	9,670009	83	30	34,111532	241843,44	301197,28
2	Consolación del Sur^1	22	30	17,444713	83	31	30,519203	240204,78	299618,14
3	San Juan y Martínez^1	22	16	57,221336	83	49	29,875211	208900,19	275558,05
4	San Juan y Martínez^1	22	16	57,046232	83	49	39,903693	208613,07	275558,05
5	San Luis^1	22	16	50,142266	83	46	22,478005	214259,58	275240,72
6	Pinar del Río	22	23	11,837290	83	43	2,940217	220182,28	286874,25
7	Los Palacios^1	22	35	43,434078	83	15	9,317690	268393,92	309198,97
8	Bauta^2	22	59	15,338840	82	32	17,761689	342279,04	351701,52
9	San Antonio de los Baños^2	22	51	54,533886	82	28	45,747493	348184,09	338082,51
10	San Antonio de los Baños- Lázaro Peña^2	22	52	47,276633	82	28	38,070120	348418,84	339702,63
11	Bejucal (Artemisa)	22	52	29,473538	82	22	51,527239	358291,06	339061,35
12	San Antonio de los Baños^2	22	50	19,409613	82	29	18,672986	347216,64	335165,93
13	San Antonio de los Baños^2	22	51	21,038225	82	28	3,096045	349389,84	337040,36
14	Güira de Melena^2	22	47	33,225866	82	32	1,805998	342513,61	330101,18

*Coordenadas obtenidas con GPS (grados, minutos, segundos), ¹Pinar del Rio, ²Artemisa

Toma y procesamiento de las muestras

Se recolectaron un total de 1120 muestras de hojas jóvenes de S. lycopersicum, C. annuum y N. tabacum (sintomáticas y asintomáticas) (Tabla 2), a partir de la toma de plantas de 20 puntos específicos de un cuadrante de 4x4 m, de acuerdo al diseño de sobre cerrado o bandera inglesa. Las muestras se envolvieron en papel gaceta humedecido y se conservaron a 4 ^oC en una bolsa de nylon bien cerrada hasta el momento de ser procesadas.

Tabla 2 Cantidad de muestras recolectadas en los cultivos en estudio 

Localidad	Muestras por cultivo
	N. tabacum	S. lycopersicum	C. annuum	Total
1	28	36	16	80
2	80	ND	ND	80
3	12	24	44	80
4	18	26	36	80
5	80	ND	ND	80
6	32	15	33	80
7	ND	43	37	80
8	ND	26	54	80
9	38	26	16	80
10	80	ND	ND	80
11	27	53	ND	80
12	32	24	24	80
13	26	28	26	80
14	ND	80	ND	80
Total	453	381	386	1120

ELISA indirecto para la detección de Potyvirus

Se realizó un ELISA indirecto para determinar la presencia de Potyvirus en las muestras, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Agdia, Inc, Indiana, EUA). Para ello, el tejido vegetal disponible se maceró en bolsas de plástico, a razón de 300 mg de hoja, con 300 µL de tampón de extracción de ELISA indirecto pH 7,4 (Na₂CO₃ 15 mM; NaHCO₃ 28,4 mM; PVP 1 %) y se centrifugó durante 1 min a 7000 rpm. Se añadieron 100 µL de extracto por pocillo en la placa de ELISA, se cubrió con plástico transparente y se incubó a temperatura ambiente (TA) durante 1 hora. Luego de tres lavados con PBS-Tween pH 7,4 (NaHPO₄ 0,02M; Na₂HPO₄ 0,08 M; 0,15M NaCl; KCl 0,003 M y Tween-20, 10 %), se añadieron 98 µL de la solución de anticuerpos monoclonales anti-Poty (Agdia, Inc, Indiana, EUA) por pocillo, diluidos 1:200 en tampón conjugado (PBS 10X, Tween-20 10 %, PVP 2 %) y se incubó a 4 °C durante toda la noche. Posteriormente, se realizaron tres lavados con PBS-Tween, después de los cuales se adicionaron 95 µL por pocillo de la solución de anticuerpos conjugados (anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina) diluidos 1:200 en tampón conjugado y se incubó durante 1 h a TA. Se llevaron a cabo otros tres lavados con PBS-Tween y, a continuación, se añadieron 100 µL por pocillo de la solución de sustrato: p-nitrofenol de concentración 1 mg L^-1 en tampón sustrato de fosfatasa alcalina con pH 9,8 (dietanolamina 10 %, MgCl₂ 6H₂O 0,5 mM, NaN₃ 3,8 mM). Se cubrió la placa con papel de aluminio y se incubó a TA. Finalmente se realizaron lecturas espectrofotométricas a 405 nm después de transcurridos 30 min, 60 y 90 min de la incubación. Se utilizó un lector de ELISA LIUYI WD-2102A.

Como controles positivos a la infección por Potyvirus, se empleó el suministrado por el fabricante (Agdia, Inc, Indiana, EUA) en forma liofilizada. Como control negativo se emplearon tres muestras de tejido foliar de Arabidopsis thaliana L., crecida en condiciones controladas en casa de cristal. Se consideraron como positivas aquellas muestras cuyas lecturas de absorbancia a 405 nm presentaron un valor mínimo del doble de la lectura obtenida en el control negativo ³.

La incidencia de Potyvirus en la población evaluada se calculó mediante el conteo del número de plantas positivas al ELISA indirecto, dividido por el total de plantas colectadas de acuerdo a la metodología descrita por Gil y colaboradores en 2011 ¹².

Análisis biométrico

Para el análisis estadístico de los resultados, se realizaron las pruebas de normalidad y de homogeneidad de varianza a todos los datos. Posteriormente se utilizó una Prueba de Chi cuadrado y un análisis bifactorial completamente aleatorizado contenidos en el paquete STATISTICA versión 8.0.

RESULTADOS

Determinación de la incidencia de Potyvirus en las regiones geográficas muestreadas

Dentro de las muestras recolectadas se encontraron plantas con síntomas típicos de Potyvirus como mosaico, arrugamiento de las hojas, decoloración internervial, amarillamiento y necrosis (Figura 1).

Figura 1 Plantas sintomáticas recolectadas en el estudio que muestran arrugamiento, mosaico, decoloración internervial, amarillamiento y necrosis. A) C. annuum. B) S. lycopersicum. C) N. tabacum 

Los resultados pusieron de manifiesto la alta incidencia de Potyvirus en las zonas evaluadas. Entre el 34 y el 75 % del material vegetal recolectado resultó positivo mediante el ensayo de ELISA Indirecto (D.O. 0,5-1,2) (Tabla 3). Los mayores valores se registraron en las localidades tres y nueve situadas en los municipios de San Juan y Martínez y San Antonio de los Baños, respectivamente; mientras que la localidad 14 situada en el municipio Güira de Melena presentó los valores más bajos (35 %).

Tabla 3 Incidencia de Potyvirus en los cultivos muestreados en las 14 localidades incluidas evaluadas mediante el ELISA Indirecto 

Localidad	N. tabacum (%)	S. lycopersicum (%)	C. annuum (%)	Incidencia de Potyvirus (%)
1	43	64	63	56
2	43	ND	ND	42
3	58	58	73	66
4	61	58	42	51
5	54	ND	ND	53
6	34	67	58	38
7	ND	49	54	51
8	ND	46	65	59
9	61	69	75	66
10	64	ND	ND	64
11	44	45	ND	45
12	47	42	54	48
13	35	43	42	38
14	ND	35	ND	35
Total	50	49	48	51

ND- no determinado

Al realizar la comparación general entre ambas provincias (Pinar del Río y Artemisa) no se detectaron diferencias significativas en cuanto a la incidencia de Potyvirus para p≤0,05 (Figura 2A). El nivel de incidencia en N. tabacum difiere significativamente de S. lycopersicum y C. annuum, mientras que no se evidencian diferencias entre los valores detectados en S. lycopersicum y C. annuum para p≤0,05 (Figura 2B). La incidencia de este género viral para N. tabacum, en Pinar del Río es mayor que en Artemisa; sin embargo, para los otros dos cultivos es superior en Artemisa. A su vez, no se detectaron diferencias significativas entre S. lycopersicum y C. annuum en cuanto a respuesta a Potyvirus, tanto en Artemisa como en Pinar del Río (p≤0,05) (Figura 2C).

Letras diferentes indican diferencias para p≤0,05, según la Prueba de χ²

Figura 2 Incidencia de Potyvirus. A) En la región geográfica de estudio. B) En los tres cultivos muestreados. C) En los tres cultivos por cada provincia 

DISCUSIÓN

En Cuba se ha informado la presencia de PVY y del Virus del grabado del tabaco (TEV) infectando N. tabacum y S. lycopersicum¹³. En C. annuum se demostró, además, la presencia del Virus del moteado del pimiento (PepMoV) ¹⁴; asímismo, González y colaboradores ⁴, encontraron inclusiones citoplasmáticas características de los Potyvirus en células provenientes de plantas de C. annuum, en el municipio de Güira de Melena, provincia de Artemisa. No obstante, la cuantificación de los efectos individuales de estos Potyvirus sobre la producción de los cultivos evaluados no ha sido determinada. En el país, no se han realizado seguimientos de su incidencia en solanáceas, por lo que no es posible analizar la evolución de este fenómeno en el tiempo y el espacio.

En el presente trabajo, empleando técnicas inmunoenzimáticas, se determinó que más del 50 % de las plantas recolectadas están infectadas por Potyvirus (de acuerdo a lo reflejado en la Tabla 3), evento que podría estar relacionado con el empleo de cultivares sensibles y con los niveles de infestación por áfidos en las zonas analizadas. La presencia de cultivares susceptibles favorecería la replicación viral y, a su vez, altos niveles de infestación por áfidos pueden contribuir a su diseminación en las localidades evaluadas.

Estos resultados se corresponden con lo informado por algunos autores que plantearon que los miembros del género Potyvirus constituyen uno de los principales problemas en la producción de diversos cultivos solanáceos en las regiones tropicales con índices de infección superiores al 50 % ¹⁵. Por otra parte, en la región Andina de Colombia se ha identificado a PVY como uno de los virus que afectan con mayor frecuencia a S. tuberosum, S. lycopersicum y C. annuum^12,16,17, informándose al menos tres variantes de PVY en el país ⁴.

La incidencia de Potyvirus en las zonas muestreadas indican que este grupo se encuentra distribuido de forma homogénea en las provincias de Artemisa y Pinar del Río y en los tres cultivos muestreados, aunque su incidencia en N. tabacum es mayor que en S. lycopersicum y C. annuum, lo que podría indicar que las especies de Potyvirus circulantes en esta región se replican con mayor eficiencia en N. tabacum. Este resultado pone de manifiesto, además, que el tipo de hospedante cultivado, ejerce presión selectiva sobre la especie viral que predomina en un ambiente dado y, por tanto, influye sobre su evolución.

Otros investigadores también encontraron una alta incidencia de Potyvirus en diferentes localidades geográficas, informando que este grupo viral infectó el 75 % de las solanáceas recolectadas y que el 79 % de las plantas positivas estaban infectadas con PVY ¹⁸.

Muchas de las especies patogénicas para N. tabacum y S. lycopersicum tienen la capacidad de infectar a S. tuberosum¹. El tipo de transmisión, mediada por áfidos y por transmisión mecánica, también favorece la rápida movilidad del virus desde una zona infectada hacia una zona sana ¹⁸, lo que podría indicar la presencia de este grupo viral afectando a S. tuberosum, en la región evaluada. Sin embargo, esta hipótesis debe ser demostrada mediante la inclusión de este cultivo en futuros estudios.

CONCLUSIONES

El género Potyvirus se encuentra distribuido de forma homogénea en las provincias de Artemisa y Pinar del Río y en los tres cultivos muestreados, aunque su incidencia en N. tabacum es mayor que en S. lycopersicum y C. annuum, lo que pone de manifiesto que el tipo de hospedante cultivado ejerce presión selectiva sobre la especie viral que predomina en un ambiente dado y por tanto influye sobre su evolución.

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Recibido: 01 de Marzo de 2018; Aprobado: 24 de Enero de 2019

^*Autor para correspondencia. [e-mail]