ARTÍCULO ORIGINAL

 

Actividad insecticida de aceite de trementina modificado en Culex quinquefasciatus y Aedes albopictus (Diptera:Culicidae)

 

Insecticidal activity of modified turpentine oil in Culex quinquefasciatus and Aedes albopictus (Diptera: Culicidae)

 

 

Maureen Leyva Silva,^I Leidys French Pacheco,^II Maria del Carmen Marquetti Fernandez,^I Domingo Montada Dorta,^I David Santos Hernández,^III Ariel Hernandez Mejias,^I Juan Enrique Tacoronte Morales^IV

^I Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK). La Habana, Cuba.
^II Centro de Investigaciones Químicas (CIQ), Universidad Autónoma del Estado de Morelos. México.
^III Instituto Politécnico Mártires de Girón (IPQ). Playa,La Habana, Cuba.
^IV Proyecto Prometeo, SENESCYT, Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ingeniería Química. Quito, República del Ecuador.

 

 

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RESUMEN

Introducción: el estudio de alternativas naturales para el control vectorial es de gran importancia debido a los fenómenos de resistencia a insecticidas sintéticos encontrados en diversas especies de mosquitos.
Objetivo: evaluar la actividad insecticida de aceite de trementina modificado en Culex quinquefasciatus y Aedes albopictus.
Métodos: se evaluó la actividad larvicida, adulticida e inhibidora del desarrollo de este aceite, según metodologías estandarizadas. Se utilizó para el estudio una cepade Cx. quinquefasciatus (Regla 2013) y una de Ae. albopictus (Fraga 2012).
Resultados: el aceite de trementina modificado mostró actividad larvicida para Cx. quinquefasciatus y Ae. albopictus lo que se evidenció por los valores bajos de concentraciones letales que causaron el 90 % de mortalidad (CL₉₀ = 0,0054 % y CL₉₀ = 0,00115 %), en orden. Al evaluar la actividad adulticida se obtuvo el 100 % de derribo a los 30 minutosde los individuos expuestos de ambas cepas a la concentración de 60 mg/mL. Al exponer larvas a sus respectivas CL₉₀ del aceite de trementina modificado, se observó en Cx. quinquefasciatus una mortalidad 2 veces mayor en la fase de larva que en la fase de pupa. Durante los primeros 5 días la mortalidad fue mayor en los estadios pupa y adulto en Ae. Albopictus.Sin embargo, los resultados difieren con Cx. quinquefasciatus en el mismo período. El sexo femenino fue prevaleciente en la mortalidad pupal. La mayor mortalidad en adultos se observó en machos, por lo que ocurrió una desproporción en los sexos de los sobrevivientes.
Conclusiones: los resultados encontrados avalan y permiten recomendar el aceite de trementina modificado como un insecticida de origen natural para el control de Ae. albopictus y Cx. quinquefasciatus.

Palabras clave: Aedes albopictus, Culex quinquefasciatus, trementina, larvicida, adulticida, inhibidor del desarrollo.

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ABSTRACT

Introduction: the study of natural alternatives for vector control is of great importance due to the phenomena of resistance to synthetic insecticides found in various species of mosquitoes.
Objective: to evaluate the insecticidal activity of modified turpentine oil in Culex quinquefasciatus and Aedes albopictus.
Methods: the larvicidal, adulticidal and development-inhibitory activity of this oil was evaluated, by standardized methodologies. The study used one strain of Culex quinquefasciatus (Regla, 2013) and another of Aedes albopictus (Fraga, 2012).
Results: modified turpentine oil showed larvicidal activity for Culex quinquefasciatus and Aedes albopictus, a fact evidenced by the low values of lethal concentrations that caused 90% of mortality (LC90=0.0054% and LC90=0.00115%, respectively). Evaluating the adulticidal activity, knockdown was obtained in 100% and 30 minutes after the individuals of both strains were exposed to the 60 mg/ml concentration. By exposing larvae to their respective modified turpentine oil CL90, Culex quinquefasciatus mortality in the larval stage was observed to be two times higher than in the pupal stage. During the first five days, mortality was higher in the pupa and adult stages in Aedes albopictus. However, these results differ from the Culex quinquefasciatus results for the same period. Female sex was prevalent regarding pupal mortality. Most adult mortality was observed in males, reason why a disproportion occurred concerning the survivors sex.
Conclusions: the results found endorse and permit recommending modified turpentine oil as a natural insecticide for controlling Aedes albopictus and Culex quinquefasciatus.

Keywords: Aedes albopictus; Culex quinquefasciatus; turpentine; larvicide; adulticide; development inhibitor.

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INTRODUCCIÓN

Se estima que cada año, al menos 500 millones de personas en el mundo sufren de alguna enfermedad tropical trasmitida por vectores, entre las que se incluyen dengue, filariasis linfática, malaria, entre otras.Estas enfermedades no sólo causan altos niveles de morbilidad y mortalidad, sino también infligen grandes pérdidas económicas en países pobres y en vías de desarrollo.¹

La aplicación de insecticidas adulticidas o larvicidas se mantiene como la estrategia más común a seguir en caso de brotes epidémicos con vista a disminuir las poblaciones de mosquitos.² La utilización de otros métodos de control, como las campañas educacionales y la implicación de la comunidad, persiguen el objetivo de promover valores y fomentar conocimientos que permitan disminuir los índices de vectores y la incidencia de las enfermedades con menos implicaciones ambientales.³ Estudios de laboratorio en Cuba, han detectado resistencia a los insecticidas que se aplican por el programa nacional cubano de control de vectores,⁴ mientras que las evaluaciones realizadas en el terreno, la mayoría de los plaguicidas presentan efectividad contra Ae. Aegypti.^5-6 Aunque un insecticida sintético ideal debe ser efectivo, seguro y poseer baja toxicidad en mamíferos.⁷ El uso prolongado de los mismos ha conllevado que algunos ya no cumplan con todas estas características, por lo que es importante la búsqueda de alternativas naturales para el control vectorial. Numerosas especies de plantas con actividad insecticida han sido evaluadas contra mosquitos debido a que en su composición se destacan metabolitos que constituyen una fuente promisoria para control de insectos.^8-11

De forma particular, los aceites esenciales de plantas y sus derivados, presentan diferentes actividades insecticidas, pues actúan por lo general como neurotóxicos o interrumpen el balance endocrinológico del insecto.¹² En estudios previos se comprobó la actividad insecticida del aceite de trementina modificado (ATM) en Ae. Aegypti;^13-15 por lo que en este trabajo el objetivo es evaluar este aceite como una alternativa natural ecosostenible en dos especies de mosquitos de importancia médica como lo son Culex quinquefascitus transmisor de filariosis linfática y algunas virosis y en Aedes albopictus, reconocido vector de dengue y chikungunya.

 

MÉTODOS

Poblaciones de mosquitos a utilizar en el estudio

• Población Fraga 2012; especie Ae. albopictus colectada en estadio larval en el Reparto Juan de Dios Fraga en La Lisa, La Habana, Cuba en el año 2012 y clasificada en el laboratorio de Taxonomía del Departamento de Control de Vectores IPK.
• Población Regla 2013; especie Cx. quinquefasciatus colectada en fase de larva y pupa en el municipio Regla, La Habana, Cuba, en el año 2013 y clasificada en el laboratorio de Taxonomía del Departamento de Control de Vectores IPK.

Las colonias se estabilizaron en el insectario del departamento de Control de Vectores de Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kouri”, Cuba, de acuerdo a la metodología del Manual de Indicaciones Técnicas Manual de Indicaciones Técnicas del Insectariopara Insectario.¹⁶ Disponible en http://blue/bvs1/monografias/manual.pdf

Caracterización del estado de susceptibilidad a insecticidas en ejemplares adultos de las poblaciones evaluadas

Se evaluaron los insecticidas lambadacialotrina 0,05 %, deltametrina 0,05 %, malatión 5 %, bendiocarb 0,1 % y cipermetrina 0,1 % mediante papeles impregnados para determinar el estado de resistencia y/o susceptibilidad a los insecticidas de la fase adulta. Los papeles impregnados fueron suministrados por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Para la realización de los bioensayos se conformaron grupos de 20 mosquitos hembras de 3 días de edad, sin alimentar y se expusieron a los papeles impregnados durante una hora, según metodología un control y cuatro réplicas (OMS 1981).¹⁷ Para la lectura de la mortalidad se utilizó el criterio OMS, 1981:

· 99-100 % de mortalidad, indica susceptibilidad.

· Mortalidad entre 80 -97 % indica pérdida de susceptibilidad o resistencia incipiente que necesita ser verificada.

· Menor de 80 % indica resistencia.

Para el cálculo de los tiempos letales que provocaron el 50 y 90 % de mortalidad respectivamente (TL₅₀ y TL₉₀) y las ecuaciones de las rectas de regresión, se expusieron grupos de 20 hembras a los mismos papeles impregnados, un control y cuatro réplicas a diferentes tiempos según metodología OMS, 1981. Se calcularon los diferentes parámetros usando Probit en SPSS versión 11 para Windows.

Bioensayos para medir actividad larvicida del ATM en larvas de Ae. albopictus y Cx. quinquefasciatus

Se utilizó la metodología estandarizada¹⁸ con algunas modificaciones para medir la susceptibilidad al ATM en ambas cepas de mosquito. Se prepararon varias concentraciones que oscilaron entre 0,0010 % y 0,0150 %, se utilizó etanol absoluto como disolvente. Se adicionaron 125 larvas de tercer estadío, tardío o cuarto temprano de cada especie en 100 mL de disolución (1 mL de solución de ATM en 99 mL de agua) por cada concentración. Se utilizó un control y cuatro réplicas. La mortalidad se determinó a las 24 h y la concentración letal 90 (CL₉₀) se calculó usando Probit en SPSS versión 11 para Windows.

Bioensayos para determinar la actividad inhibidora del desarrollo del ATM en larvas de Ae. albopictus y Cx quinquefasciatus

Larvas de tercer y cuarto estadío temprano de ambas especies fueron expuestas a sus respectivas CL₉₀ de ATM, en recipientes de cristal con capacidad para 500 mL. Para ambas especies se utilizó como control, 150 larvas colocadas en 500 mL de agua. Transcurridas 24 h de exposición, las larvas muertas se desecharon y a las sobrevivientes se les añadió harina de pescado como alimento, y se mantuvieron en el agua de exposición hasta arribar al estado de pupa. La mortalidad de larvas y pupas se registró diaria. Las pupas sobrevivientes fueron separadas por sexo en viales independientes hasta la eclosión de los adultos.

Los adultos sobrevivientes se colocaron en jaulas cúbicas de 30 cm. En el control se utilizó igual número de adultos de ambos sexos que en los sobrevivientes. Se suministró alimentación hematofágica con ratones Balb/c por 3 h, 2 veces en la semana. La ovipuesta correspondiente al primer ciclo gonadotrófico, se recogió y posterior se colocó en agua declorinada con alimento, para favorecer la eclosión. A las 24 h se contó bajo microscopio estereoscopio el total de huevos puestos (fecundidad) y la fracción de huevos eclosionados (fertilidad).

Bioensayos adulticidas con botellas impregnadas con ATM

Para evaluar la actividad adulticida de este aceite se procedió a impregnar botellas según metodología del Center for Disease Control and Prevention(CDC)¹⁹ con ATM, a dosis que variaron entre 10-60 mg/mL, se tuvo como referencia estudios de este tipo, con la cepa de Ae. Aegypti, susceptible Rockefeller, donde se obtuvo el 100 % de derribo a los 30 minutos con 50 mg/mL.

Se utilizaron botellas de cristal de 250 mL de capacidad y tapa de cristal esmerilada. Se prepararon 5 mL por cada concentración y se utilizó 1 mL de disolución por botella. Las botellas se impregnaron rotándolas en todos los sentidos, hasta la total evaporación de la acetona, utilizada como solvente. Las botellas se cubrieron con papel de aluminio y mantuvieron destapadas durante toda la noche. Al siguiente día fueron tapadas hasta su utilización. Por cada concentración evaluada se utilizó 1 control y cuatro réplicas. Se expusieron 15 hembras de tres días de edad de cada especie, sin alimentación sanguínea y se registraron las hembras derribadas cada 5 minutos durante 1 hora. Se determinó la dosis que provocó 100 % de derribo en los individuos expuestos a los 30 minutos, según metodología (CDC 2010). Con esta dosis se calcularon los Tiempos de derribo o Knock down TKN₅₀ y TKN₉₀ en ambas cepas usando Probit en SPSS versión 11 para Windows.

Análisis estadístico

Para el análisis de la normalidad de los datos se utilizó Kolmogorov-Smirnov y Shapiro Wilk. Se utilizó un ANOVA Multifactorial para el análisis de la mortalidad diaria en todos los estadios. Se aplicó la prueba “T de Student” para comparar la media de los huevos puestos y eclosionados para cada especie, se utilizó el programa estadístico Statistica 7.0.

 

RESULTADOS

Caracterización del estado de susceptibilidad a insecticidas en ejemplares adultos de las poblaciones evaluadas

En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos, al evaluar diferentes insecticidas en el estadio adulto para laspoblaciones Fraga 2012 ( Ae.albopictus) y Regla 2013 (Cx. quinquefasciatus. La población Fraga 2012 mostró pérdida de susceptibilidad ante deltametrina y lambdacialotrina, debido a que los tiempos letales calculados (TL₉₀), se incrementaron con 1h de exposición. La población Regla 2013, presentó un mayor grado de tolerancia ante los insecticidas evaluados, según sus elevados TL₉₀. Ambas cepas presentaron valores significativos en este parámetro para malation.

Bioensayos para medir actividad larvicida del ATM en larvas de Ae. albopictus y Cx. quinquefasciatus

El ATM mostró actividad larvicida en ambas poblaciones estudiadas, lo cual se evidenció por las bajas concentraciones letales y altas pendientes de las rectas de regresión. Para la población Fraga 2012 se percibe un incremento de las concentraciones letales calculadas con respecto a la población Regla 2013 (tabla 2)

Actividad inhibidora del desarrollo del ATM en larvas de Ae. albopictus y Cx quinquefasciatus

En las larvas sobrevivientes de ambas poblaciones, luego de expuestas a sus respectivas concentraciones letales (CL₉₀) del aceite del ATM, no se encontró diferencias significativas en cuanto a la mortalidad obtenida en la fase larval entre especies, aunque sí con respecto al control (F(3,253) = 47,1 p = 0,00001) (Fig. 1).

En Cx. quinquefasciatus la mortalidad obtenida en la fase de larva fue dos veces mayor con respecto a la fase de pupa al inicio del estudio. Entre el segundo y quinto día, este parámetro tuvo un comportamiento muy similar en los estadíos inmaduros de esta especie. Sin embargo, con Ae. albopictus los resultados difieren (F(42,9) = 6,25 p = 0,00001) con respecto a los obtenidos con Cx. quinquefasciatus en similar periodo, debido a que la mortalidad pupal y adulta se incrementó el doble. Solo se observó mortalidad de adultos adheridos a sus exuvias en machos de Cx. Quinquefasciatus (Fig. 2).

Durante los bioensayos, la eclosión de los adultos fue inhibida para ambas especies en más de un 90 %. El mayor número de individuos adheridos a exuvias o emergidos, correspondió al sexo masculino y en el estado de pupa la mayor mortalidad correspondió al sexo femenino, lo que repercutió en una desproporción en el sexo de los sobrevivientes. En cuanto a la media de huevos puestos (fecundidad) se encontró diferencia significativa con respecto al control para Regla 2013 (T = -3,85 p = 0,0031) y Fraga 2012 (T = -3,70 p = 0,0040), respectivamente. La media de huevos eclosionados (fertilidad), también, mostró diferencias en ambas especies con respecto al control (T = -10,15, p = 0,00001;

T = -2,49, p = 0,0031) lo que indica que el ATM afectó la fertilidad y la fecundidad de ambas especies.

Actividad adulticidas con botellas impregnadas con ATM

En la evaluación de la actividad adulticida del ATM, mediante el método de las botellas impregnadas, el 100 % de derribo de los individuos a la concentración más alta utilizada,ocurrió a los 30 minutos en Fraga 2012y a los 35 minutos en Regla 2013 (Fig. 3). Durante el proceso de derribo gradual, los individuos presentaron síntomas excitativos, equivalentes a los observados en mosquitos que son expuestos a piretroides. Para la población Fraga 2012 se obtuvo un TKN₅₀₌ 0,13h y TKN₉₀ =0,43h con la dosis de 60 mg/mL. Los valores calculados para la población Regla 2013 con la misma dosis resultaron muy similares (TKN₅₀ = 0,11 h y TKN₉₀ = 0,36 h).

DISCUSIÓN

El Programa Nacional para el Control de Ae. aegypti y Ae. albopictus iniciado en el año 1981 en Cuba, se basa en la vigilancia regular, destrucción de criaderos, utilización de insecticidas para disminuir poblaciones de mosquitos adultos y campañas educacionales, enfocados contra Ae. Aegypti.²Durante todos estos años, la aplicación de insecticidas ha favorecido el reemplazo por determinados períodos de tiempo de Ae aegypti por Cx. Quinquefasciatus, en zonas urbanas.^20,21Además, esto ha ocasionado queCx. quinquefasciatus muestre un incremento de resistencia y tolerancia fisiológica a los insecticidas que ha estado expuesto de forma subletal.^22,23

La presencia de Ae. albopictus se detectó en Cuba en 1995.²⁴ A pesar de las medidas de control empleadas, de forma progresiva se dispersó a otras regiones del país.^25-26 Esta especie posee habilidad para colonizar nuevos ambientes y muestra una alta adaptabilidad a recipientes que le sirven como sitios de cría en hábitats domésticos y peri domésticos, por lo que se le ha encontrado y compartido estos recursos con Ae. Aegypti.^25,27

El hecho que Cx. quinquefasciatus y Ae. albopictus suelen compartir de forma transotoria un mismo nicho con Ae aegypti, los ha convertido de forma indirecta en blanco de acciones de control. Debido a esto han incrementado su tolerancia o pérdida de susceptibilidad a los insecticidas. El inconveniente de no poseer cepas de referencias susceptibles a insecticidas en el laboratorio, impide la determinación de los factores de resistencia para cada insecticida evaluado. No obstante, no se encontró susceptibilidad a los insecticidas utilizados por parte de ninguna de las dos cepas evaluadas, según criterio de la OMS. Resulta de gran interés que Ae. albopictus, muestre pérdida de susceptibilidad a los insecticidas evaluados, pues constituye un indicador de alerta para las decisiones a tomar encaminadas a su control. Se conoce queAe.albopictus es vector de dengue y chikungunya ( http://temas.sld.cu/ chikungunya/2014/06/27/) y aunque en Cuba no se ha demostrado su capacidad vectorial, si se han detectado ambas virosis, lo que incrementa la necesidad de contar con métodos de control efectivos contra este vector.

En ciudades de la India donde se ha realizado poca presión de selección, se ha encontrado susceptibilidad a insecticidas en esta especie. ²⁸ De forma similar Pocquet en el 2014,²⁹ no encontró resistencia en Ae. albopictus ante los insecticidas probados pero si en Cx.quinquefasciatus, resultado muy similar al encontrado en este trabajo.

Diversas son las especies de plantas que presentan actividad insecticida contra mosquitos. Los estudios en esta temática incluyen la utilización de extractos, aceites esenciales y aislamientos, son consideradas algunas de ellas promisorias para el control vectorial por sus bajas concentraciones letales y usos complementarios.¹⁰

El ATM estudiado con anterioridad en Ae aegypti^13-15 demostró frente a Cx. quinquefasciatus y Ae.albopictus actividad larvicida. Sin embargo para Ae.albopictus se requirió de una CL₉₀ mayor, respecto a las otras especies estudiadas. Según los estudios de la ecología de Ae. albopictus, esta especie utiliza por lo general, huecos de árboles y axilas de plantas para su cría,³⁰ aunque puede utilizar otros recipientes en el ecosistema urbano. En su medio natural puede exponerse a metabolitos secundarios a muy baja concentración provenientes de plantas en descomposición y esto se puede traducir en una respuesta tolerante y adaptativa a fitotóxicos, como lo hacen otras especies de insectos o el incremento de la CL₉₀ calculada, pudiera estar relacionado con una manifestación contra el estrés oxidativo o una transformación del sitio blanco de acción de ATM. Otros estudios deberán realizarse para profundizar en los mecanismos moleculares de acción de ATM.

En ambas especies ocurrió una desproporción de sexos, la cual fue más marcada en Ae. albopictus, lo que pudiera estar relacionado con la alta CL₉₀ a la que fue expuesta esta especie con respecto a Cx quinquefasciatus. La posibilidad de que las pupas hembras permanezcan expuestas a una concentración del aceite por más tiempo que las pupas machos, pudo ocasionar la muerte de individuos machos adheridos a las exuvias y de pupas hembras sin eclosionar, se logró así la desproporción de sexos encontrada. El alargamiento del ciclo inmaduro, el altoporcentaje de inhibición de la eclosión, la afectación de la fecundidad y la fertilidad en los adultos sobrevivientes se infiere que sea al desequilibrio hormonal que provocan algunos terpenos.^31-35

Por otra parte no existen trabajos en los que se utilice el método de las botellas impregnadas para evaluar la actividad adulticida de aceites de plantas en mosquitos. La mayoría de los artículos que evalúan este tipo de actividad, han utilizado papeles impregnados con soluciones de aceites esenciales o metabolitos aislados.^36-41 No obstante, con la utilización del método de las botellas impregnadas se encontró que ATM presenta actividad adulticida frente a Ae. albopictus y Cx. quinquefasciatus. La dosis empleada fue letal para el 100 % de los individuos expuestos de ambas especies, a los 30 minutos de exposición. Este tiempo es el recomendado, para este tipo de estudio, por lo que los resultados encontrados cumplen con las normativas sugeridas por la OMS y el CDC. Los Tiempos de Knock down calculados, permitirán realizar estudios posteriores de comportamiento de estas cepas ante ATM en el tiempo.

Los resultados encontrados avalan y permiten recomendar el uso del aceite de trementina modificado (ATM) como un insecticida de origen natural para el control de Ae. albopictus y Cx. quinquefasciatus, no sin antes realizar estudios de semicampo y toxicidad.

 

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Recibido: 6 de marzo de 2015.
Aceptado: 30 de agosto de 2015.

 

 

Maureen Leyva Silva. Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK). Autopista Novia del Mediodía Km 6 ½ Apartado 601. La Lisa, La Habana, Cuba.

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