INTRODUCCIÓN
Los parasitosis causadas por nemátodos gastrointestinales en rumiantes representan un serio problema a nivel mundial ya que afectan la productividad de los animales infestados, debido a que tienen un impacto negativo sobre la tasa de crecimiento, la condición corporal y la fertilidad; aumentan la susceptibilidad a enfermedades de diferentes orígenes e incrementan la mortalidad ocasionando pérdidas económicas muy importantes en la producción pecuaria (Felice, 2015; Angel, Arrieta y Fernández, 2015). Se trata de una enfermedad multietiológica ocasionada por la acción conjunta de varios géneros y especies de parásitos, por lo que se consideran un complejo parasitario que afecta por igual a todos los organismos (Dorta-Contreras, 2007).
Durante las últimas cuatro décadas se han desarrollado moléculas sintéticas antiparasitarias de gran eficacia, amplio espectro y bajo efecto residual (Dorta-Contreras, 2007). Sin embargo, en la actualidad el tratamiento de esta enfermedad se ha complicado debido a la resistencia a fármacos comerciales por lo que es necesario utilizar alternativas para el control de estos patógenos resistentes o multirresistentes, una de las cuales puede ser el uso de metabolitos secundarios de plantas con actividad antibacteriana y/o sobre nematodos gastrointestinales (Hernández-Alvarado et al., 2018; Medina et al., 2014; Epe y Kaminsky, 2013; Satyajit y Lutfun, 2012). En esta dirección existen numerosas investigaciones que han abordado el estudio del potencial nutracéutico de diversas plantas, entre ellas D. cinerea, cuyo uso aún no se ha extendido en Cuba. Particularmente se señala su efectividad en el control de nemátodos gastrointestinales (Arece, Roche, López y Molina, 2012) por lo que resulta válido asumir que el uso de la biomasa comestible de esta planta podría ser una alternativa eficaz para el control de parasitosis en pequeños rumiantes.
Por tanto, el objetivo de la presente investigación es evaluar la actividad antihelmíntica “in vitro” de extractos acuosos obtenidos por diferentes métodos a partir de las legumbres, hojas de plantas adultas y rebrotes de D. cinerea, previamente secadas y molinadas.
MATERIALES Y MÉTODOS
La investigación se realizó en el laboratorio de microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas. El material vegetal se obtuvo de las legumbres, rebrotes tiernos y hojas de plantas adultas de D. cinerea establecidas en áreas pertenecientes a la Cooperativa de Créditos y Servicios “El Vaquerito”, ubicadas en la carretera a Camajuaní km 2.5, Santa Clara, provincia de Villa Clara, Cuba. El período de recolección abarcó los meses de abril y mayo de 2017.
Obtención y preparación del material vegetal
La biomasa colectada fue sometida a deshidratación en estufa a temperatura de 45 °C durante cinco días. Además, a las legumbres se le dio un golpe de estufa a 60 °C durante treinta minutos. Posteriormente se molió en un micromolino de cuchillas a 3000 rpm, el material vegetal molinado fue pasado por un tamiz interno de 3 mm y se almacenó en frascos herméticos hasta la realización del ensayo.
Preparación de los extractos acuosos
Se ejecutó el siguiente procedimiento secuencial:
Por cada material vegetal se obtuvo una solución madre, para lo cual se tomaron 40 g de legumbres y 10 g de hojas de plantas adultas y de rebrotes tiernos, respectivamente, se le añadió agua destilada a temperatura de ebullición (100 oC) hasta completar 100 mL.
Después de someter la solución madre a 30 minutos de reposo, se obtuvieron los extractos acuosos mediante infusión, decocción (10 minutos) y maceración.
Cada extracto fue filtrado con papel de filtro de porosidad media, se le midió el pH con pHmetro METROM( modelo 520 y se corrigió a pH neutro con una sustancia búfer a base de bicarbonato de sodio.
Por último, los extractos fueron diluidos a diferentes concentraciones (infusión y decocción al 10 % y maceración al 10, 15 y 20 %), para un total de 15 tratamientos (cinco en cada tipo de material vegetal). Éstos fueron contrastados con cuatro tratamientos controles consistentes en dos antiparasitarios comerciales de efectos conocidos - control positivo - (Piperazina 1 % y Levamisol 10 %)- de comprobada actividad antihelmíntica y dos controles negativos (solución nutricia de Prosser y Zimmerman, y agua destilada).
Protocolo experimental
Se utilizó como modelo biológico la lombriz de tierra (Lumbricus terrestris Linnaeus, 1758), cuyos individuos fueron extraídos cuidadosamente del medio de cultivo donde se mantuvieron a temperatura entre 25 y 27 ºC, humedad relativa de 80 %, pH neutro y alimentación rica en materia orgánica. Posteriormente fueron transferidos a un recipiente con agua destilada para su lavado y selección según tamaño asegurando así una longitud uniforme con diferencias inferiores a ±3,0 mm. Para cada tratamiento, incluidos los controles, se empleó una placa de Petri de 9,5 cm de diámetro, en las que se añadieron 10 mL del extracto en cuestión y seis lombrices (réplicas).
Todas las placas de Petri se colocaron en el laboratorio de parasitología manteniéndose a temperatura estable entre 25 y 27 oC.
La actividad antihelmíntica se determinó según el procedimiento reportado por Ejiofor, Zaman y Das (2017), se registró el tiempo, en minutos, requerido para la parálisis y muerte de las lombrices. Como criterio de parálisis se utilizó la detención de los movimientos respecto a su motilidad normal, mientras que la muerte se determinó cinco minutos después de detectada la parálisis. Para ello se colocaron las lombrices en tubos de ensayos de 25 mm de diámetro con 10 mL de agua destilada a temperatura de 45oC durante 10 segundos, para estimular e inducir movimientos en ellas, si aún se encuentran vivas. Durante el ensayo se mantuvo estricta observación de los cambios en la motilidad y alteraciones en el tegumento de las lombrices, tanto de forma visual como con auxilio del estereoscopio.
Análisis estadístico
Los datos primarios fueron tabulados en Microsoft Office Excel 2010, para su posterior procesamiento mediante el paquete estadístico Statgraphics Centurion versión XVI.I (Statistical Graphic Corp. USA, 2006). Previa comprobación de la normalidad de los datos (prueba de Kolmogorov-Smirnov) y de la homogeneidad de las varianzas (prueba de Cochran), se ejecutó un análisis de variancia multifactorial (ANOVA multifactorial) sin interacción para comparar los efectos de los métodos de extracción, el tipo de material vegetal y la concentración de los extractos obtenidos, tanto para los tiempos de parálisis como de muerte. Los efectos de las partes de la planta en los extractos obtenidos mediante infusión y decocción se compararon mediante la prueba de t-Student.
Declaración de datos
El presente estudio forma parte del protocolo de investigación doctoral de la autora principal, por lo que el fichero de datos primarios y las salidas de las técnicas estadísticas empleadas sólo se enviarán mediante petición escrita de los editores de la revista.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Actividad antihelmíntica de las soluciones control
En las lombrices colocadas en la solución de Piperazina al 1 % se aprecia una parálisis flácida al cabo de los 13 minutos de aplicación. La muerte del 100 % ocurrió como promedio a los 41 minutos. Esto coincidió con lo reportado por Flores (1996), quien señala que la Piperazina actúa sobre la unión mioneural o placa motriz de las lombrices produciendo parálisis flácida. Sin embargo, no concuerdan con los obtenidos por Hukkeri, Kalyani, Harpali y Manui (1993), en un estudio similar con lombrices de la especie Pheritima postuma ya que encontraron que la parálisis y la muerte se produjeron a los 40 y 60 minutos, respectivamente. Esta diferencia puede ser atribuida al modelo experimental utilizado en cada ensayo.
Al colocar las lombrices en el control positivo de Levamisol al 10 %, se produjo la muerte a los dos minutos de iniciado el experimento, con una parálisis espástica. En todos los casos, la parálisis de las lombrices va precedida de una ligera excitación caracterizada por contracciones, movimientos en forma de látigo, estiramientos y encogimientos para tratar de escapar del medio. Todo esto conduce finalmente a la muerte de la lombriz. Flores (1996) reportó un comportamiento similar cuando empleó fármacos convencionales en terapia contra la helmintiasis.
En los controles negativos (solución nutricia de Prosser y Zimmerman, y agua destilada) las lombrices conservaron su motilidad por un período superior a las 48 horas, y no se apreciaron alteraciones del tegumento. Las lombrices se encontraban agrupadas y respondieron a estímulos físicos. Por todo lo anteriormente señalado se descartan las muertes por causa de otros factores que no fuese la acción de las sustancias evaluadas.
Actividad antihelmíntica de los extractos acuosos al 10 % obtenido por infusión y decocción, respectivamente
Las Tablas 1 y 2 muestran que, al comparar el efecto antihelmíntico de la infusión y decocción al 10 %, no se apreciaron diferencias significativas para la muerte, aunque si ocurre la muerte. Este comportamiento demuestra que ambos métodos de extracción, independientemente del tipo de material vegetal, extraen en magnitud similar los principios activos responsables de la actividad vermífuga. Estos principios activos constituyen los metabolitos secundarios responsables de la actividad antiparasitaria tal como ha sido reportado por Arece, Roche, López y Molina (2012) al suministrar extractos acuosos de D. cinerea a ovejas. Al respecto se destacan los triterpenos por su potencial nematicida (Rodés, Peña y Hermosilla, 2015) y los taninos ya que pueden unirse a enzimas y alterar el metabolismo microbiano, afecta las funciones vitales, la movilidad, la nutrición y posiblemente, la reproducción (Medina et al., 2014).
Varios autores sostienen que el consumo de plantas ricas en metabolitos secundarios y especialmente aquellas que contienen taninos y otros compuestos fenólicos, constituye una alternativa para el control de nemátodos gastrointestinales en ovinos y caprinos (Hernández et al., 2014) y en equinos (Chicaiza-Tisalema et al., 2016). En este sentido Aguilera-Valle, Delgado-Martínez y Salas-Romero (2015) sugieren que D. cinerea puede ser efectivo en tratamientos antihelmínticos sobre poblaciones de ciatostomas resistentes a Albendazol, aunque son necesarios estudios in vivo para confirmar sus propiedades antihelmínticas y evaluar su uso en el manejo sostenible de esta parasitosis.
Método de obtención del extracto | EE ± | |||
---|---|---|---|---|
Rebrotes | Hojas de planta adulta | Legumbres | ||
Infusión al 10 % | 178,33bM | 132,00cM | 366,67aN | 9,07 |
Decocción al 10 % | 118,67bN | 103,17bM | 394,00aM | 4,92 |
EE ± | 12,27 | 17,78 | 8,66 | |
Soluciones control | ||||
Piperazina 1% | 13 | |||
Levamisol 10% | 0 |
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
M, N superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
Método de obtención del extracto | EE ± | ||||
---|---|---|---|---|---|
Rebrotes | Hojas de planta adulta | Legumbres | |||
Infusión al 10 % | 462,50aL | 309,17aL | 390,83aM | 26,52 | |
Decocción al 10 % | 360,17bM | 395,17abL | 457,00aL | 28,71 | |
EE ± | 61,29 | 69,12 | 17,93 | ||
Piperazina 1% | 41 | ||||
Levamisol 10% | 2 |
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
L, M superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
A pesar de lo planteado anteriormente, los tratamientos presentaron menor efectividad que la Piperazina al 1 %.
Actividad antihelmíntica de los extractos acuosos al 10, 15 y 20 % obtenidos por maceración
Las Tablas 3 y 4 muestran los resultados correspondientes a los extractos al 10, 15 y 20 % obtenidos por maceración, cuya actividad biológica es dependiente de la concentración, las más efectivas fueron al 20 y 15 %, en ese orden.
Método de obtención del extracto | EE ± | |||
---|---|---|---|---|
Rebrotes | Hojas de planta adulta | Legumbres | ||
Maceración al 10 % | 1996,41aL | 536,67bL | 185,82cL | 81,79 |
Maceración al 15 % | 1180,83aM | 56,67cM | 196,67bL | 26,35 |
Maceración al 20 % | 131,17bN | 30,67cM | 148,33aM | 3,60 |
EE ± | 27,84 | 81,26 | 4,33 | |
Soluciones Control | ||||
Piperazina 1% | 13 | |||
Levamisol 10% | 0 |
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
M, N superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
Método de obtención del extracto | EE ± | ||||
---|---|---|---|---|---|
Rebrotes | Hojas de planta adulta | Legumbres | |||
Maceración al 10 % | 2660,83aL | 1050,73bL | 221,67cM | 81,36 | |
Maceración al 15 % | 1924,00aM | 192,67bM | 240,00bL | 60,88 | |
Maceración al 20 % | 389,17aN | 110,33cM | 185,00bN | 15,21 | |
EE ± | 98,33 | 29,66 | 2,95 | ||
Soluciones control | |||||
Piperazina 1% | 41 | ||||
Levamisol 10% | 2 |
a, b, c superíndices desiguales por fila difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
L, M, N superíndices desiguales por columna difieren para P < 0,05 (prueba de Tukey)
La obtención de los extractos por este método (maceración) propició una mayor extracción de metabolitos secundarios, los cuales son responsables de la actividad antihelmíntica demostrada en el presente estudio.
El efecto antihelmíntico de los extractos contrastados en condiciones “in vitro” ha quedado demostrado en el presente estudio, cuyo modo de acción se debe probablemente a la presencia de compuestos fenólicos, principalmente taninos (Chicaiza-Tisalema et al., 2016; Ferreira et al., 2015), los cuales tienen capacidad para formar complejos con las proteínas de los parásitos (Alonso-Díaz, Torres-Acosta, Sandoval-Castro y Hoste, 2010), afectándose así la biología y supervivencia de los nemátodos. La existencia de otros metabolitos secundarios (alcaloides, terpenoides), unido al alto contenido de proteínas y carbohidratos en las hojas (Martín-Casas et al., 2017; Heuzé, Tran y Giger-Reverdin, 2016; Vijayalakshmi, Periyanayagam, Kavitha, Akilandeshwar, 2013) le confieren a D. cinerea un potencial nutracéutico de inestimable valor para alimentación y salud de los animales que la consumen (Marius et al., 2018), a la vez que su empleo productivo constituye una alternativa agroecológica para el control de esta planta exótica invasora (Reinoso-Pérez, Joseau y Valdez, 2019) y para reducir la metanogénesis ruminal (Vélez-Terranova, Campos-Gaona, Sánchez-Guerrero, 2014), mejora la eficiencia de fermentación y reduce las emisiones atmosféricas de este gas de efecto invernadero.
Los estudios conducidos por Araújo-Alves et al. (2017) concluyeron que las fracciones proteicas contenidas en las hojas, tallos y raíces de Spigelia anthelmia también intervienen en el control de nemátodos gastrointestinales, por lo que puede inferirse que ello es válido para la biomasa comestible de D. cinerea, en adición, las fracciones no comestibles, como la corteza y la raíz, contienen una amplia diversidad de metabolitos secundarios (Rodés, Peña y Hermosilla, 2015), muchos de ellos responsables de los efectos antiparasitarios atribuidos a esta planta.
CONCLUSIONES
Todos extractos obtenidos a partir de las legumbres, rebrotes y hojas de plantas adultas de D. cinerea mostraron actividad antihelmíntica “in vitro”.
La efectividad “in vitro” de los extractos obtenidos por maceración sobre la supervivencia de las lombrices es dependiente de la concentración, los más efectivos fueron al 20 y 15 %, en ese orden