Artículo original

Cinamaldeído e terpineol como inibidores de biofilmes de Candida albicans e Enterococcus faecalis

Cinamaldehído y terpineol como inhibidores de biopelículas de Candida albicans y Enterococcus faecalis

Cinnamaldehyde and terpineol as inhibitors of Candida albicans and Enterococcus faecalis biofilms

0000-0003-3038-0908Maria Heloísa de Souza Borges¹  , 0000-0001-6351-1869Nadiny Cezar Rodrigues¹  , 0000-0001-5482-9592Arella Cristina Muniz Brito¹  , 0000-0001-5090-1622Isis Morais Bezerra¹  , 0000-0001-5997-6612Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida^{1  *} 

¹Universidade Federal da Paraíba, Centro de Ciências da Saúde, Campus I, Departamento de Odontologia Clínica e Social. João Pessoa, Brasil.

RESUMO

Introdução:

Os fitoconstituintes são moléculas naturais que apresentam atividade antimicrobiana satisfatória e devem ser estudados quanto ao seu uso como novas substâncias para irrigação dos canais radiculares.

Objetivo:

Avaliar o efeito inibitório dos fitoconstituintes cinamaldeído e α-terpineol frente a biofilmes monoespécie e duoespécie de microrganismos envolvidos na infecção endodôntica.

Métodos:

Trata-se de um estudo experimental na área de microbiologia aplicada, in vitro, cego quanto às análises e randomizado. Foram selecionados os fitoconstituintes cinamaldeído e α-terpineol. A atividade antimicrobiana frente Candida albicans e Enterococcus faecalis foi avaliada por meio da análise da capacidade metabólica com o uso da resazurina e análise da viabilidade celular pelo plaqueamento. O meio de cultura e a clorexidina 1% serviram de controle negativo e positivo, respectivamente.

Resultados:

Observou-se ausência de crescimento para exposição dos biofilmes nas concentrações de 10 e 5 mg/mL de ambos os fitoconstituintes. Na concentração de 2,5 mg/mL de terpineol, constatou-se crescimento somente nos biofilmes monoespécie de C. albicans e duoespécie. Já na concentração de 1mg/mL de terpineol e cinamaldeído, verificou-se crescimento para todos os biofilmes.

Conclusão:

O cinamaldeído e α-terpineol apresentaram atividade inibitória frente biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis, nas concentrações de 10 e 5 mg/mL.

Palavras-Chave: produtos biológicos; viabilidade celular; ação antimicrobiana

RESUMEN

Introducción:

Los fitoconstituyentes son moléculas naturales que presentan actividad antimicrobiana satisfactoria y deben ser estudiados en cuanto a su uso como nuevas sustancias para irrigación de los canales radiculares.

Objetivo:

Evaluar el efecto inhibitorio de fitoconstituyentes cinamaldehído y α-terpineol frente a biopelículas monoespecies y duoespecies de microorganismos involucrados en la infección endodóntica.

Métodos:

Estudio experimental en el campo de la microbiología aplicada, in vitro, ciego al análisis y aleatorizado. Se seleccionaron los fitoconstituyentes cinamaldehído y α-terpineol. La actividad antimicrobiana frente Candida albicans y Enterococcus faecalis fue evaluada por medio del análisis de la capacidad metabólica con el uso de la resazurina y análisis de la viabilidad celular por el plaqueamiento. El medio de cultivo y la clorexidina 1 % sirvieron de control negativo y positivo, respectivamente.

Resultados:

Se observó ausencia de crecimiento para exposición de las biopelículas en las concentraciones de 10 y 5 mg/mL de ambos fitoconstituyentes. En la concentración de 2,5 mg/mL de terpineol se constató crecimiento solo en los biofilmios monoespecies de C. albicans y duoespecies. En la concentración de 1 mg/mL de terpineol y cinamaldehído se verificó crecimiento para todas las biopelículas.

Conclusiones:

Cinamaldehído y α-terpineol presentaron actividad inhibitoria frente a biofilmes monoespecies y duoespecies de Candida albicans y Enterococcus faecalis, en las concentraciones de 10 y 5 mg/mL.

Palabras-clave: productos biológicos; supervivencia celular; antiinfecciosos

ABSTRACT

Introduction:

Phytoconstituents are natural molecules displaying satisfactory antimicrobial activity. Studies should be conducted about their use as new root canal irrigants.

Objective:

Evaluate the inhibitory effect of the phytoconstituents cinnamaldehyde and α-terpineol against mono- and duo-species biofilms of microorganisms involved in endodontic infection.

Methods:

An experimental applied microbiology blind randomized in vitro study was conducted. The phytoconstituents selected were cinnamaldehyde and α-terpineol. Antimicrobial activity against Candida albicans and Enterococcus faecalis was evaluated by metabolic capacity analysis with resazurin and cell viability analysis by the plaque. The culture medium and 1% chlorhexidine served as negative and positive controls, respectively.

Results:

An absence of growth was observed for exposure of the biofilms at concentrations of 10 and 5 mg/ml of both phytoconstituents. At a concentration of 2.5 mg/ml terpineol displayed growth only in the mono-species biofilms of C. albicans and duo-species biofilms. At a concentration of 1 mg/ml terpineol and cinnamaldehyde displayed growth in all biofilms.

Conclusions:

Cinnamaldehyde and α-terpineol displayed inhibitory activity against mono- and duo-species biofilms of Candida albicans and Enterococcus faecalis at concentrations of 10 and 5 mg/ml.

Key words: biological products; cell survival; anti-infectives

Introdução

Os mecanismos iniciais de formação de um biofilme envolvem a adesão e fixação de espécies microbianas, as quais formam uma comunidade inicial, sendo posteriormente substituídas por outras espécies, chegando a comunidade clímax, que é dinâmica, diversificada e cooperativa entre a microbiota e o hospedeiro.¹

Na cavidade bucal, alguns biofilmes clássicos são citados a exemplo do cariogênico, ou aquele associado a candidose oral. Este biofilme fúngico é composto primordialmente pela Candida albicans, a qual apresenta-se em equilíbrio com o hospedeiro. Fatores que promovam disbiose do meio permitem a instalação e progressão da infecção.²⁾ Geralmente, esta patologia está associada a quadros de imunossupressão.³

Um outro biofilme, presente na cavidade oral, entretanto confinado ao limite dos sistemas de canais radiculares é o endodôntico, caracterizado por ser de natureza polimicrobiana. Quando a infecção causada pela Candida albicans e Enterococcus faecalis não consegue ser debelada pelo sistema imune do hospedeiro, é necessário realizar o tratamento endodôntico para a desinfecção do sistema de canais radiculares.⁴

O Enterococcus faecalis é uma espécie bacteriana Gram-positiva, anaeróbico facultativo, geralmente associado às infecções endodônticas persistentes onde ocorreram falhas durante o tratamento endodôntico.^1,5) Além de sua capacidade de formar biofilme dentro dos túbulos dentinários, o E. faecalis é capaz de resistir à medicação intracanal, como o hidróxido de cálcio, depositado no interior dos canais radiculares, cujo um de seus objetivos é eliminar os microrganismos que sobreviveram ao preparo químico mecânico.⁶

O mecanismo de ação utilizado para resistir ao hidróxido de cálcio está relacionado com a bomba de prótons, onde os prótons são levados para a célula, acidificando o citoplasma, sendo este mecanismo fundamental para sua sobrevivência em ambientes altamente alcalinos.⁷

As infecções persistentes são a maior causa de insucesso do tratamento endodôntico. Além do E. faecalis, microrganismos como Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Veillonella parvula e Candida albicans estão associados a necessidade de retratamento.⁸ A Candida albicans é um importante microrganismo responsável pela falha do tratamento endodôntico com lesão perirradicular, principalmente periodontite apical.⁹

A associação entre C. albicans e E. faecalis tem sido descrita na literatura, devido ao sinergismo existente entre estas espécies em casos de infecções resistentes e prolongadas, inclusive em infecções endodônticas.¹⁰ Fatores de virulência, como a formação de hifas pela Candida albicans, propiciam a interação entre biofilmes de diferentes espécies, estando a capacidade de defesa do hospedeiro diretamente relacionada a resposta imune e inflamatória às bactérias e seus produtos.

Para o tratamento das infecções endodônticas, são utilizados mecanismos que permitem a completa desinfecção do sistema de canais radiculares. Além do preparo mecânico com os instrumentos manuais e rotatórios, é lançado mão das substâncias químicas auxiliares com efeito antimicrobiano, dentre elas, as mais utilizadas são o hipoclorito de sódio e o digluconato de clorexidina, em diferentes concentrações, a depender da condição do elemento dental a ser tratado.¹¹

Devido à resistência microbiana frente as substâncias químicas auxiliares e as medicações intracanais já existentes, atualmente estão sendo estudadas substâncias de origem natural com efeito antimicrobiano, que sirvam de auxílio às terapias atuais e que também possuam um menor efeito adverso ao organismo do hospedeiro.¹² Dentre essas substâncias estão os fitoconstituintes, que são moléculas bioativas puras, como o cinamaldeído e o (-terpineol.¹³

O cinamaldeído está presente na casca da canela (Cinnamomum cassia) e atua inibindo a proliferação de microrganismos. Seu mecanismo de ação ocorre por meio da desorganização da permeabilidade da membrana citoplasmática.¹⁴ Além disso, Meades et al.¹⁵ sugere que o efeito antibacteriano do cinamaldeído está na sua capacidade de interagir com a enzima bacteriana acetil-CoA carboxilase, provocando a morte do microrganismo.

O (-terpineol está presente em plantas como o eucalipto (Eucalyptus cinérea), a salvia (Salvia libanotica) e a árvore do chá (Melaleuca alternifólia). Além de atuar inibindo a proliferação dos microrganismos de forma semelhante ao cinamaldeído, este fitoconstituinte possui atividade imunomoduladora,¹³ inibindo a expressão dos mediadores químicos inflamatórios IL-1β, IL-6 e TNF-α, enquanto aumenta a expressão da citocina anti-inflamatória IL-10 em macrófagos humanos.¹⁶ Sua atividade antimicrobiana também está relacionada com o grupo funcional álcool presente em sua composição e a sua solubilidade em membranas biológicas, ocasionando lise celular.¹⁷

Assim, o estudo com substâncias naturais, que possam ser utilizadas durante o processo de sanificação do sistema de canais radiculares, substituindo as substâncias já utilizadas, com o intuito de reduzir os eventos de resistência microbiana e os efeitos adversos ao paciente, tem sido promissor. Os fitoconstituintes são biomoléculas orgânicas obtidas a partir do extrato de plantas¹³ e seu uso no presente estudo objetiva inibir a proliferação microbiana no biofilme endodôntico.

A literatura sobre o uso de fitoconstituintes em biofilme endodôntico ainda é escassa, por isso, o objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, o efeito inibitório dos fitoconstituintes cinamaldeído e (-terpineol frente biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis.

Métodos

Delineamento Geral do Estudo

Trata-se de um estudo experimental, na área de microbiologia aplicada, in vitro, cego quanto às análises e randomizado (n = 8/grupo). As fases laboratoriais foram divididas em ensaios microbiológicos que contemplaram a avaliação da viabilidade celular pelo plaqueamento e análise da capacidade respiratória pelo teste da resazurina nos biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis.

Desenvolvimento dos biofilmes monoespécies e duoespécie

Os microrganismos Enterococcus faecalis (ATCC 29212) e Candida albicans (ATCC 90028) foram reativados em Caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Kasvi^®) e RPMI 1640 (Inlab diagnóstica, Brasil), respectivamente, e incubados por 24 h a 37^oC. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 minutos e o meio descartado (Centrifugador Excelsa 205N, FANEM LTDA, Brasil). Logo após, as células foram ressuspendidas em meio RPMI 1640 e homogeneizadas para confecção do inóculo.

A densidade celular utilizada para Enterococcus faecalis e Candida albicans foi de 1x10⁸ UFC/mL e 1x10⁶ UFC/mL, respectivamente. A absorbância foi determinada em 600 nm, considerando a densidade óptica de 0,1 (LGL Scientific 0741/16, Brasil). O volume final foi ajustado em função do número de amostras semeados, considerando o volume de 100 µL a ser inserido em cada poço da placa de 96 compartimentos (KASVI^® 96 well Tissue Culture Plate). Foram semeados biofilmes monoespécie de C. albicans e E. faecalis, bem como duoespécie, considerando ambos microrganismos empregados. A placa foi incubada por 24 horas à 37ºC para adesão e proliferação do biofilme.

Exposição aos fitoconstituintes

O cinamaldeído (Sigma Aldrich, USA) e o (-terpineol (Sigma Aldrich, USA) foram preparados em meio RPMI 1640, com 0,1 % de Tween 80 (Dilecta, Brasil) para solubilização. Foram utilizadas as concentrações de 10; 5; 2,5 e 1 mg/mL, sendo já anteriormente ajustadas, devido a diluição em meio de cultura. A exposição dos biofilmes aos fitoconstituintes foi realizada adicionando-se 100 µL de cada concentração em cada compartimento da placa de 96 poços. Em seguida, as amostras foram novamente incubadas por 24 h a 37 ^oC. Utilizou-se clorexidina à 1 % e RPMI 1640 como controle positivo e negativo, respectivamente. Cada concentração foi avaliada para ambos os biofilmes.

Análise da viabilidade celular

Após 24 horas da exposição, alíquotas de 10 µl foram semeadas em ágar sabouraud dextrose (Kasvi^®) e ágar BHI (Kasvi^®), para os biofilmes monoespécie e duoespécie. Em seguida as placas foram incubadas por 24 h a 37 ^oC. A ausência de crescimento visível de Unidades Formadoras de Colônia (UFC/mL) foi considerada como inibição da viabilidade celular, sendo avaliada por dois examinadores, por meio de imagens fotográficas. A moda da frequência foi utilizada para análises dos dados.

Análise da capacidade respiratória

A atividade respiratória dos biofilmes foi determinada pelo uso da resazurina. Foram inseridos 50 µL de resazurina (Sigma-Aldrich^®) a 0,3M em cada compartimento da placa de 96 poços seguida pela incubação por 24 horas, adicionais, à 37 ºC para avaliação da capacidade respiratória. A mudança de coloração do meio de cultura para a cor rosa determinou manutenção da atividade respiratória, sendo a cor roxa equivalente à inibição do biofilme.

Resultados

Com relação a viabilidade celular observou-se que nas amostras expostas ao cinamaldeído houve ausência de crescimento visível em todas as concentrações, tanto para os biofilmes monoespécie de E. faecalis quanto para o de C. albicans, assim como também houve ausência do crescimento em todas as concentrações para o biofilme duoespécie. Para os biofilmes monoespécie e duoespécie de E. faecalis e de C. albicans, expostos ao (-terpineol, foi observado crescimento visível apenas na concentração de 1 mg/mL do referido fitoconstituinte (Quadro 1).

Quadro 1 - Análise da viabilidade celular dos biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis para o fitoconstituinte (-terpineol e cinamaldeído

+  significa com crescimento 

Para a avaliação da respiração celular por meio do teste da resazurina, para o (-terpineol foi observada atividade metabólica nas concentrações de 2,5 e 1 mg/mL para ambos biofilmes monoespécie e duoespécie de E. faecalis e de C. albicans (Fig. 1). O tratamento com cinamaldeído determinou atividade respiratória celular na concentração de 2,5 mg/mL apenas para o biofilme duoespécie de E. faecalis e de C. albicans. Na concentração de 1 mg/mL, também houve respiração celular para os biofilmes monoespécies, assim como no duoespécie (Fig. 2).

Fig. 1 Imagem representativa do teste de resazurina dos biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis para o fitoconstituinte (-terpineol. 

Fig. 2 Imagem representativa do teste de resazurina dos biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis para o fitoconstituinte cinamaldeído. 

Discussão

Devido à natureza polimicrobiana da infecção endodôntica, eventos de resistência, tanto as medicações intracanais quanto as substâncias químicas auxiliares, podem ocorrer.¹⁸ O hipoclorito de sódio é a substância de escolha padrão devido ao seu efeito antimicrobiano e sua capacidade de dissolução de matéria orgânica.^9,19 Já a clorexidina pode atuar como bactericida ou bacteriostática, dependendo da concentração utilizada. Comparada ao hipoclorito de sódio, a clorexidina possui menos efeito tóxico, porém não é solvente de tecidos.²⁰

Estas soluções irrigadoras têm sua atividade antimicrobiana diretamente proporcional à sua concentração. Entretanto, o risco de toxicidade e de reações alérgicas aumentam.²¹ Deste modo, o efeito antimicrobiano do cinamaldeído e o (-terpineol, têm ganhado importância nos estudos com Candida albicans e Enterococcus faecalis.^22,23

Como método de análise da capacidade respiratória, utilizamos a resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-óxido), que é um corante não fluorescente, de coloração arroxeada intensa. Ela é um indicador de oxirredução, a qual evidencia a presença de crescimento microbiano, através da mudança de coloração.²⁴⁾ As medidas podem ser mensuradas qualitativamente, por meio do olho nu.

O cinamaldeído foi descrito como supressor da divisão celular bacteriana, promovendo o rompimento da integridade celular ao atingir a permeabilidade da membrana citoplasmática.¹⁴ Estudos sugerem que a ação fungistática do cinamaldeído seria por meio da produção de farnesol, álcool responsável pela inibição da transformação da levedura em hifa, principal fator de virulência da Candida albicans.¹⁴⁾ No presente estudo, verificou-se que o cinamaldeído apresentou efeito inibitório frente a proliferação celular de C. albicans e E. faecalis nas concentrações de 10 e 5 mg/mL, corroborando com seu mecanismo de ação.

Segundo estudos de Ferro et al.,²⁵ o cinamaldeído nas concentrações de 62,5-2000 µg/mL, possuiu atividade antimicrobiana frente culturas de Enterococcus faecalis (ATCC 19443), assim como o S. aureus (ATCC 25923) e estes microrganismos não desenvolveram fenótipo adaptativo para resistência ao cinamaldeído in vitro. Com relação à viabilidade celular, o presente estudo corrobora com o estudo de Ferro et al.,²⁵ onde o cinamaldeído, em concentrações mais elevadas (10; 5; 2,5 e 1 mg/mL), obteve efeito inibitório frente aos biofilmes monoespécie e duoespécie de Candida albicans e Enterococcus faecalis. Já com relação à respiração celular pelo teste da resazurina, o cinamaldeído não foi tão eficaz em concentrações inferiores, 2,5 e 1 mg/mL, de modo que os biofilmes monoespécie e duoespécie de Enterococcus faecalis e Candida albicans, apresentaram atividade respiratória, mesmo após a exposição aos fitoconstituintes.

Do mesmo modo que o cinamaldeído, o α-terpineol apresentou atividade inibitória frente aos biofilmes nas concentrações de 10 e 5 mg/mL. Desta forma pode-se sugerir que esta substância atua por meio da desestabilização da membrana celular, ocorrendo um desequilíbrio osmótico, além de apresentar propriedades anti-inflamatórias. ^16,17 Além disso, foi observado que o terpinen-4-ol, um isômero do terpineol, frente patógenos orais, como o Streptococcus mutans e Lactobacillus acidophilus, foi capaz de inibir a adesão do biofilme em superfícies de esmalte e dentina.²⁶

Os resultados do presente estudo indicaram que o cinamaldeído e o α-terpineol em concentrações elevadas de 10mg/ml e 5mg/ml são potencialmente capazes de inibir o biofilme de Enterococcus faecalis e de Candida albicans in vitro. Estudos avaliando a atividade dos fitoconstituintes em biofilme endodôntico ainda são muito escassos. Com isso, considerando a atividade antimicrobiana do cinamaldeído e do α-terpineol e os resultados obtidos no presente estudo, sugere-se novos estudos de modo a avaliar os possíveis efeitos citotóxicos que os fitoconstituintes possam desencadear nos tecidos, que devem ser considerados para o seu uso na prática clínica, para que assim, possam ser utilizados como substância química auxiliar durante a sanificação do sistema de canais radiculares, substituindo o uso do hipoclorito de sódio e do digluconato de clorexidina.

Os fitoconstituintes cinamaldeído e o α-terpineol apresentaram atividade antimicrobiana frente biofilmes monoespécie e duoespécie de Enterococcus faecalis e Candida albicans nas concentrações de 10mg/mL e 5mg/mL.

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Financiación

MSHB não recebeu nenhum apoio financeiro. NCR recebeu um apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). IMB recebeu um apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). ACMB recebeu apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Em conformidade com padrões éticos.

Recebido: 20 de Agosto de 2019; Aceito: 18 de Agosto de 2020

^*Autor para correspondência: [e-mail]

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Maria Heloísa de Souza Borges: procedimentos laboratoriais, análise dos dados, escrita do artigo científico, adequação nas normas da revista, submissão do artigo.

Nadiny Cezar Rodrigues: procedimentos laboratoriais e escrita do artigo científico.

Arella Cristina Muniz Brito: procedimentos laboratoriais, escrita do artigo científico e submissão do artigo.

Isis Morais Bezerra: procedimentos laboratoriais, e escrita do artigo científico.

Leopoldina de Fátima Dantas de Almeida: procedimentos laboratoriais, análise dos dados, escrita do artigo científico, adequação nas normas da revista e submissão do artigo.