Artículos originales

Instituto de Hematología e Inmunología

Evaluación evolutiva de la función fagocítica de los polimorfonucleares

Lic. Isabel Torres Leyva, Lic. Lázaro del Valle Pérez, Dr. Vianed Marsán Suárez, Lic. Bertha Beatriz Socarrás Ferrer y Dra. Consuelo Macías Abraham

Resumen

El neutrófilo es el responsable primario de mantener las defensas normales del hospedero contra los microorganismos invasores. Con el objetivo de estudiar la función fagocítica de los neutrófilos en el día de su obtención y 24 horas después se aislaron de la sangre periférica de 30 donantes procedentes del Departamento de Medicina Transfusional sobre un gradiente de Ficoll-Telebrix 38 (d=1,077g/cm3). Se determinó la viabilidad celular con la técnica de exclusión del azul tripán que en ambos días fue superior al 95 %. El estudio del índice opsonofagocítico se realizó con la técnica normalizada en el Instituto de Hematología e Inmunología. Se determinó la fagocitosis para los tiempos t15 y t60. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular ni entre la función fagocítica al aplicar una t de Student para muestras pareadas entre los neutrófilos el día de su aislamiento y 24 horas después. Se concluye que se puede realizar la función fagocítica incluso 24 horas después de aislados los neutrófilos y guardados en condiciones especiales (RPMI 1640 al 10 % de suero fetal bovino y D glucosa 2mg/mL), lo cual permite estudiar el efecto in vitro de diferentes sustancias como extractos de plantas, de animales, e incluso de productos sintéticos sobre los neutrófilos.

Palabras clave: granulocito, neutrófilo, función fagocítica, índice opsonofagocítico.

Una característica común de la mayor parte de las formas de inflamación aguda inducidas por procesos inmunológicos es la acumulación de granulocitos polimorfonucleares neutrófilos (GN) en el sitio de la reacción donde intervienen activamente. Se ha establecido que la inflamación aguda en casi todos los organismos pluricelulares se produce como consecuencia de una serie de procesos como la adherencia al endotelio, emigración extravascular, migración dirigida hacia las partículas que van a ser ingeridas (quimiotaxis), reconocimiento y adherencia de las partículas por las membranas, englobamiento de los cuerpos extraños (fagocitosis), fusión de lisosomas con las vacuolas fagocíticas (desgranulación) con descarga de constituyentes lisosómicos en la vacuola y un estallido del metabolismo oxidativo (con generación de radicales libres derivados del oxígeno) del peróxido de hidrógeno, donde las células fagocíticas intentan defender al hospedero de los invasores extraños. El GN es el responsable primario del mantenimiento de las defensas normales del hospedero contra los microorganismos invasores.1

La prueba de función fagocítica (FF) requiere conteos de la ingestión de las partículas o microorganismos a tiempo 0, 15, 60 minutos por los GN, lo que limita el número de estudios a realizar en el día.

Con el objetivo de comparar la FF de los GN el día de su obtención y a las 24 horas, se realiza este estudio, que permitiría ampliar la muestra a estudiar y determinar el efecto de diferentes sustancias sobre la FF.

Métodos

Se extrajeron 20 mL de sangre heparinizada (15 UI/mL) de 30 donantes procedentes del Departamento de Medicina Transfusional del Instituto de Hematología e Inmunología (IHI) que no habían recibido tratamiento medicamentoso en el último mes previo al estudio.

Aislamiento de los (GN)

Se realizó mediante la técnica descrita por Weening y colaboradores, 2 que consiste básicamente en colocar la sangre diluida 1:1 en solución amortiguada de fosfatos (PBS, pH 7,2) sobre un gradiente de Ficoll-Telebrix 38 (densidad 1,077g/cm3), para obtener un concentrado de hematíes y GN que se somete a hemólisis 2 veces con una solución isotónica de NH4 Cl (4 ° C).
Los GN se resuspendieron en PBS (0,5 % de albúmina) y se ajustaron a 1x107 células /mL.

El porcentaje de GN fue siempre superior al 80 % y las células contaminantes fueron linfocitos. La viabilidad de los GN se determinó por el método de exclusión del tripán azul.3

Obtención del suero

Se extrajeron 5 mL de sangre por punción venosa, que se dejó coagular a temperatura ambiente para su posterior centrifugación y obtención del suero.

Preparación de la Candida albicans

Se empleó una cepa cultivada en medio de agar Saboureaud que fue lavada 2 veces y resuspendida en PBS, se contaron en cámara de Neubauer y se ajustaron a 1x107 candidas/mL.

Mantenimiento de los GN por 24 horas

La suspensión de GN fue mantenida en tubos plásticos sin agitación en RPMI 1640 suplementado al 10 % con suero fetal bovino (Gibco RU) y 2 mg/mL de D glucosa (Sigma, EE.UU.) a 4 ° C durante 24 horas, determinando la viabilidad de las células.

Medición de la fagocitosis

La fagocitosis fue estudiada mediante una modificación del método Leijhi y colaboradores. 4 Los GN ya aislados y ajustados se enfrentaron a las Candidas albicans previamente opsonizadas con el suero con una proporción de 0,5mL GN +0,5mL de Candidas albicans +0,5mL de suero para el conteo de Candidas extracelulares no fagocitadas en los tiempos 0', 15' y 60'. Las muestras fueron adicionadas a 0,3mL de solución Turk's y contadas en Cámara de Neubauer y al microscopio óptico. Los resultados se expresan en porcentaje de Candidas albicans extracelulares (no fagocitadas) para cada período de incubación, considerando el t' 0 como el valor equivalente al 100 % de Candida albicans no fagocitadas.

Bioética

A los donantes se les explicó el objetivo del estudio, los posibles beneficios derivados de los resultados y la ausencia de riesgos asociados. Se confeccionó una planilla para el consentimiento informado de los donantes que participaron en dicho estudio.

Tratamiento estadístico

Se utilizó el estadígrafo t de Student para muestras pareadas con el objetivo de estudiar posibles diferencias entre los tiempos (15' y 60') en la fagocitosis el día de su obtención y 24 horas después, para una p£0,05.

Resultados

En la figura se representa el porcentaje de la media de la fagocitosis de GN en los tiempos 15' y 60', en el día de su obtención y 24 horas después.

FIG. Porcentaje de células no fagocitadas por los neutrófilos el día de su obtención y 24 horas después.

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas al aplicar la t de Student para muestras pareadas entre los tiempos 0', 15', y 60', en el día de su obtención y 24 horas después.

Discusión

El estudio de la función fagocítica es útil para evaluar a los pacientes con inmunodeficiencias causadas por defectos en la fagocitosis, para el monitoreo de enfermos sometidos a quimioterapia o radioterapia, entre otras. 5,6

La necesidad de estudiar el efecto in vitro de diferentes sustancias como extractos de plantas, de animales, medicamentos y otros productos sintéticos sobre los GN, nos motivó realizar un estudio comparativo de la fagocitosis el día de su obtención y a las 24 horas basándonos en un estudio previo. 7

Los GN frescos sin la presencia de la glucosa se pueden conservar para estudios funcionales por períodos de incubación cortos, pero para tiempos más prolongados, se hace necesario la suplementación del medio RPMI 1640 con suero fetal bovino al 10 % y D glucosa, que nunca deben exceder de 4mg/mL porque puede resultar tóxico a los GN, aspecto comprobado en nuestros ensayos, donde se mantuvieron viables los GN por encima del 95 % a las 24, 48 y 72 horas utilizando la prueba de exclusión del azul tripán.

Se ha sugerido en otros trabajos que las condiciones óptimas para conservar los GN son: pH= 7,2, a 4 °C y sin agitación, aspectos que coinciden con nuestras condiciones experimentales y nuestros resultados. 8,9 Otros investigadores han planteado que los factores que más afectaban a los GN eran su conservación a 24 horas, pero a 37 °C. 10 No se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar las medias de las muestras pareadas, tanto para la viabilidad de los GN como para la FF.

Estos resultados nos permiten realizar estudios in vitro de diferentes sustancias sobre los GN al tiempo de su obtención y 24 horas después, tanto sobre la viabilidad celular como en su capacidad fagocítica, así como ampliar el número de casos a estudiar tanto para la investigación como en la asistencia.

Agradecimientos

A Martha Ponce Sandoval, del Departamento de Inmunología del Instituto de Hematología de Inmunología, por su apoyo en el trabajo técnico.

Summary

The neutrophil is the primary responsible for keeping normal defense levels of the host against invasive microorganisms. With the objective of studying the phagocytic function of neutrophils at the same day of their obtaining and 24 hours later, they were isolated from the peripheral blood of 30 donors from the transfusional medicine department using a Ficox-Telebrix 38 (d=1,077 g/cm3 . Cell viability was determined with tripan blue exclusion technique, which was over 95 % in both days. The standardized technique of the Institute of Hematology and Immunology allowed studying opsophagocytic index. Phagocytosis was detected for times T15 and T60. When applying Student t test to paired samples, no statistically significant difference was observed either in cell viability or in the phagocytic function between neutrophils at the day of isolation and 24 hours after. It was concluded that phagocytic function is present even 24 hours after the neutrophils being isolated and preserved under special conditions (RPMI 1640 10 % fetal bovine serum plus D glucose 2mg/ml). This allows studying in vitro effect of different substances such as plant extracts, animal extracts and even synthetic products on neutrophils.

Key words: granulocyte, neutrophil, phagocytic function, opsonophagocytic index.

Referencias bibliográficas

1. Goodman JW. La respuesta inmunitaria. En: Stites DP, Terr AI, Parslow TG, eds: Inmunología Básica y Clínica. 8 ed. México: El Manual Moderno; 1996. p. 28-9.
   
2. Weening RS, Rous D, Loos RA. Origen consumption of phagocytic cells in human leukocyte and granulocyte preparation: a comparative study. J Lab Clin Med 1974;83:570-6.
   
3. Basic Laboratory Techniques in cell culture. US Department of Health and Human Services. Atlanta 1981.p. 45-6.
   
4. Leijh PC, Van der B, Van Furth R. Kinetic of phagocytosis and intracellular killing od Candida albicans by human granulocytes and monocytes. Infect Immunol 1977;17:316-7.
   
5. Egger G, Kukovetz EM, Hayn M, Fabjan JS. Changes in the polymorphonuclear leukocyte function of blood samples induced by storage time, temperature and agitation. J Immunol Meth 1997;206:61-72.
   
6. Mackay IR, Rosen FS. Immunodeficiency diseases caused by defects in phagocytes. N Engl J Med 2000;343:1703-14.
   
7. Glasser L. Liquid storage of granulocytes. Prog Clin Bio Res 1982; 88:31-4.
   
8. Hammer MC, Baltch AL, Conroy JV, Smith RP. Effects of storage and incubation conditions on human granulocyticic phagocytic, bactericidad and chemotactic functions. Cryobiology 1986; 23:525-30.
   
9. Hodge GL, Flower R, Han P. Optimal storage conditions for preserving granulocyte viability as monitored by Annexin V binding in whole bood. J Immunol Meth 1999; 225:27-38.

Recibido: 30 de mayo del 2004. Aprobado: 12 de julio del 2004.
Lic. Isabel Torres Leyva. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 578695, 544214. Fax (537) 442334. e-mail: [e-mail]