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INTRODUCCIÓN
El país tiene la necesidad de incrementar la producción nacional de sorbitol para ser utilizado en la formulación de pasta dental. La materia prima fundamental para esta producción es la glucosa.
En Cuba existen dos industrias que producen glucosa a partir de azúcar refino, utilizando la inversión ácida de la sacarosa (UEB “Chiquitico Fabregat” de la provincia de Villa Clara y la UEB “Argentina” de la provincia de Camagüey).
En la UEB “Chiquitico Fabregat” la hidrólisis ácida se lleva a cabo en un tanque cilíndrico horizontal de 28 m3 de volumen, con temperatura entre 87-90 oC. Se le adicionan 22,5 t de azúcar refino por cada hidrólisis para lograr una disolución entre 77-78 obrix. Para obtener el sirope invertido en 4h, se añaden 600 mL de ácido fosfórico al 85% por cada tonelada de refino disuelta.
Según estudios realizados por Brizuela (2015), Hernández (2016), Paret (2019), Ruíz (2018) y (Cortés y col., 2020) la inversión de la sacarosa en medio ácido presenta un elevado consumo de materia prima, baja conversión de sacarosa, formación de productos coloreados con presencia de cenizas y subproductos no deseados como los derivados cíclicos de los monosacáridos que se producen a pH bajo y elevada temperatura (León y col., 2019).
La hidrólisis ácida de la sacarosa se considera un proceso más económico en comparación con la enzimática, debido al alto costo de producción de la enzima invertasa. Sin embargo, obtener glucosa por vía enzimática garantiza productos con bajo contenido de cenizas, elimina el mal sabor el producto final (Santana y col., 2005) además de minimizar la formación de productos colaterales, el deterioro ambiental y del equipamiento (León y col., 2019).
Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo tiene como objetivo encontrar la mejor combinación de niveles de temperatura de reacción, concentración de enzima y brix de la solución, que minimicen el tiempo de inversión de la sacarosa utilizando como catalizador de la hidrólisis la enzima GS115BfrA4X Pichia Pastoris, modificada genéticamente para expresar la invertasa de Thermotoga marítima, con un pH óptimo de 5,5 y temperatura óptima de 80-900C.
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Equipamiento y materias primas
Los experimentos se desarrollaron en un reactor de 1,5 L de capacidad con recirculación de agua acoplado a un agitador mecánico (IKA), un criostato (WiseCircu) y control de temperatura en el interior del reactor mediante un termómetro debidamente calibrado (Figura 1).
Se empleó la enzima invertasa, producida en la UEB Bioprocesos Cuba 10 y concentrada a 424 U/mL en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología (CIGB).
Para preparar las diferentes soluciones de sacarosa se empleó azúcar refino, procedente de la UEB 30 de noviembre, a la que se le realizó las siguientes determinaciones:
Color por vía espectrofotométrica (NC 382:2005)
Ceniza conductimétrica (NC 380:2005)
Azúcares reductores (NC 383:2005)
Humedad mediante el método gravimétrico (NC 81:2017)
Pol (NC 379:2005)
El brix de la solución se determinó mediante un refractómetro digital (XS) y se utilizó un equipo medidor de pH de marca METTLER TOLEDO. El avance de la inversión enzimática fue seguido por polarimetría, en un polarímetro de marca Anton Par, realizando mediciones cada dos horas hasta lograr la máxima inversión.
2.2 Diseño experimental
Se decidió ejecutar un diseño de Box-Behnken de superficie de respuesta, a tres niveles (escogidos de manera aleatoria ya que solo se había trabajado a 18 U/g sacarosa) para cada uno de los siguientes factores:
X 1 : Temperatura de la reacción (65 °C, 75 °C, 85 °C)
𝑋 2 : Brix de la solución (70 %, 75 %, 80 %)
𝑋 3 : Concentración de enzima (15, 19, 23 U/g sacarosa)
Variable de respuesta:
𝑌: Tiempo de inversión de la sacarosa (h)
Se empleó el software estadístico Statgraphics Centurion XVI para el procesamiento de los datos experimentales.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En la Tabla 1 se muestran las especificaciones para azucares blancos de la (NC 377:2013) y la repetibilidad y reproducibilidad de los métodos utilizados.
Tabla 1 Especificaciones para azúcares blancos
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|---|---|---|---|
| Pol | Máximo 0,066 0Z | Máximo 0,094 0Z | Mínimo 99,65 0Z |
| Humedad | Máximo 0,005 % m/m | Máximo 0,10 % m/m | Máximo 0,10% m/M |
| Reductores | 0,007 --- 0,022 % | 0,015 --- 0,029 % | Máximo 0,10 %m/m |
| Cenizas | 0,00115 % m/m | 0,00177 % m/m | Máximo 0,10 %m/m |
| Color Foto Colorimétrico | Máximo 3UI | Máximo 7UI | Máximo 300 UI |
En la Tabla 2 se muestran los promedios de los resultados obtenidos en la caracterización del azúcar refino empleado en la experimentación.
Tabla 2 Caracterización del azúcar refino
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|---|---|---|---|---|---|
| Resultados promedios | 99,82 0Z | 0,06 % | 0,03 % | 0,04 % | 290 UI |
| Repetibilidad | 0,050 0Z | 0.004 | 0,014 % | 0,00100 % m/m | 2 U |
| Reproducibilidad | 0,030 0Z | 0.072 | 0,025 % | 0,00100 % m/m | 5 U |
En la Tabla 3 se muestra la matriz experimental correspondiente al diseño Box-Behnken y los resultados del tiempo de inversión de la sacarosa, expresados en horas, para cada condición experimental evaluada.
Un análisis inicial de la Tabla 2 revela que, para las condiciones experimentales con mayor temperatura (85°C) y mayor concentración de enzima (23 U/g sacarosa) se obtiene menor tiempo de inversión.
Tabla 3 Matriz experimental del diseño Box-Behnken
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|---|---|---|---|---|
| 1 | 85 | 75 | 23 | 4,15 |
| 2 | 75 | 80 | 15 | 13,00 |
| 3 | 75 | 75 | 19 | 8,00 |
| 4 | 75 | 70 | 15 | 9,23 |
| 5 | 75 | 75 | 19 | 8,00 |
| 6 | 85 | 80 | 19 | 5,13 |
| 7 | 65 | 75 | 23 | 9,17 |
| 8 | 85 | 75 | 15 | 7,55 |
| 9 | 65 | 75 | 15 | 9,00 |
| 10 | 75 | 80 | 23 | 5,28 |
| 11 | 65 | 70 | 19 | 10,08 |
| 12 | 85 | 70 | 19 | 5,50 |
| 13 | 65 | 80 | 19 | 12,00 |
| 14 | 75 | 75 | 19 | 8,00 |
| 15 | 75 | 70 | 23 | 4,50 |
3.1 Modelo estadístico
El modelo estadístico en el que se basa el análisis del diseño de superficie de respuesta de Box-Behnken, expresa la variable respuesta Y como una función lineal de los factores experimentales, interacciones entre los factores, términos cuadráticos y el término del error (Ecuación 1).
() 1
Donde:
𝑋 1 : Temperatura de la reacción (°C)
𝑋 2 : Brix de la solución (0Brix)
𝑋 3 : Concentración de enzima (U/g sacarosa)
𝑌: Tiempo de inversión de la sacarosa (h)
β o , β 1 , β 3 : Coeficientes constantes
β 12 , β 13 , β 23 : Coeficientes de interacción lineal
β 11 , β 22 , β 33 : Coeficientes de interacción cuadráticos
𝜀: 𝐸𝑟𝑟𝑜𝑟 experimental
El error experimental ε se asume que es aleatorio y proviene de una distribución normal con media cero y desviación estándar igual a σ.
Las magnitudes de los efectos de los factores aparecen en el gráfico de Pareto (Figura 2). Se destacan dos efectos significativos con un 95 % de confianza, temperatura y concentración de enzima. También se puede identificar a la interacción entre el brix y la concentración de enzima como la de mayor magnitud.
3.2 Análisis de los efectos principales y las interacciones
La Figura 3 corresponde al gráfico de los efectos principales. En la misma se aprecia que mientras mayor es la temperatura de reacción, menor va a ser el tiempo de inversión. Un comportamiento similar se obtiene cuando se incrementa la concentración de enzima. El efecto independiente del aumento del brix no es tan marcado como los dos anteriores. Al analizar el gráfico de interacciones (Figura 4). Se observa que:
Para un nivel bajo de brix (70 %), el efecto que tiene aumentar la concentración de enzima sobre la disminución del tiempo de inversión de la sacarosa es mucho menor que si se trabaja a alto niveles de brix (80 %), Interacción (BC: Brix*Enzima).
El análisis de la interacción AC (Temp*Enzima) muestra que, independientemente del nivel de concentración de enzima, un aumento de la temperatura disminuye el tiempo de inversión.
La interacción AB (Temp*Brix) se interpreta como, a mayor temperatura se obtiene menor tiempo de inversión independientemente del brix.
3.3 Análisis de varianza
La prueba de análisis de varianza (Tabla 4) evaluó la significación de los factores con un 95 % de confianza y 5 grados de libertad para estimar el error experimental. Siendo la temperatura y concentración de enzima los factores significativos sobre el tiempo de inversión de la sacarosa.
El modelo ajustado explica alrededor del 78,4 % de la variabilidad del tiempo de inversión de la sacarosa y tiene la siguiente estructura (Ecuación 2):
() 2
Donde:
Temp: Temperatura de la reacción (°C)
Brix: Brix de la solución (0Brix)
Enz: Concentración de enzima (U/g sacarosa)
Y: Tiempo de inversión de la sacarosa (h)
Tabla 4 Análisis de varianza
| A:Temp | 33,579 | 1 | 33,579 | 7,83 | 0,0380 |
| B:Brix | 2,904 | 1 | 2,904 | 0,68 | 0,4479 |
| C:Enzima | 32,927 | 1 | 32,927 | 7,68 | 0,0393 |
| AA | 0,110 | 1 | 0,110 | 0,03 | 0,8791 |
| AB | 1,311 | 1 | 1,311 | 0,31 | 0,6040 |
| AC | 2,016 | 1 | 2,016 | 0,47 | 0,5233 |
| BB | 0,00009 | 1 | 0,00009 | 0,00 | 0,9965 |
| BC | 4,558 | 1 | 4,558 | 1,06 | 0,3497 |
| CC | 0,384 | 1 | 0,384 | 0,09 | 0,7767 |
| Error total | 21,431 | 5 | 4,286 | - | - |
| Total (corr.) | 99,256 | 14 | - | - | - |
R-cuadrada = 78,408 %
Error estándar del est. = 2,07033
Error absoluto medio = 0,965667
Estadístico Durbin-Watson = 1,2394 (P=0,0911)
Autocorrelación residual de Lag 1 = 0,204443
3.4 Condiciones óptimas de la variable respuesta
Para minimizar el tiempo de inversión de la sacarosa se calculó un mínimo local del modelo de superficie de respuesta (Ecuación 2) sujeto a las restricciones impuestas por los límites de las variables del diseño. Se utilizó un método numérico de optimización no lineal con restricciones del tipo Newton para encontrar el mínimo local.
Como resultado (Tabla 5) se obtuvo que el menor tiempo de inversión se alcanza alrededor de las 2 horas, cuando los valores de temperatura, brix y concentración de enzima se encuentren en los niveles máximos (85 °C, 80 %, 23 U/g sacarosa).
Tabla 5 Valores óptimos de la respuesta
| Temp | 65,0 | 85,0 | 84,8 |
| Brix | 70,0 | 80,0 | 80,0 |
| Enzima | 15,0 | 23,0 | 23,0 |
En el gráfico de superficie de respuesta, generado para un nivel alto de temperatura (85 °C), muestra cómo, a medida que aumenta la concentración de enzima y el brix, disminuye el tiempo de inversión de la sacarosa (Figura 5).
3.4.1 Validación de los resultados
Con el objetivo de validar el modelo obtenido, se decidió planificar una nueva etapa experimental, consistente en realizar cinco réplicas de las condiciones experimentales óptimas (Tabla 6). En esta etapa los resultados indican que la sacarosa se invierte alrededor de las 4h, sin embargo del modelo de superficie respuesta (Ecuación 2), se obtuvo como variable óptima un tiempo de inversión de 2h. Esta diferencia se debe a que además de los parámetros analizados en el diseño, existen otros que influyen en el tiempo de inversión de la sacarosa, como es el caso de la acción hidrolítica de la enzima invertasa debido a la inhibición por exceso de sustrato (Solís y col., 2010) y la caramelización del sirope causada por la elevada temperatura a la que se trabaja.
CONCLUSIONES
La temperatura y la concentración de enzima manifiestan una influencia significativa sobre la velocidad de reacción, siendo estos los factores más importantes desde el punto de vista de control del proceso.
Mientras mayor son los niveles de brix se necesita mayor cantidad de enzima para disminuir el tiempo de inversión de la sacarosa.
El modelo de superficie de respuesta resulta adecuado para determinar las condiciones óptimas del proceso ya que explica más del 78 % de la variabilidad del tiempo de inversión de la sacarosa.
Las condiciones óptimas de reacción para minimizar el tiempo de inversión de la sacarosa son: Temp=85°C, Brix=80 % y Enzima=23°U/g sacarosa.
