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Introducción
Los estudios de estabilidad permiten conocer la capacidad que tiene un medicamento para conservar a lo largo del tiempo la integridad de sus propiedades físicas, químicas y biológicas necesarias para ejercer en el organismo el efecto para el cual ha sido diseñado.1,2
Para proteger la actividad biológica y evitar la degradación se deben mantener estrictas condiciones de almacenamiento. Por ejemplo, el plasma rico en plaquetas (PRP) es la fracción del plasma derivado de la sangre periférica que en general se utiliza de forma autóloga (preparado a partir de la sangre del propio paciente) y se caracteriza por contener concentración de plaquetas (109 plaquetas y en dependencia de cómo se formule, puede o no contener leucocitos.3
Aunque la presencia agregada de todos los elementos presentes en el PRP favorece su acción, los elementos fundamentales son las proteínas de señalización celular que incluyen factores de crecimiento, interleuquinas y otras citoquinas implicadas en procesos biológicos claves para la cicatrización como son la migración y proliferación celular, así como la síntesis de matriz extracelular.4,5,6
Las concentraciones de plaquetas y por tanto de factores de crecimiento, varían según el protocolo utilizado en la preparación. Como resultado de esta variabilidad, la nomenclatura de productos PRP deberá hacer referencia a las diferentes formulaciones que pueden obtener según el método de preparación utilizado.7
En los productos biológicos los métodos de ensayo influyen en los resultados.8,9,10) En el caso de los productos de origen biológico, como es el plasma es sensible a los cambios de temperatura.
Para dichos productos, la información que avala el tiempo y las condiciones de almacenamiento debe partir de estudios de estabilidad realizados a largo plazo en tiempo y condiciones de almacenamiento reales, (estudios de estabilidad de vida de estante). También se deben considerar necesarios los estudios acelerados y de estrés pues permiten tener un mejor conocimiento de las condiciones anormales de medicamento sometido a almacenamiento. Estos estudios que aportan valiosa información sobre múltiples elementos10,11,12 deberán tener, en algunos casos, seguimiento en los estudios a largo plazo.
Los estudios de estrés pueden aportar información sobre parámetros de ensayos específicos que constituyen indicadores de la estabilidad, sobre patrones de degradación, así como del comportamiento del producto ante períodos cortos fuera de las condiciones de almacenamiento establecidas, lo que ayuda en la predicción de sus afectaciones ante fallos durante el embarque o el almacenamiento.1,11,13
El objetivo del trabajo fue evaluar la estabilidad en vida de estante y condiciones de estrés del plasma rico en plaquetas obtenido en sistema abierto.
Métodos
Obtención del plasma rico en plaquetas
Para la obtención del PRP se le realizó al paciente la toma de muestra de sangre periférica.14) Se empleó como material de trabajo torundas de algodón estéril (paquetes de tres torundas), alcohol al 76 % (según política de bioseguridad), jeringuilla estéril (20 mL, 10 mL y 5 mL), ligadura, guantes de examen, lápiz cristalográfico (para identificación de las muestras), tubos de centrífuga graduados con tapa, con el contenido de 1 mL de citrato de sodio a la 1,29 mol/L, dilución (1:10 para utilizarlo a la 0,129 mol/L).
El procesamiento de la muestra se realizó mediante la técnica abierta. Se garantizó que el producto no se contaminara microbiológicamente durante su manipulación ya que queda expuesto al ambiente de la zona de trabajo y entra en contacto con diferentes materiales que es necesario utilizar para su obtención como pipetas o tubos de recogida del producto. Para evitar una contaminación cruzada en el procesado de las muestras se siguió la premisa de una única muestra en el mismo espacio y al mismo tiempo.
Después que se depositó la sangre por las paredes del tubo de centrífuga graduada hasta la marca de 10 mL (para evitar hemólisis o formación de espuma) se procedió a la centrifugación.
La centrifugación se realizó en la centrifuga marca KUBOTA 2420. Se centrifugó a 1800 g por 10 min. Al cumplirse el tiempo se retiraron los tubos de la centrífuga con mucho cuidado para no mezclar el paquete de glóbulos con el plasma.
Se separó el plasma pobre en plaquetas (PPP) y plasma rico en plaquetas (PRP) teniendo siempre en consideración la concentración de plaquetas de cada fracción y se empleó el material necesario para el proceder.
Estudio de estabilidad
Se diseñó un estudio de estabilidad que evaluó las principales propiedades físicas, químicas y biológicas del PRP mediante un estudio de vida de estante y en condiciones de estrés térmico, con el objetivo de obtener información sobre el comportamiento de su estabilidad en el período de tiempo recomendado para su conservación, según los requerimientos del Centro para el Control Estatal de los Medicamentos (CECMED)9,11 para los estudios de estabilidad.
Se diseñó tres lotes en tres días y cuatro determinaciones por lote, para un número total de muestra n = 84.
Las pruebas para demostrar estabilidad del producto se realizaron teniendo en cuenta el estudio a largo plazo o a tiempo real, con una duración de tres días y una frecuencia de ensayo en las h 0, 4, 8, 12, 24, 48 y 72.
Diseño de los estudios de estabilidad
Para el estudio de estabilidad se tuvo en cuenta los siguientes parámetros:
Condiciones normales de almacenamiento (vida de estante): las muestras de cada lote se almacenaron a temperatura controlada entre 37 y 4 °C. Los ensayos considerados como tiempo cero fueron realizados como control de calidad para la liberación del lote durante un período de tres días.
Condiciones de estrés térmico: diferentes muestras de cada uno de los lotes en estudio conservadas a temperaturas de 37 y 4 °C fueron seleccionadas se incubaron a -20 °C y 45 °C por tres días.
Ensayos físicos y químicos pH: se utilizó un medidor de pH (pH meter modelo PHS 25, Shanghái) y soluciones de referencia de pH 4.0 y 7.0. El ensayo se consideró satisfactorio sí la muestra tuvo un pH de 6,4 a 7,4.
Características organolépticas: se realizó la evaluación sensorial de apariencia (suspensión), color (blanco opalescente) y olor (característico al plasma). Dicha evaluación se realizó a cuatro tubos durante la ejecución de la determinación de pH.
Volumen: se realizó la evaluación de la cantidad del producto en mL, dicha evaluación se realizó en tubos durante la ejecución de pH, variable cuantitativa continua, cantidad de volumen del producto desde el inicio hasta el final del estudio.
Concentración del PRP: concentraciones de tres veces el valor basal (150-450 ( 109/L) variable cuantitativa continua.
Esterilidad: se realizó siembra en medio líquido para cultivo microbiano en tioglicolato de sodio. Variable cuantitativa continua, dada en los siguientes intervalos de UFC (unidades formadoras de colonias).
Análisis estadístico
Se hizo un análisis de datos de las muestras en estudio. Se realizó el análisis de varianza (ANOVA) en bloques al azar para comparar los parámetros cuantitativos entre los lotes en estudio. Para el análisis se utilizaron los factores lote y tiempo. Los análisis se realizaron en SPSS v 21.0 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.).
Resultados
El comportamiento de los parámetros físicos y químicos correspondientes a cada uno de los lotes a lo largo del estudio de estabilidad de vida de estante, en condiciones de estrés se mantuvo dentro de los límites de aceptación en correspondencia con el pH. Se mostró la variación del pH según el tiempo y las diferentes temperaturas en el estudio acelerado. No existió diferencias en la media del pH para las diferentes temperaturas y horarios y este osciló en el mayor número de las observaciones entre 7,3 y 7,4 correspondiéndose con el rango establecido como normal, solo a 37 °C después de las 24 h se constató un ligero incremento del pH a 7,5 (tabla 1).
Tabla 1 Variación del pH según tiempo y temperaturas
| Horas | pH en tiempo real o acelerado | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| pH 37 °C | pH 4 °C | pH 20 °C | ||||
| Media | DE | Media | DE | Media | DE | |
| 0 | 7,3 | 0,06 | 7,2 | 0,21 | 7,3 | 0,08 |
| 4 | 7,4 | 0,06 | 7,3 | 0,13 | 7,3 | 0,07 |
| 8 | 7,4 | 0,04 | 7,4 | 0,03 | 7,3 | 0,16 |
| 12 | 7,4 | 0,05 | 7,1 | 0,2 | 7,4 | 0,0 |
| 24 | 7,5 | 0,09 | 7,4 | 0,045 | 7,3 | 0,029 |
| 48 | 7,5 | 0,08 | 7,3 | 0,103 | 7,3 | 0,103 |
| 72 | 7,5 | 0,09 | 7,3 | 0,057 | 73 | 0,103 |
p = 0,732.
La totalidad de las muestras estudiadas no presentó variación en relación con las características organolépticas y el volumen. La esterilidad de forma general tampoco mostró variaciones importantes. Solo se encontró contaminación a 37 °C de temperatura a partir de las 8 h en una muestra y al aislar el germen encontrado se señaló el resultado de bacilos ambientales producto de una mala manipulación. Se recomienda trabajar con temperatura igual o inferior a 4 °C.
La prueba estadística no se realizó por considerar un uso irreflexivo dado el resultado del análisis. Se demostró la estabilidad en relación con estos parámetros.
Se observó en las variaciones de las concentraciones de PRP según el tiempo y las temperaturas que a medida que aumenta el tiempo disminuye la concentración y aumenta la dispersión de los datos. Esto ocurre similar en las tres temperaturas analizadas, aunque a -20 °C se apreció menos variación de la media de concentración con menor dispersión de los datos (tabla 2).
Tabla 2 Variaciones de las concentraciones del plasma rico en plaquetas según tiempo y temperaturas
| Horas | Concentración de plasma rico en plaquetas en tiempo real o acelerado | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 37 °C | 4 °C | 20 °C | ||||
| Media | DE | Media | DE | Media | DE | |
| 0 | 809,0 | 50,8 | 775,0 | 44,0 | 735,0 | 52,2 |
| 4 | 767,0 | 53,0 | 755,0 | 31,3 | 798,0 | 60,1 |
| 8 | 653,0 | 25,0 | 796,0 | 46,9 | 761,0 | 54,6 |
| 12 | 305,2 | 33,6 | 725,5 | 23,6 | 761,8 | 59,9 |
| 24 | 309,1 | 80,2 | 710,3 | 44,7 | 762,7 | 48,8 |
| 48 | 329,9 | 81,2 | 660,8 | 56,2 | 713,7 | 42,7 |
| 72 | 255,4 | 101,1 | 665,2 | 62,1 | 708,8 | 73,8 |
p = 0,065.
No obstante, la prueba estadística arrojó una significación mayor de 0,05 lo que se traduce en que no hay suficientes evidencias para plantear que la concentración de PRP varía en función del tiempo y las temperaturas con una confiabilidad del 95 %.
Discusión
La Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios del Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social (AEMPS) en el año 2013 estableció una resolución por la que instauró la clasificación del uso terapéutico no sustitutivo del plasma autólogo y sus fracciones, componentes o derivados, como medicamentos de uso humano para atender necesidades especiales, por lo que se regula por primera vez la utilización de PRP como medicamento de uso humano.15,16
Los resultados de la validación galénica del colirio de plasma rico en factores de crecimiento (PRGF-Endoret®) muestra que el proceso de obtención del PRP es aséptico, tanto si se realiza en campana de flujo laminar como fuera de esta.16) El pH del colirio de PRGF-Endoret® almacenado a -20 °C durante tres meses y seis meses se mantuvo dentro de este rango durante el período de estudio.
Los sistemas abiertos y cerrados en el procesamiento del PRP son importantes porque dependen de la exposición de la sangre al ambiente durante todo el procedimiento en cada caso, este aspecto es crítico para definir criterios de esterilidad, especialmente si se considera el almacenamiento.
En el caso de la técnica abierta la calidad del método empleado debe ser evaluado por las autoridades competentes que tendrán que aprobar las instalaciones en las que se desarrolle la actividad,17 el procedimiento utilizado para la producción del PRP y los controles de calidad establecidos.
En la técnica cerrada se emplean kits comerciales desechables, que incorporan todo el material requerido para la producción del PRP. En este caso, la muestra en ningún momento tiene contacto con el exterior, por lo que no es necesario que las autoridades competentes emitan un certificado de las instalaciones y de los procedimientos efectuados,17 siempre y cuando se sigan las instrucciones del sistema comercial empleado.
Los resultados del ensayo de estabilidad del PRP coincide con la validación galénica del colirio de plasma rico en factores de crecimiento, siendo del 100 % en los lotes ensayados. La prueba estadística muestra una probabilidad asociada al estadígrafo mayor de 0,05 lo que permite plantear, con un 95 % de confiabilidad, que no existen suficientes evidencias que demuestren variación en estos parámetros o sea el pH se mantiene estable independientemente del tiempo y la temperatura.
Con respecto a las garantías de calidad, al igual que ocurre con cualquier otro medicamento16) es necesario establecer unas garantías mínimas durante el proceso de elaboración.
En cuanto a la estabilidad, el informe de la AEMPS y la Guía Española de Buenas Prácticas para la Preparación de Medicamentos en los Servicios de Farmacia Hospitalaria establecen que se debe conocer la estabilidad de un fármaco para que se puedan cumplir las garantías de calidad.18) También se debe tener en cuenta la estabilidad microbiológica.
Los resultados del estudio de Hauschild G y otros,19 en la investigación de estabilidad de almacenamiento a corto plazo a temperatura ambiente de dos preparaciones diferentes de plasma rico en plaquetas de donantes equinos y posible impacto en las concentraciones de factor de crecimiento, son aplicables durante un período de al menos seis horas a temperatura ambiente sin pérdida de concentración del PRP, lo que coincide con el estudio en el que la esterilidad y concentración del PRP de forma general no varía a 37 °C de temperatura antes las 8 h de almacenamiento.
En la investigación del colirio de PRGF - Endoret® mostró estabilidad biológica durante al menos seis meses congelado a -20 °C y mantenido, posteriormente, durante 72 h refrigerado o a temperatura ambiente15,18,20 coincidiendo con el estudio en que no se observa diferencias significativas en el PRP en función del tiempo y las temperaturas con una confiabilidad del 95 %.
Se concluye que el presente trabajo demostró que el proceso de elaboración del PRR se lleva a cabo de forma controlada y segura. El PRP obtenido mantiene sus propiedades físicas, químicas y biológicas tras someterlo a diferentes tiempos y temperaturas de almacenamiento. Por lo que se considera que estos resultados aportan la información requerida sobre la estabilidad de PRP.
