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Introducción
Moringa Oleifera es una planta herbácea con múltiples usos, sus hojas son comestibles y contienen diversos fitoquímicos de interés terapéutico como vitaminas, carotenoides, polifenoles, ácidos fenólicos, flavonoides, alcaloides, glucosinolatos, isotiocianatos, taninos, saponinas, oxalatos y fitatos de interés terapéutico.1,2 Los extractos de hojas exhiben propiedades antioxidantes, estudios en animales para evaluar la capacidad antioxidante de extractos de hojas acuosos indican un alto grado de seguridad. No se informaron efectos adversos en asociación con estudios en humanos.3
Se considera el grupo de los flavonoides como el que más contribuye a la actividad antioxidante.4) Los flavonoides de origen natural tienen relativamente baja toxicidad, por esta razón es de interés extraer flavonoides de las plantas empleando diversos métodos de extracción.5
Existen diversos métodos no convencionales para la extracción de flavonoides de diversas partes de las plantas.5,6 La extracción por ultrasonido se caracteriza por acelerar la extracción y mejorar los procesos de transferencia de masa debido a la alta potencia ultrasónica que desagrega partículas, reduciéndolas a micro y nano partículas de manera uniforme en el líquido favoreciéndose la disolución de componentes. Las enzimas se utilizan con el propósito principal de alterar la estructura de la pared celular y mejorar el rendimiento de extracción en jugos. El empleo de microondas en los procesos de extracción genera calor debido a la interacción entre las ondas electromagnéticas y las moléculas de agua presentes en los alimentos, las moléculas de agua rotan por efecto de las microondas favoreciendo los procesos de disolución. 5,6). La literatura señala el empleo de estos métodos a nivel experimental utilizando solventes orgánicos en la extracción, principalmente soluciones hidro alcohólicas empleando etanol y metanol.5 En la preparación de bebidas funcionales no alcohólicas la presencia de alcohol en los extractos limitaría su empleo directo en la elaboración de este tipo de bebidas.
Las bebidas funcionales en la industria de alimentos son aquellas que ofrecen beneficios para la salud y comprenden una variedad de productos, dentro de ellas las bebidas de té, disponibles en el mercado, las hojas de té contienen alto contenido de catequinas y flavonoles. Distintas especies vegetales son propicias para su empleo en la preparación de bebidas, dentro de ellas las hojas de moringa que presenta un amplio espectro de ingredientes fitoquímicos y que muestran actividad antioxidante.
Los métodos convencionales de infusión y decocción son mayormente empleados en la extracción de flavonoides de diversas partes de las plantas, el primero consiste en agregar agua hirviendo o caliente sobre la muestra y dejarla en reposo, en la decocción la muestra se calienta en el agua desde un inicio hasta ebullición y se mantiene así por un tiempo determinado dejando luego en reposo.7,8 La temperatura en esos procesos es variable, en la infusión la temperatura va disminuyendo en el reposo y en la decocción parte de la planta es sometida a un sobrecalentamiento que implica el tiempo en llegar a ebullición adicionado al tiempo en la cual se mantiene a esa temperatura y el tiempo de reposo, que degradan el contenido de flavonoides extraídos.8
Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores los objetivos principales del presente trabajo fueron:
1- Comparar diversos métodos de extracción acuosa de hojas de moringa determinando la capacidad antioxidante y el contenido de fenoles totales en los extractos obtenidos empleando la extracción en caliente a temperatura constante, extracción enzimática, por ultrasonido y microondas
2- Evaluar la estabilidad antioxidante y la aceptación sensorial de una bebida a base de hojas de moringa elaborada con el mejor método de extracción.
Materiales y métodos
Materia prima y tratamiento
Diez kilogramos de ramas de la planta de moringa fueron recolectados de manera aleatoria del Fundo de la Universidad Católica de Santa María, Distrito del Pedregal Majes (S16°21'10,01" O72°17'46,93"), Arequipa - Perú. Previo tratamiento de lavado y secado bajo sombra, las hojas de moringa se envasaron y se conservaron a -18°C hasta su uso.
El secado se realizó durante 5d de secado bajo sombra, siendo el rendimiento de 15,9 % como hojas con respecto al peso inicial de ramas, con una humedad de 7,3 %, mucho menor del 12 %, límite máximo de humedad para el caso de hierbas aromáticas.9 Las hojas de moringa secadas bajo sombra conservan sus propiedades fitoquímicas mejor que el secado solar y con aire caliente, pero en menor grado que la liofilización.10
Métodos de extracción
Extracción acuosa en caliente (EC): las hojas de moringa (0,5, 1 y 2 % m/v) fueron sometidas a procesos de extracción a temperaturas de 85 °C y 92 °C a 3, 5, 8, 10, 12 y 15 min, después del cual las muestras son enfriadas.
Extracción enzimática (EE): la extracción se realizó a 40°C a baño María (Memmert WN22) durante 2 h. Las hojas trituradas de moringa (1 %) se hidrataron por 10 min en 100 ml de agua destilada. La solución enzimática se preparó disolviendo 100 µl de la enzima Pectinex Ultra Clear (Sigma) en agua destilada en un volumen final de 10 mL; se dosificó a cada frasco 0, 0,5, 1, 1,5 y 2 mL, que corresponden a 0, 5, 10, 15 y 20 µL de la enzima respectivamente.
Extracción asistida con Ultrasonido (EU): 1 g de hojas trituradas de moringa (1 %) se colocaron en 100 ml de agua destilada, la extracción se realizó empleando un procesador de ultrasonido (UP 100HP,100 Watts, frecuencia 30 KHz, Hielscher Ultrasonics GmbH), se aplicó una amplitud de 100 %, pulsos: 0,6 y 1,0, tiempo: de 5, 10, 15 min en cada caso.
Extracción asistida con microondas (EM): 1 g de hojas trituradas de moringa (1 %) se colocaron en 100 ml de agua destilada cubierta con una luna de reloj. La muestra fue colocada en el plato del microondas (LG Intelowave grill: Potencia 800 W) y se expuso por 30 s (1 ciclo) a la energía del microondas, después de la exposición la muestra se enfrío a temperatura ambiente. Para la aplicación de un nuevo ciclo la muestra enfriada se colocó nuevamente en el microondas y así sucesivamente según el número de ciclos aplicado. Se realizaron extracciones con 2, 3, 5, 7, 9 y 11 ciclos.
Al final de los procesos de extracción las muestras fueron prensadas, filtradas y centrifugadas. Antes de realizar los análisis de las muestras se repuso a las muestras el agua a evaporada.
Elaboración de la bebida y evaluación de su estabilidad
Elaboración de la bebida: el extracto acuoso se pasteurizó por 10 min a 85 °C; antes de su finalización se añadió 100 ppm, 0,25 g/L, 0,4 g/L y 3 mL de sorbato de potasio, ácido cítrico, stevia y saborizante de naranja, respectivamente. Se evaluaron las características antioxidantes y propiedades fisicoquímicas de la bebida además de sus características sensoriales; se compararon las características antioxidantes con la de dos bebidas comerciales elaboradas con té verde.
Estabilidad de la bebida: la estabilidad antioxidante de las bebidas fue evaluada durante 28 d a 10, 25 y 35 °C. Se evaluaron las características antioxidantes, propiedades fisicoquímicas: pH, acidez y características sensoriales empleando una escala hedónica de 7 puntos donde 1: Me disgusta mucho y 7: Me gusta mucho.11
Los parámetros cinéticos de velocidad k (d-1) de degradación se calcularon a partir de la variación del contenido de fenoles totales, CA Cuprac y el % de inhibición DPPH* durante 28 d, efectuando los análisis cada 7 d, las ecuaciones resultantes permiten hallar los valores de k (d-1) y el coeficiente de determinación r2, el tiempo de vida media se estimó considerando una atenuación del 50 % en el contenido de fenoles totales.
Métodos de análisis
El contenido de fenoles totales y la CA Cuprac (Cupric Ion Reducing Antioxidant Capacity) fue determinado según lo señalado por la literatura.12
El porcentaje de inhibición, I (%) DPPH*, fue determinado con algunas modificaciones de acuerdo a lo señalado por algunos autores.13
La claridad de los extractos se determinó por medio de su transmitancia en un espectrofotómetro Shimadzu UV-1800 a 650 nm.
Las determinaciones de pH y acidez se realizaron por duplicado y las características antioxidantes por triplicado determinándose el promedio y la desviación estándar. Se utilizó programas informáticos Microsoft Excel.
Resultados y discusión
Resultados y análisis de la aplicación de los métodos de extracción acuosa
La tabla 1 muestra los resultados del contenido de fenoles, CA Cuprac y el % de inhibición DPPH* en la EC. Se observa un incremento en el contenido de fenoles cuando aumenta la concentración de 0,5 % a 2 % de hojas de moringa, resultados con la misma tendencia fueron observados en bebidas funcionales a base de moringa y chía, cuando la concentración de extracto de moringa empleado aumenta de 0,26 a 0,43 % en la formulación.14
La extracción a 92 °C generó un mayor contenido de fenoles con 1 % de hojas de moringa, lo cual se atribuye a la ruptura de las células por acción de la temperatura permitiendo una mayor solubilidad de sustancias en el medio acuoso, sin embargo, se apreció turbidez en los extractos obtenidos. Los valores de transmitancia variaron de 74,7 a 22 % a 92 °C, de 96 a 95,7 % a 85 °C, a los 3 y 15 min de extracción y con 1 % de hojas de moringa. En extractos con 0,5 % de hojas de moringa y 85 °C la variación de transmitancia fue de 98,5 a 97,55 % en los tiempos indicados. Se aprecia buena transparencia en los extractos obtenidos a 85°C al 1 y 0,5 % de hojas de moringa.
Considerando los valores iniciales de fenoles totales como 100 % se observa un mayor incremento de extracción (Δ %) en función del tiempo de extracción cuando la concentración de hojas de moringa es de 0,5% a 85 °C, y que corresponde a una mayor dilución con respecto a las demás preparaciones. Algunos autores (15 emplearon etanol a 60 % como solvente y observaron la misma tendencia al incrementar la dilución (soluto-disolvente) de 1:25 a 1:35 en la extracción de hojas logrando mayores niveles de extracción de polifenoles totales.
Los resultados de CA Cuprac y del % de Inhibición DPPH* hallados mostraron un comportamiento similar con mayores incrementos de extracción a 85°C con 0,5 % de hojas de moringa. Se observó una relación directa entre el contenido de fenoles totales y la CA Cuprac siendo los coeficientes de correlación de Pearson calculados de 0,999 (0,5 % de hojas de moringa, 85 °C), 0,930 (1 % hojas de moringa, 85 °C), 0,849 (1 % hojas de moringa, 92 °C), 0,569 (2% hojas de moringa y 92 °C). Para 85 °C, 0,5 % de hojas de moringa se obtuvo un coeficiente de correlación de 0,999 entre el contenido de fenoles y el % de Inhibición DPPH*. Otras investigaciones reportan una relación directa entre el contenido de flavonoides y el % de captura del radical libre DPPH* en extractos obtenidos a partir de hojas de sauco 16) y un coeficiente de correlación de 0,913 entre el contenido de flavonoides y la capacidad antioxidante DPPH* en extractos de hojas de camote.17
El extracto acuoso de 2 % de moringa es de color amarillo oscuro y posee un sabor tánico que se intensifica con el tiempo de extracción, incrementando la turbidez. Al respecto se encontró que infusiones de hojas de moringa obtenidas a 75 °C/20 min y 65 °C/30 min., no mostraron diferencias en color y sabor; sin embargo, infusiones obtenidas a 95 °C/10 min presentaron mayor turbidez y menor contenido de polifenoles.18) Los extractos acuosos de hojas de moringa contienen isotiocianatos, diversos tipos de fenoles, glucosinolatos, rutina, catequinas, entre otros 19,20 por lo que los resultados hallados expresan la presencia de diversos metabolitos en los extractos acuosos obtenidos que denotan actividad antioxidante.
Los resultados obtenidos con el método de EE no fueron relevantes (tabla 2), esto se debe al tiempo (2 h) y temperatura de extracción (40 °C) y no a la acción de la enzima sobre las muestras. Es importante considerar el tipo de muestra sobre la cual la enzima actúa.
El método de EU demostró que una máxima intensidad y un pulso continuo de 1 frente a un pulso de 0.6 mejoran los procesos de extracción acuosa (tabla 3). La aplicación del ultrasonido generó calor, llegando a una temperatura de alrededor de 40 °C después de 10 min de aplicación. Se observa mayor capacidad antioxidante con el tiempo de extracción. Sin embargo, los extractos muestran problemas de turbidez, los valores de transmitancia fueron de 81, 62, 34% (pulso 1), y de 95, 85, 81% (pulso 0,6) para 5, 10 y 15 min de extracción. La aplicación de ultrasonido y su eficiencia en los niveles de extracción dependen de factores como la matriz y/o, el tipo de solvente empleado, entre otros.
La EM (800 W) fue favorecida con el aumento de ciclos aplicados (tabla 4). Asimismo, el porcentaje de extracción con respecto al valor inicial se incrementó alcanzando valores máximos al séptimo ciclo (3.5 min de aplicación de microondas). Es importante señalar el aumento de temperatura por efecto de la radiación aplicada (20 a 65 °C) en cada ciclo. En la extracción de fenoles totales, taninos y flavonoides de hojas de jaca, se obtuvo un buen rendimiento a 900 W; sin embargo, extracciones hechas a 600 W y 1200 W reducen el rendimiento de la extracción por exceso o defecto de radiación aplicada; un exceso genera un sobrecalentamiento interno, afectando la estructura de compuestos fenólicos.21
Al comparar los diversos métodos de extracción (figura 1) se observó que la cantidad de fenoles obtenidos empleando EU dentro de los métodos no convencionales fue la que obtuvo mejores resultados. Sin embargo, los extractos muestran turbidez. Los resultados en fenoles totales son altos en la EC a 92 °C con 1 y 2 % de hojas de moringa, pero sus extractos muestran problemas de turbidez que no se presentan en la EC al 1 % y 0,5 % de hojas de moringa a 85 °C. Al observar el Δ % de extracción con respecto al método empleado se observa que la EU tiene un Δ % bajo; sin embargo, muestra mayor eficacidad por el contenido de fenoles extraídos respecto a los demás métodos por efecto de la alta energía trasmitida en la extracción; concentraciones al 0.5 % de hojas de moringa muestran mayor Δ (%) que el resto, se resalta la EM por el corto tiempo aplicado (7 ciclos equivalentes a 3,5 min), en cambio el contenido de fenoles totales es menor comparado con los métodos de EC y la EU al 1 %. La EE no fue favorable, toda vez que sus resultados son similares al blanco sin enzima.
Comparación con muestras comerciales y elaboración de la bebida
De los métodos no convencionales evaluados, la EU alcanza altos valores de extracción; sin embargo, sus extractos muestran turbidez, su aplicación a nivel industrial presentaría además limitaciones en cuanto al dimensionamiento de sus equipos, por lo que la EC muestra ventajas sobre ellos.
En la comparación de las características antioxidantes con muestras comerciales Prototipo A y B (bebidas de té verde, tabla 5) cuyas características antioxidantes fueron determinadas en este trabajo y los extractos acuosos de hojas de moringa con 1 y 0,5 % de hojas de moringa obtenidos a 85 °C con un tiempo de extracción de 8 min y que muestran altos valores en el menor tiempo de extracción (tabla 1), se observa que los extractos acuosos de hojas de moringa con 1 % poseen mayor capacidad antioxidante que las muestras comerciales; los extractos al 0,5 % obtenidos muestran resultados similares e incluso superiores al producto comercial A.
Los extractos de hojas de moringa a 1 % obtenidos a 85 y 92 °C poseen un sabor herbáceo similar a haba cruda por lo que se consideró emplear una concentración de 0,5 % de hojas de moringa. Filtrantes comerciales de diversas especies de hierbas aromáticas (te puro, boldo, hierba luisa, manzanilla, anís) contienen entre 0,9 y 1,4 g de hierba contenidos en una bolsita para una taza, que equivalen a una concentración de 0,3 a 0,5%. Trabajos similares señalan que la capacidad antioxidante es mayor en infusiones de hojas de moringa obtenidas a menores tiempos que en una decocción.8 Considerando tales observaciones se preparó una bebida a una concentración de 0,5% de hojas de moringa y una temperatura de extracción de 85 °C en un tiempo de 8 min.
Después de la pasteurización el contenido de fenoles totales fue de 3422,1 ± 44 µmol TR/L., CA Cuprac de 1 916,3 ± 40,4 µmol TR/L y un % de inhibición DPPH* de 7,6 ± 0,1%.
Estabilidad de la bebida
La estabilidad de la bebida se analizó durante 28 d en la cual los valores de pH y de acidez expresada como % de ácido cítrico se mantuvieron constantes; sin embargo, esta última se incrementó de 0,036 a 0,050 en la última semana a la temperatura de 35 °C.
La tabla 6 muestra el contenido de fenoles totales, CA Cuprac y el % de Inhibición DPPH* en el periodo de evaluación de 28 d. También se muestra el porcentaje de retención (% R) el cual se calcula dividiendo el valor de la característica antioxidante entre su valor inicial y multiplicando por 100 y el porcentaje de atenuación (A %) al final de periodo que resulta de la diferencia entre el % de retención final y el inicial.
Los parámetros cinéticos de degradación muestran constantes de velocidad muy bajos para este tipo de matriz alimentaria. Los valores de k (d-1) fueron los siguientes: fenoles totales 0,0039, CA Cuprac 0,002 7 y % inhibición DPPH 0,009 1, los coeficientes de determinación r2 fueron 0,81, 0,51, 0,64 y los tiempos de vida media señalan un tiempo de 6.4 meses para el contenido de fenoles, 8,8 meses para la CA Cuprac y 2,8 meses para el % inhibición DPPH a 25 °C, respectivamente.
Las bebidas mantenidas a 10 y 25 °C, conservan sus características sensoriales de “me gusta”, en cambio las bebidas mantenidas a 35 °C disminuyen esta característica a “me gusta ligeramente” en el periodo evaluado. Las características sensoriales de la bebida de la bebida elaborada son favorables con la formulación empleada y después del procesamiento seguido.
Conclusiones
Se compararon diversos métodos de extracción considerando sus características antioxidantes. Se encontró que la EC (92 °C, 1 y 2%) y EU (pulso 0,6, 1 %) muestra mayor capacidad antioxidante. Sin embargo, estos extractos muestran turbidez. La EC (85 °C, 0,5 a 1%) muestra capacidad antioxidante comparable a las muestras comerciales. Sin embargo, el extracto a 1% posee un sabor no aceptable. La EE no mostró resultados favorables. Como método más adecuado se consideró la EC a 85 °C, 0,5 % de hojas de moringa y un tiempo de extracción de 8 min; con estas condiciones se elaboró una bebida cuya estabilidad antioxidante fue evaluada durante 28 d, al inicio el contenido de fenoles totales fue de 3 422,1 ± 44 µmol TR/L., CA Cuprac de 1 916,3 ± 40,4 µmol TR/L y un % de inhibición DPPH* de 7,6 ± 0.1 %, el % de retención a 25 °C al final del periodo de almacenamiento de 28 d fue de 90, 91 y 84 % respectivamente, el periodo de vida media de la bebida en términos del contenido de fenoles totales fue de 6,4 meses a 25 °C. Los resultados de evaluación sensorial calificaron la bebida como “me gusta”. Los resultados de esta investigación propician una metodología en el desarrollo de prototipos de bebidas saludables más ajustados a las necesidades del consumidor ricos en antioxidantes y sin azúcar en remplazo de bebidas tradicionales.
