Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa para la identificación del virus sincitial respiratorio

Lic. LUIS SARMIENTO, Lic. DANAY CHACÓN,¹ Dr. ÁNGEL VALDIVIA, Lic. CLARA SAVÓN y Dr. ÁNGEL GOYENECHEA

RESUMEN

Se desarrolló la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) para la identificación del virus sincitial respiratorio (VSR) con el uso de la cepa de referencia. La alta sensibilidad y la especificidad obtenidas en nuestro trabajo demuestran la utilidad de la RCP para la detección del genoma del VSR y su aplicación en el diagnóstico.

Descriptores DeCS: REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; VIRUS SINCITIAL RESPIRATORIO HUMANO/aislamiento y purificación.

El virus sincitial respiratorio (VSR) es la causa más importante de infecciones del tracto respiratorio en niños pequeños, las enfermedades más frecuentes asociadas a la infección por este virus son la bronquiolitis y la neumonía.¹

El método clásico para el diagnóstico del VSR es el aislamiento en cultivo celular, pero puede conllevar a resultados falsos negativos ya que este virus es extremadamente lábil. Además, el cultivo puede necesitar de 2 a 4 semanas para dar el diagnóstico definitivo. Por esto, en el momento actual se impone el uso de técnicas de diagnóstico rápido con alta sensibilidad y especificidad que permitan una mejor evaluación clínico-terapéutica.²

En el presente trabajo reportamos la aplicación de la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) para la identificación del VSR con el uso de la cepa de referencia Long perteneciente al subgrupo A del VSR.

El método aplicado, según Cane y Pringle,³ consistió en extracción de ARN resuspendiendo el precipitado celular en 0,5 mL de buffer de lisis (3,5 M de urea, Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, MgCl₂ 0,75 mM, SDS 0,5 %, NP40 0,35 %). El ácido nucleico fue purificado por 2 extracciones con fenol-clorofomo y precipitación alcohólica.

TABLA. Secuencia de los cebadores utilizados en la RCP

Cebador	Secuencia	Localización
708	5' GGAACAAGTTGTTGAGGTTTATGAATATGC 3'	858-877
714	5' CTTCTGCTGGCAAGTCTAGTACACTGTAGT 3'	1116-1135

Nota: Estos cebadores son complementarios a una región altamente conservada del gen que codifica para la nucleoproteína.³

Para la síntesis de ADN complementario y su amplificación, al ARN extraído se le añadió buffer de amplificación 10X (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl), MgCl₂ 25 mM, dNTP 25 mM (Promega), 100 ng de ambos cebadores (tabla) y 5 U de transcriptasa inversa (Boehringer). Después de una incubación de 30 min a 42 °C se añadió buffer de ampli- ficación 0X, MgCl₂ 25 mM, agua tratada con dietil pirocarbonato y 2,5 U de Taq ADN polimerasa (Boehringer). La amplificación fue realizada en 30 ciclos en un termociclador Perkin-Elmer Cetus a las temperaturas de desnaturalización 93 °C, hibridación 55 °C, y polimerización 72 °C, cada una, durante un tiempo de 1,5 min.

Para medir la sensibilidad de nuestro sistema realizamos diluciones del virus desde 10^-1 hasta 10^-10 y a cada dilución se le aplicaron en paralelo las técnicas de inmunofluorescencia indirecta para la detección de antígenos celulares,⁴ conteo de placas para cuantificar partículas virales⁵ y reacción en cadena de la polimerasa para la detección del genoma viral.

Como resultado de este experimento, la inmunofluorescencia indirecta detectó células fluorescentes que expresaban antígenos del VSR hasta la dilución 10^-3, el conteo de placa detectó partículas virales infectivas hasta la dilución 10^-3 y la RCP detectó el genoma viral hasta la dilución 10^-4 (figura 1).

FIGURA 1. Sensibilidad de la RCP para la detección del virus sincitial respiratorio (cepa Long) en gel de agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio. P = Patrón de peso molecular (PBR 322) digerido con Hae III. 1=Dilución 10^-1. 2=Dilución 10^-2. 3=Dilución 10^-3. 4=Dilución 10^-4.
Posteriormente, los productos de la RCP fueron transferidos a membrana de nailon (Hybond N⁺, Amersham, Bucks, UK) y sometidos a la técnica de hibridación de ADN⁶ para medir la sensibilidad del método de coloración empleado. Los resultados que se obtuvieron (figura 2) fueron los mismos, no se detectaron fragmentos más allá de la dilución 10^-4, lo que demuestra una correcta optimización del método de coloración utilizado en nuestro trabajo. Con estos resultados se aprecia la mayor sensibilidad de la RCP con respecto a los métodos tradicionales de detección del virus y sus antígenos, lo que coincide con lo reportado por White y otros.⁷
Para la determinación de la especificidad del sistema se tomaron suspensiones de células infectadas por los virus sarampión, parainfluenza III, influenza A y B, Adenovirus tipo 7 y VSR. Además, se incluyó un exudado nasofaríngeo de un niño asintomático y todos fueron sometidos a la técnica de RCP. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 3, en donde se observa un único fragmento que en su talla corresponde con el generado por los cebadores para el VSR, lo que demuestra la alta especificidad de los cebadores usados, esto concuerda con lo reportado por Cane y Pringle.⁸

FIGURA 2. Hibridación sobre productos de la RCP. 1=Dilución 10^-1. 2=Dilución 10^-2. 3=Dilución 10^-3. 4=Dilución 10^-4.

FIGURA 3. Especificidad de la RCP para otros virus respiratorios. P = Patrón de peso molecular (PBR 322 digerido con Hae III). 1=Exudado nasofaríngeo de paciente asintomático. 2=Cepa Long. 3=Adenovirus tipo 7. 4=Sarampión. 5=Influenza tipo A. 6=Influenza tipo B. 7=Parainfluenza tipo III.
Es necesario aclarar que los riesgos de contaminación en la RCP, ya sea por los reactivos y soluciones empleados durante la técnica o por aerosoles generados de una muestra a otra, así como por la presencia de "amplicones" en el medio ambiente, quedaron descartados por los controles negativos recomendados por Kitchin y otros,⁹ los cuales fueron incluidos durante todos los experimentos, además, el análisis de los productos finales de la RCP fue realizado en áreas separadas de donde se efectuó el protocolo de PCR.
Los resultados de este trabajo demuestran que la RCP para la detección del genoma del VSR es un método rápido, específico y más sensible que la inmunofluorescencia indirecta y el aislamiento viral. Además, la RCP puede ser fácilmente automatizada y los resultados no están influenciados por condiciones desfavorables durante el transporte de las muestras al laboratorio.

Esta técnica representa una excelente herramienta para el diagnóstico rápido (aproximadamente 12 h) del virus sincitial respiratorio. Por todo lo antes expuesto proponemos la aplicación de este método para la detección del genoma viral a partir de muestras clínicas.

AGRADECIMIENTOS

Al doctor José A. Melero director del Centro Nacional de Biología Celular y Retrovirus de Madrid, España, por su gentil donación de los cebadores utilizados en este trabajo.

SUMMARY

The polymerase chain reaction (PCR) was developed in order to identify the respiratory syncytial virus by using the reference strain. The high sensitivity and specificity obtained show the PCR utility for detecting the RSV genoma and its application on the diagnosis.

Subject headings: POLYMERASE CHAIN REACTION/methods; RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS, HUMAN/isolation and purification.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. McIntosch K, Chanock RM. Respiratory Syncytial Virus. En: Fields BM, Knipe IM. Virology. 2 ed. New York: Raven, 1990:1045-66.
2. Stoker NG. The polymerase chain reaction and infectious disease: hopes and realities. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1990;84:755-8.
3. Cane PA, Pringle CR. Molecular epidemiology of respiratory syncytial virus: rapid identification of subgroup A lineages. J Virol Methods 1992;40:297-306.
4. Gardner PS, McQuillin J. Application of immunofluorescent antibody technique in rapid diagnosis of respiratory syncytial virus infection. Br Med J 1968;3:340-3.
5. Kish AL, Johnson KM. A plaque assay for respiratory syncytial virus. Proc Soc Exp Biol Med 1963;112:583-9.
6. Maniatis T, Frisch EF, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989:9-36.
7. White TJ, Madej R, Persing DH. The polymerase chain reaction: clinical application. Adv Clin Chem 1992;29:161-96.
8. Cane PA, Matthews DA, Pringle CR. Analysis of relatedness of subgroup A respiratory syncytial viruses isolated worldwide. Virus Res 1992;25:15-22.
9. Kitchin PA, Bootman JS. Quality control of the polymerase chain reaction. Med Virol 1993;3:107-14.

Recibido: 28 de febrero de 1996. Aprobado: 22 de octubre de 1996.

Lic. Luis Sarmiento. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.