Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil

Confirmación de la presencia en Cuba del virus linfotrópico tipo I de las células T humanas mediante la reacción en cadena de la polimerasa

Dr. FELIPE ROLO GÓMEZ,¹ Lic. MADELINE BLANCO DE ARMAS,² Lic. JORGE MATO LUIS,³ Dra. ANA LUISA LUBIÁN CABALLERO⁴ y Dr. HÉCTOR DÍAZ TORRES⁵

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1. Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Agregado. Jefe del Departamento de Inmunología.
2. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
3. Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
4. Especialista en I Grado en Epidemiología. Investigador Agregado.
5. Especialista en I Grado en Medicina Interna. Investigador Agregado.

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RESUMEN

Se estudiaron por reacción en cadena de la polimerasa los primeros casos diagnosticados en Cuba como seropositivos al HTLV-I/II (virus linfotrópicos de las células T humanas), con el objetivo de diferenciar el tipo de virus causante de la infección. Se utilizaron 3 juegos de oligonucleótidos cebadores y los productos de amplificación fueron detectados mediante hibridación con oligosondas específicas. El 100 % de los casos resultaron positivos para el HTLV-I, no se encontró positividad para el HTLV-II. Se confirmó la presencia en Cuba de este retrovirus, aunque la seroprevalencia es baja si se tiene en cuenta que el Caribe es una zona endémica para el HTLV-I.

Descriptores DeCS: HTLV-I/aislamiento & purificación; INFECCIONES POR HTLV-I/sangre; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; OLIGONUCLEOTIDOS/uso diagnóstico; JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; CUBA.

Los virus linfotrópicos de células T humanas tipos I y II (HTLV-I y HTLV-II) son los primeros retrovirus humanos conocidos y fueron reportados en 1980 y 1982, respectivamente.^1,2 Desde un inicio, el HTLV-I fue asociado con la enfermedad conocida como leucemia linfoma de células T del adulto (ATL) y con otra entidad neurológica conocida como mielopatía asociada al HTLV-I/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Sin embargo, el HTLV-II fue relacionado inicialmente con la leucemia de las células velludas, pero en la actualidad esto aún no ha sido totalmente demostrado y no existen evidencias que confirmen su vinculación con éstas u otras enfermedades. El diagnóstico serológico en ambos casos, se realiza mediante el pesquisaje de anticuerpos en el suero o plasma de las personas estudiadas, para lo cual se emplean diferentes tipos de ensayos y además se requieren pruebas de confirmación como la inmunoelectrotransferencia (WB) y la radioinmunoprecipitación (RIPA). Debido a que la homología existente entre los genomas de ambos virus llega a ser del 65 %, las pruebas serológicas basadas en antígenos naturales no permiten diferenciar la respuesta de anticuerpos contra uno u otro, por lo que en la actualidad se emplean otras pruebas de antígenos recombinantes o péptidos sintéticos, aunque los mejores resultados se obtienen con la amplificación de regiones específicas del genoma mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP).^3,4

La infección por HTLV-I es de una elevada endemia en la región del sureste asiático y en el área del Caribe, donde se reportan rangos de seroprevalencia entre 5 y 20 %, resulta además endémica en zonas de África y de América Central y del Sur.

La distribución geográfica del HTLV-II no está bien definida, pero se reporta una alta incidencia en drogadictos en los Estados Unidos y Europa. Los estudios realizados en Cuba han mostrado una baja seroprevalencia para HTLV--I/II, a pesar de que nuestro país está situado en una zona endémica; hasta la fecha ha sido detectado y confirmado como seropositivo al HTLV-I/II un total de 11 personas.^4-6 El presente trabajo reporta el estudio mediante RCP de los primeros casos diagnosticados en Cuba, con el objetivo de poder diferenciar el tipo de virus que infecta a esta población, y en consecuencia brindarle un servicio especializado de atención médica y consejería.

MÉTODOS

MUESTRAS

Como resultado de la vigilancia seroepidemiológica en diferentes grupos de riesgo se ha encontrado en Cuba, hasta el momento, un total de 11 personas que ha sido diagnosticado como seropositivo al HTLV-I/II, para lo cual emplearon un ELISA y un WB de producción nacional (antígeno natural) que están registrados en el país por la firma DAVIHLAB-I/II. todas estas personas fueron informadas de su condición y accedieron a cooperar en la investigación. Tres de ellas pertenecen al grupo de pacientes portadores de hemopatías y 2 al grupo de nefrópatas, otros 3 son donantes voluntarios de sangre y 3 son familiares del grupo de contactos estudiados.

Se les tomó una muestra de sangre total (20 mL) con anticoagulante, de la cual se obtuvieron las células mononucleares mediante gradiente de ficoll-paque. Igualmente se procedió con las muestras de 10 individuos seronegativos al HTLV-I que procedían de bancos de sangre.

CONTROLES

Como controles positivos se utilizaron ADN de la línea celular MT₂ crónicamente infectada con HTLV-I en diferentes diluciones, además, el ADN obtenido a partir de la sangre de la primera paciente diagnosticada como seropositiva y que falleció a causa de una leucemia linfoma de las células T, dicha muestra había resultado positiva anteriormente mediante un dot blot con una sonda específica para HTLV-I. Como control negativo se utilizó ADN de una línea celular no infectada y un control de reactivos (mezcla de reacción sin ADN).

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (RCP)

El ADN se obtuvo por el método de proteinasa K/SDS y extracción con fenol-cloroformo-alcohol isoamílico y la cantidad utilizada para nuestro estudio fue de 1 Fg.⁷ Para el desarrollo de la RCP se emplearon 3 juegos diferentes de oligonucleótidos cebadores, correspondientes al gen Gag se utilizaron los oligos HTL 116/117 específico para el HTLV-I y HTL 216/217 para el HTLV-II; además, se utilizaron los oligos E30 y E34 que amplifican una región del gen ENV del HTLV-I (tabla).⁸ La RCP se realizó por duplicado en todas las muestras y se utilizó el siguiente programa con 40 ciclos de amplificación: 98 EC, 1 min de desnaturalización; 48 EC, 1 min de alineamiento y 72 EC, 1 min de extensión; además de 72 EC, 5 min como extensión final.

Los productos amplificados se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa Seaplaque 1,5 % y coloración con bromuro de etidio, y se comparó la talla de los fragmentos obtenidos con un patrón de peso molecular. Por último, se realizó una hibridación en solución con las oligosondas correspondientes a la región interna del fragmento amplificado con cada juego de oligos cebadores, dichas oligosondas se marcaron el extremo 5 con la enzima PNK y gamma ATP³²P. (tabla). Los productos de dichas hibridaciones se separaron en una electroforesis en gel de poliacrilamida al 10 % y los geles se sometieron a autorradiografía.

TABLA. Relación de los oligonucleótidos empleados como sondas y cebadores en la PCR

 

Código	Oligo	Posición	Región
HTL116	TCT ATC CTC CAA GGC CTG GA	1613-1635	gag
HTL117	TGA CAA GCC CGC AAC ATA TC	1821-1802	gag
Sonda
HTL118	ATC TTA AGT TCC GCC TAC TCC A	1715-1739	HTLV-I
HTL216	CAA ATC CAC GGG CTT TCC CCA ACT CC	813-838	gag
HTL217	TTG CGT GGT GGG TTC CAG G	1208-1187	gag
Sonda
HTL218	GTC TCC CCT AGC GCC CCC GCC GCC GCC CC	1080-1105	HTLV-II
E30	TCA AGA AGT TCC AGG CCT CAA T	5627-5648	env
E34	GTC TAG GTT AGA GTG GGG AGT	5792-5771	env
Sonda
E33	ACC CCA TCT GGT TCC TTA ATA CCG A	5713-5735	HTLV-I

 

RESULTADOS

Las muestras seronegativas analizadas no mostraron productos de amplificación con ninguno de los juegos de oligos empleados. Todas las muestras de seropositivos fueron amplificadas con los 2 juegos de oligonucleótidos específicos al HTLV-I. En la figura se muestran los resultados obtenidos con el juego de oligonucleótidos HTK 116/117/118 que reconoce el gen Gag del HTLV-I.

FIGURA. Autorradiografía del gel de poliacrilamida al 10 %. Líneas del 1 al 3: diluciones de un control positivo (línea celular MT₂). Línea 4: control negativo (línea celular CEM). Líneas 5 a la 7 y de la 9 a la 15: ADN proveniente de los seropositivosasintomáticos. Línea 8: ADN de la primera paciente diagnosticada con leucemia linfoide de las células T.

Ninguna de las muestras analizadas reaccionó con el juego de oligonucleótidos HTL 216/217/218 del HTLV-II.

DISCUSIÓN

Estos resultados indican la presencia del HTLV-I en las personas seropositivas estudiadas, lo cual confirma la circulación de este retrovirus en nuestro país, mientras que no se confirmó la presencia del HTLV-II en nuestro medio.

Estos resultados son de elevado interés epidemiológico, pues a pesar de que Cuba se encuentra situada en una zona endémica, los estudios seroepidemiológicos han demostrado una baja prevalencia, y hasta este momento se desconocía si dicha prevalencia era consecuencia de infección por HTLV-I o por HTLV-II. Trabajos anteriores reportan el HTLV-I como endémico en la región del Caribe y con predominio de la transmisión por vía sexual, mientras el HTLV-II se reporta con mayor frecuencia en drogadictos de EE.UU. y Europa.^9-12 Haber logrado tipificar como HTLV-I los virus circulantes en la población estudiada hasta el momento, resulta igualmente interesante, si se tiene en cuenta que la patogenicidad del HTLV-I resulta diferente a la del HTLV-II.¹³

En el grupo de donantes, 2 de los 3 que se estudiaron tenían antecedentes de haber visitado países ubicados en zonas endémicas. En uno de estos pacientes no se puede descartar las relaciones sexuales con extranjeros por el tipo de actividad que realiza y su nivel cultural, aunque el estudio de sus contactos arrojó como seropositiva a su esposa y a la hija de ambos, por lo que en esta familia ha estado presente la vía de transmisión sexual y la vertical sin que se haya podido esclarecer cuál de los 2 cónyuges es el caso índice, ya que el esposo niega haber tenido relaciones en el extranjero. El otro individuo sí refiere contactos mantenidos durante meses en África, el estudio de sus familiares y contactos dio como seropositiva a su actual compañera. En el caso del tercer donante no se ha podido esclarecer todavía la probable fuente de infección.

En el grupo de nefrópatas⁴ y en 2 de los pacientes con hemopatías se recogió el antecedente de ser politransfundidos, por lo que se reconoce la transfusión sanguínea como probable fuente de infección.^4,5 Aunque no ocurre así con la primera diagnosticada y que falleció precisamente a consecuencia de una leucemia linfoma de células T del adulto, cuyo diagnóstico clínico y serológico de infección HTLV-I fue confirmado en la necropsia, pero en la cual no existían antecedentes de transfusiones previas ni se pudo llegar a delimitar la probable fuente de infección pues el estudio de familiares y contactos no ofreció ningún resultado positivo.

Es de señalar que en este grupo de seropositivos al HTLV-I confirmados ahora mediante el estudio con RCP, predominan las personas de la raza negra, lo cual ha sido reportado por otros autores;¹⁴ esto nos hace pensar que en nuestro medio debemos profundizar en los estudios de vigilancia epidemiológica fundamentalmente en aquellas regiones de nuestro país donde habitan comunidades descendientes de otros países vecinos del Caribe, en los que existe una elevada endemicidad para la infección por HTLV-I.^15,16

Los expertos reunidos en la Sexta Conferencia Internacional sobre Retrovirus Humanos (1994) sugirieron que el criterio de posivitidad para la infección por HTLV-I/II, debería requerir inmunoelectrotransferencia y además RCP o pruebas con péptidos sintéticos; por lo que consideramos que en nuestras condiciones la RCP resultó de utilidad, ya que aportó nuevos criterios de positividad en los casos que habían sido confirmados por la prueba de inmunoelectrotransferencia, además de permitirnos tipificar los virus.

Nuestro estudio contribuyó al conocimiento sobre la epidemiología molecular de esta infección viral, que si bien no constituye hasta el momento un problema de salud en nuestro país, su vinculación con enfermedades mortales o invalidantes nos obliga a mantener una adecuada vigilancia, como única vía posible de ejercer la prevención y el control sobre ésta, e impedir así su diseminación entre nuestra población.

SUMMARY

The first cases diagnoses in Cuba as HTLV-I/II seropositives (human T lymphotropic virus) were studied by polymerase chain reaction aimed at differentiating the type of virus causing the infection. 3 kits of primer oligonucleotides were used and the amplification products were detected by hybridization with specific oligoprobes. 100 % of the cases were HTLV-I positives. No HTLV-II positivity was found. It was confirmed the presence in Cuba of this retrovirus, eventhough the seroprevalence is low if it is taken into consideration that the Caribbean is an endemic zone for HTLV-1.

Subject headings: HTLV-I/isolation & purification; HTLV-I INFECTIONS/blood; POLYMERASE CHAIN REACTION/ /methods; OLIGONUCLEOTIDES/diagnostic use; REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; CUBA.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Poiesz BJ, Ruscetti FW, Gazdar AF, Bunn PA, Minna JD, Gallo RC. Detection and isolation of type C retrovirus particles from fresh and culture lymphocytes of a patient with cutaneous T-cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci USA 1980;77:7415-9.
2. Kalynaraman VS, Sarngadharan MG, Robert-Guroff M, Miyoshi I, Blayney D, Golde D, et al. A new subtype of human T-cell leukemia virus (HTLV-II) associated with a T-cell variant of hairy cell leukemia. Science 1982;218:571-3.
3. Soriano V, Heredia A. Sexta Conferencia Internacional sobre retrovirus humanos. SEISIDA 1994;5(8):456-61.
4. Rivero RA, Hernández P, Suárez O, Hidalgo-Gato R, Navea L, Yamaguchi K, et al. Detección de anticuerpos contra el virus linfotrópico de la célula T HTLV-I/II en pacientes cubanos con insuficiencia renal crónica en hemodiálisis. Sangre 1992;37 (3):05-9.
5. Hernández PR, Rivero RJ, Ballester JM, Navera LM, Matutes E, Catosvsky D, et al. Very low seroprevalence of HTLV I/II in Cuba: antibodies in blood donors and in hematological and non-hematological patients. Vox Sang 1991;61:277-8.
6. Navea LM, Silva E, Rivero R, Hernández P. Pesquisaje de anticuerpos contra el virus HTVL-I en hemopatías malignas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1990;6(1):101-6.
7. Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989:280-1.
8. Barun KD, Srinivasan A. Multiple primer pairs for the detection of HTLV-I by PCR. Nucleic Acid Res 1989; 17(5):2142.
9. Zamora T, Zaninovic V, Kajiwara M, Komoda H, Hayami M, Tajima K. Antibody to HTLV-I in indigenous inhabitants of the Andes and the Amazon regions of Colombia. Jpn J Cancer Res 1990; 81: 715-8.
10. Bouzas MC, Zapiola I, Quiruelas S, Gorvein D, Panzita A, Rey J, et al. HTLV type I and II infection among indians and natives from Argentina. AIDS Res Hum Retroviruses 1990;10(110):1567-71.
11. Khabbaz RF, Heneine W, Grindon A. Indeterminate HTLV serologic results in US blood donors: are they due to HTLV I or HTLV II? J Acquir Immune Defic Syndr 1992;5:400-4.
12. Kwok S, Gallo D, Hanson C, McKinney N, Poiesz B, Sninky JJ. High prevalence of HTLV-II among intravenous drugsabusers: PCR confirmation and typing. AIDS Res Hum Retroviruses 1990;6(4):561-5.
13. Khabbaz RF, Heneine W, Kaplan J. Testing for other human retroviruses: HTLV-I and HTVL-II in AIDS testing. 2 ed. New York: Springer-Verlag, 1994:206-24.
14. Román GC. The neuroepidemiology of tropical spastic paraparesis. Ann Neurol 1988;23(Suppl):S113-S120.
15. D' Auriol L, Vernant JC, Ouka M, Nerienet E, Buisson G, Neisson-Vernant C, et al. Diagnostic of HTLV-I infected seronegative neurological patients by PCR in Martinique. Nouv Rev Fr Hematol 1990;32(1):113-6.
16. Blattner WA, Saxinger C, Gardiner C, Riedel D. A study of HTLV-I and its factors in Trinidad and Tobago. J Acquir Inmune Defi Syndr 1990;90:1102-8.

Recibido: 6 de junio de 1996. Aprobado: 1 de diciembre de 1996.

Dr.Felipe Rolo Gómez. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil. Carretera de Tapaste y Ocho Vías, San José de Las Lajas, provincia de La Habana, Cuba.