Artículos originales

Facultad de Biología, Universidad de La Habana 
Dipartimento di Biologia, Universitá degli Studi “Roma Tre” de  Roma
Istituto di Biologia e Patologia Molecolare, CRN de Roma

Extracto de frutos enteros de Punica granatum L.  como agente protector del daño inducido por el peróxido de hidrógeno

Dr. Ángel Sánchez Lamar,¹ Dra. Renata Cozzi,²  Dr. Enrico Cundari,³ Dr. Mario Fiore,³ Dr. Ruggeno Ricordy,⁴ Dr. Giuseppe Gensabella,³ Dra. Francesca Degrassi³  y  Dra. Rosella De Salvia³

Resumen

Punica granatum L. (Punicaceae) es una planta medicinal cuyo fruto posee propiedades terapéuticas. El extracto obtenido a partir de frutos enteros se encuentra en fase de estudios preclínicos con el propósito de ser utilizado para el tratamiento de enfermedades virales. En los últimos años, algunas investigaciones experimentales han sido dirigidas al estudio de las propiedades antigenotóxicas de este extracto como una valiosa propiedad adicional. Algunos fitocomponentes del fruto de la granada muestran una actividad antioxidante potente y existen resultados experimentales que demuestran su capacidad como agentes antimutagénicos naturales. El presente trabajo expone los resultados obtenidos al valorar, en  este extracto de granada, su capacidad de disminuir el daño inducido por el peróxido de hidrógeno en células de ovario de Hamster chino cultivadas in vitro. Se realizaron experimentos de carácter citogenético como es el intercambio de cromátidas hermanas y citofluorimétrico: la fluorimetría de la diclofluoreceína oxidada. En las condiciones experimentales de esta investigación, el extracto de frutos enteros de granada fue capaz de secuestrar especies reactivas del oxígeno producidas por el peróxido de hidrógeno, mecanismo mediante el cual ejerce su acción protectora del ADN frente a las lesiones causadas por este agente.

Palabras clave: Punica granatum L., células de ovario de Hamster chino, antigenotoxicidad, antimutagenicidad, peróxido de hidrógeno, intercambio de cromátidas hermanas.

Los antioxidantes naturales son estudiados ampliamente por su capacidad de proteger al organismos y  a las células del daño inducido por las especies reactivas del oxígeno (ERO). El estrés oxidativo es considerado causa de enfermedades degenerativas, el envejecimiento, y el cáncer. En la actualidad se presta una especial atención a la posibilidad de modular los efectos perjudiciales del estrés oxidativo mediante el uso de compuestos naturales capaces de minimizar el daño celular y, en particular, el daño al ADN. En consecuencia, frecuentemente se realizan análisis experimentales con la finalidad de identificar productos naturales capaces de modular favorablemente los procesos mutagénicos y/o carcinogénicos.¹

Punica granatum L., popularmente conocida como granada, es una planta con múltiples propiedades terapéuticas de arraigado uso en la medicina tradicional de Cuba y de otros países.^2-9 Esta especie vegetal posee actividad anti-viral.¹⁰ En particular, el extracto de frutos enteros de granada ha exhibido una alta actividad contra el virus de la influenza y, en estos momentos, está siendo sometido a estudios preclínicos para recomendar su uso en el tratamiento de esta enfermad.^11-13 En la literatura se ha descrito que las dosis de este extracto, eficaces como agente anti-influenza, no son tóxicas.¹⁴

Recientemente, algunos autores han aportado resultados experimentales acerca de las propiedades antimutagénica y anticarcinogénica del fruto de la granada y, adicionalmente, se plantea que algunos de sus fitocomponentes se comportan como potentes antioxidantes.^7,15-20

En virtud de los elementos anteriores, el presente trabajo ha sido diseñado con el objetivo de investigar la efectividad del extracto de frutos enteros de granada como modulador del daño inducido al ADN por un agente oxidante como el H₂O₂ y encontrar una base racional que fundamente la propuesta de este extracto para su posible empleo en la prevención y terapia de enfermedades asociadas con el daño genético.

Métodos 

▪ Extracto de frutos enteros de granada (EFG) 

Frutos frescos de P. granatum fueron colectados de plantas salvajes, en la provincia La Habana, en julio de 2001 y su identificación fue confirmada por el Dr. Álvarez (40619 HAJB). El espécimen tipo de esta colecta se depositó en el Jardín Botánico Nacional, La Habana, Cuba. Los frutos (incluyendo la cáscara) se maceraron durante 15 días en solución de etanol al 50 % (v/v), a una proporción de 1:3 (w/v). El extracto fue filtrado y se removió el etanol por evaporación al vacío, con un evaporador rotatorio a 55º C. El extracto así obtenido se liofilizó y guardó a -20° C hasta el momento de su uso. 

 ▪ Ensayos en células de ovario de Hamster chino (CHO) 

Se realizaron experimentos de carácter citogenético y citofluorimétrico en células CHO cultivadas in vitro. Las células CHO crecieron en medio de cultivo Ham-F10 complementado con suero fetal de ternera (10 %), penicilina (5 000 IU/mL), estreptomicina (5 000 IU/mL) y L-glutamina (0,5 %), en una atmósfera de CO₂ (5 %) a 37° C. Para todos los experimentos, se sembraron células a una densidad inicial de 1 x 10⁶ en frascos de 5 mL, 24 h antes del inicio de los experimentos.  

▪ Ensayo de Intercambio de Cromátidas Hermanas (SCE) 

Los cultivos fueron tratados con concentraciones apropiadas (10 y 50 mg/mL) del extracto de frutos enteros de granada o con H₂O₂  6 x 10^-5 M, durante 30 min; adicionalmente, se realizaron tratamientos combinados consistentes en añadir, simultáneamente, H₂O₂ y EFG durante 30 min. Una vez finalizado el tratamiento los cultivos fueron incubados en medio completo fresco con bromodeoxiuridina (BrdUrd) a una concentración final de 5 x 10^-6 M. Transcurridas 26 h en tales condiciones, las células fueron fijadas para analizar los SCE.

En todos los cultivos se agregó colchicina (5 x 10^-7 M) 2 h antes de que las células fueran fijadas. Para diferenciar las cromátidas hermana, se usó la técnica de tinción Giemsa-Hoechst, según lo indicado por De Salvia y colaboradores en 1999.²¹ Para cada punto experimental, los SCE fueron registrados en 40 metafases de segunda división mitótica (M2). El índice mitótico (IM) se determinó contando un total de 1 000 células. Los indicadores de mitosis sucesivas (M1, M2 y M3) se analizaron en un total de 100 metafases.

▪ Análisis citofluorimétrico  

Las células se sembraron durante 15 min en PBS carente de Ca ²⁺ y Mg ²⁺  y con DCFH-DA (5 mM). A continuación se extrajo el medio de cultivo y se adicionó al cultivo de células NaCl (0,9 %) que contiene EFG y H₂0₂ (cotratamiento), durante 30 min. Finalizado el tratamiento las células fueron tripsinizadas y analizadas en un citofluorímetro FACSTAR (Becton Dickinson) equipado con una lámpara argón láser de 5 watt (Coherente) (emisión de 488 nm). 

▪ Análisis estadístico 

Para el análisis de SCE, se determinaron los valores medios y el error estándar. Los tratamientos y controles fueron comparados mediante la prueba t de Student. En el análisis citofluorimétrico, la intensidad de fluorescencia se expresó en unidades arbitrarias (au) y se determinó la desviación estándar. Los valores de intensidad obtenidos en los tratamientos y controles fueron comparados con la prueba t de Student.²²

Resultados

Las concentraciones (10 y 50 mg/mL) del EFG probadas en este estudio, fueron seleccionadas a partir de que no resultaron genotóxicas para las células CHO, en experimentos precedentes a esta investigación realizados en el laboratorio del departamento de Biología Vegetal, Facultad de Biología, Universidad de La Habana.

En la tabla  se observa que en las condiciones experimentales ensayadas, el EFG, por sí solo, no indujo niveles de SCE superiores a los del control no tratado. Además, no produjo reducción del índice mitótico lo cual significa que no afectó la proliferación celular.

Como era de esperar el H₂0₂ aumentó significativamente (p< 0,001) los SCE (20,1 SCE/cell) con respecto a los niveles del control no tratado lo que concuerda con los datos que aparecen en la literatura. Se conoce bien que en los sistemas biológicos el H₂0₂ puede inducir daño al ADN por sí mismo y/o a través de las especies reactivas del oxígeno.^23,24 El daño oxidativo, en el ADN, incluye roturas de simple y doble cadenas, destrucción de bases nitrogenadas y uniones cruzadas de cadenas. Algunas de estas lesiones pueden conllevar a la formación de SCE.

El EFG usado en tratamiento combinado con H₂0₂ redujo la frecuencia de los intercambios inducidos por este agente, de manera particular, la reducción obtenida (40,3 %) con la concentración de 50 mg/mL resultó estadísticamente significativa (p< 0,001). 

Tabla. Efecto del extracto de frutos completos de P. granatum (EFG) sobre la frecuencia de intercambios SCE inducidos por el H₂O₂ en células CHO

Tratamientos	SCE / célula ± EE ^a	% R	IM %
Control	8,9   ±   0,2		109
EFG 1 mg/mL	7,0   ±   0,2		115
EFG 50 mg/mL	7,7   ±   0,1		113
H2O2 6 x 10 ^- 5 M	20,1   ±   0,3		78
H2O2 + EFG 10 mg/mL	17,6   ±   0,3	12,4	99
H2O2 + EFG 50 mg/mL	12,0   ±   0,1 ***	40,3	110

                 a: Media ± error estandar, IM: índice mitótico, %R: porcentage de reducción de SCE,
*** : p < 0,001 (prueba t de Student)

El ensayo citofluorimétrico permitió cuantificar y medir los niveles de oxidación causados por las especies radicalarias del oxígeno. En la figura, los histogramas representan el número de células (ordenada) como una función de intensidad de fluorescencia (abscisa). En las figuras 1B y 1C se muestra que el EFG, a las dosis usadas, no indujo especies oxidativas, al contrario, se observa una ligera disminución de los niveles basales de especies oxidantes endógenas generadas por el metabolismo celular. En la figura 1D, las células tratadas con H₂O₂ muestran un aumento significativo de la intensidad de la fluorescencia emitida; en los tratamientos combinados de H₂O₂ y EFG (figuras 1E y 1F) se aprecia una reducción significativa en la fluorescencia emitida, según la dosis de EFG, comparada con las células tratadas con H₂O₂ solamente. 

Fig. Distribución de la fluorescencia emitida por células tratadas con DCFH. En la abscisa, intensidad de fluorescencia; en la ordenada, número de células contadas. A: control, B: extracto de frutos completos de P. granatum (EFG) a la concentración de 10 g/mL, C: EFG a la concentración de 50 g/mL, D: H2O2 (6 x 10-5 M), F: H2O2 + EFG 10 g/mL, G: H2O2 + EFG 50 g/mL.

Discusión

En las condiciones experimentales de esta investigación se ha demostrado la habilidad del EFG para reducir los SCE inducidos por H₂O₂. Estos datos están en concordancia con la actividad antioxidante del EFG consistente en reducir las especies reactivas del oxígeno responsables del daño cromosómico. La habilidad de  atrapar las especies del oxígeno generadas por el H₂O₂ dentro de las células, se demostró con la prueba citofluorimétrica (ensayo con DCFH) donde, la disminución de la intensidad de fluorescencia emitida por las células sometidas a tratamientos combinados fue drástica.   

Este ensayo fue descrito primeramente como un ensayo fluorimétrico del H₂O₂  y posteriormente se usó en varios estudios acerca del efecto de las especies reactivas del oxígeno sobre células en cultivo permanente.^25-27 El fundamento del ensayo se basa en la premisa de que la DCFH-DA cruza la membrana celular y, una vez en el interior de la célula, es desacetilada por la acción de esterasas que la convierten en DCFH, compuesto no fluorescente que es más hidrofílico y no permeable a la membrana, que queda atrapado intracelularmente. En presencia de las especies reactivas del oxígeno, la DCFH es rápidamente oxidada a diclorofluoresceína (DCF) que es altamente fluorescente y puede ser cuantificada como células fluorescentes.

Actualmente se conoce que la oxidación de la DCFH es debida, particularmente, al H₂O₂ y el radical hidroxilo (OH^·).^28-30  Por consiguiente, las disminuciones observadas en los tratamientos combinados indicaron la capacidad del extracto de secuestrar este tipo de radical. Lo anterior puede considerarse  como una de las vías de acción antioxidante de este producto natural. 

El EFG es una mezcla compleja que contiene componentes fitoquímicos como: carbohidratos reductores, mucílagos, glucósidos, fenoles/taninos, flavonoides, antocianidinas y alcaloides.¹⁴ Adicionalmente, en la literatura internacional se plantea la presencia de coumarinas y esteroides en diferentes partes del fruto de granada.^31,32 Estas clases fitoquímicas incluyen sustancias, como los fenoles, que son capaces de actuar como agentes secuestradores o quelantes de moléculas oxidantes.²¹ Particularmente el ácido elágico, lactona fenólica presente en la cáscara del fruto de granada tiene una fuerte actividad antioxidante, con demostrada acción secuestradora de radicales libres.^33,34

Cozzi y otros en 1995, al evaluar la capacidad antioxidante del ácido elágico, mediante los mismos ensayos utilizados en este trabajo (SCE y citofluorimetría con DCFH), obtuvieron resultados similares a los observados en este estudio. Tal vez, el ácido elágico contenido en el fruto de granada, por sí mismo o en interacción sinérgica con otros componentes, sea responsable de la capacidad mostrada por el EFG de reducir el daño inducido por el H₂O₂ en el ADN de las células CHO. En tal sentido estudios complementarios futuros permitirán esclarecer a cual o cuales de los componentes del EFG se debe la propiedad que posee de proteger al ADN.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer al Dr. Alberto Álvarez por ayudarnos en la recolección del material vegetal. Este trabajo fue apoyado por el convenio bilateral entre la Facultad de la Biología de Universidad de La Habana y el Instituto de Patología y Biología Molecular del CNR de Italia (Roma). Agradecemos también la contribución financiera del Ministerio Italiano de Asuntos Exteriores.

Summary

Punica granatum L. whole fruit extract as a protection against the hydrogen peroxide-induced damage

Punica granatum L. (Punicaceae) is a medicinal plant whose fruit has therapeutical properties. The whole fruit extract is under preclinical study, with the objective of being used for viral disease treatment. In the last few years, some experimental research has been aimed at studying the antigenotoxic characteristics of this extract as an additional valuable property. Some phytocomponents of Punica granatum L. fruit show powerful antioxidative activity and certain experimental results prove their capacity as natural antimutagenic agents. The present paper set forth the results achieved in evaluating the capacity of this extract to reduce hydrogen peroxide-induced damage in in vitro cultured ovarian cells from Chinese Hamster. Cytogenetic experiments such as the exchange of sister chromatids and the cytofluometric test, i.e, oxidized diclofluorescein fluorimetry were performed. Under the experimental conditions of this research work, the Punica granatum whole fruit extract could sequestrate reactive oxygen species caused by hydrogen peroxide, a mechanism that allows it to protect the DNA against the lesions provoked by this agent.

Key words: Punica granatum L., Chinese Hamster ovarian cells, anti-genotoxicity, anti-mutagenicity, hydrogen peroxide, exchange of sister chromatides.

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Recibido: 20 de octubre de 2004.  Aprobado: 22 de julio de 2005.
Dr. Ángel Sánchez Lamar.  Universidad de La Habana, Fac. de Biología, Dpto. Biología Vegetal. Calle 25 No. 455, e/ J e I, Vedado, Plaza de La Revolución. La Habana, Cuba. Teléfono: +53-7-83 Fax: [phone] e-mail: [e-mail]

1Dr. en Ciencias Biológicas. Máster en Genética Vegetal. Profesor Auxiliar.
²Dra. en Ciencias Biológicas. Profesora Titular.
³Dr. en Ciencias Biológicas. Investigador.
⁴Dr. en Ciencias Biológicas. Investigador Jefe.

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