Artículo de Revisión

Centro de Química Farmacéutica

Protocolo de validación de métodos analíticos para la cuantificación de fármacos

Beatriz Castillo Aguilar¹ y Rolando González Hernández¹

1 Licenciado(a) en Química. Aspirante a Investigador(a).

RESUMEN

Se presenta un resumen de las consideraciones generales para la confección del protocolo de validación de métodos analíticos utilizados en la determinación cuantitativa de fármacos en forma de materia prima o en formulaciones y en estudios de estabilidad. Se describe detalladamente el proceso de validación que incluye los requisitos exigidos para la utilización de las materias primas, materiales de referencia, equipamiento, personal y determinación de los parámetros de linealidad, precisión, exactitud y selectividad (con el procesamiento estadístico de los resultados experimentales y criterios de aceptación), así como la presentación de los resultados en el informe final de la validación.

Palabras clave: QUIMICA FARMACEUTICA; ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS; QUIMICA ANALITICA; TECNOLOGIA FARMACEUTICA.

INTRODUCCION

Para el desarrollo químico-farmacéutico de un nuevo medicamento es imprescindible la utilización de un método analítico que permita cuantificar el producto mayoritario en forma de materia prima o como ingrediente activo de una formulación. Para asegurar confiabilidad, los métodos analíticos se someten a un proceso de validación.¹ Mediante un proceso de validación, ya sea de carácter prospectivo, retrospectivo o de revalidación, se comprueba si el método es lo suficientemente confiable y si los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas.^1,2 La validación de los métodos analíticos se fundamenta en la determinación de diversos parámetros, que se aplican de acuerdo con la categoría a la que pertenezcan.^2,3

Para el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio la validación es un requisito imprescindible que está establecido por agencias regulatorias^4,5 y por comisiones de Farmacopeas^2,6 para el registro de nuevos medicamentos. En Cuba el Centro Estatal de Normalización en coordinación con el Ministerio de Salud Pública (MINSAP) establece una norma⁷ para el aseguramiento de ciertos niveles de calidad de los productos farmacéuticos.

A partir del criterio de que no existe un modelo único para validar y que los parámetros a evaluar cambian de acuerdo con los requisitos legales de diferentes organizaciones,^4,5 el presente trabajo ofrece una guía de validación para los métodos analíticos que se utilicen en la cuantificación de fármacos como materia prima, como ingrediente activo de una formulación y en estudios de estabilidad.

CATEGORIA DEL METODO

Según la USP XXII² los métodos analíticos se clasifican en varias categorías para su validación. Los métodos que son objeto de estudio en el presente trabajo pertenecen a la categoría I y se clasifican como "métodos cuantitativos para la determinación del principio activo como materia prima o en formulaciones farmacéuticas". Los parámetros de validación que se deben considerar varían según los requisitos legales exigidos por distintas organizaciones. Según la literatura consultada,^2,5 para este tipo de métodos deben evaluarse la linealidad, la sensibilidad, la exactitud, la precisión y la selectividad.

PROCEDIMIENTO DE VALIDACION

PROTOCOLO⁸

Consiste en un plan experimental que debe contener las siguientes especificaciones:

1. Control de materias primas. Se refiere al control de las materias primas procedentes de casas comerciales reconocidas que se utilicen en el proceso de validación. Deberán aparecer de forma detallada las especificaciones de la muestra de ensayo, la preparación y estabilidad de las disoluciones, diluciones, pH y temperatura.

2. Material de referencia. Se utilizarán para la calibración del sistema de medición (por ejemplo disoluciones tampones para la calibración de potenciómetros o pHmetros) o como patrón de comparación en las determinaciones del analito. Durante la validación se utilizarán materiales de referencia secundarios o de trabajo⁹ contrastados contra un material de referencia primario. En caso de no disponer de material de referencia primario, Rampazoo³ propone la caracterización (mediante métodos especiales que aseguren la evaluación correcta de los niveles de pureza requeridos) de una parte de un lote industrial para emplearlo como patrón de trabajo en determinaciones cuantitativas. Las características del material de referencia que se utilizará en la validación aparecerán como anexo en el protocolo de validación.

3. Verificación, calibración y control del equipamiento. En las Farmacopeas^2,10,11 aparecen reportados los métodos para realizar la calibración y/o control de espectrofotómetros, pHmetros, etcétera, pero no se incluyen los métodos para equipos de tecnología avanzada (como sistemas de adquisición de datos, densitómetros, detectores cromatográficos, etcétera). En la actualidad la mayoría de los productores desarrollan la validación de los equipos analíticos para satisfacer los requisitos internacionales que permitan su utilización en el control de calidad en diferentes industrias incluyendo la industria farmacéutica y aun cuando en los manuales del usuario aparezcan especificaciones de precisión y exactitud del equipo, por lo general el usuario debe desarrollar su propio procedimiento para la comprobación del buen funcionamiento del instrumento o seguir las recomendaciones del fabricante. Cuando el equipo está verificado se realiza un simple control de rutina. DeSain⁸ recomienda un procedimiento especial para las columnas que se utilizan frecuentemente en muestras diferentes para análisis por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR).

4. Entrenamiento del personal. El personal encargado de realizar los ensayos analíticos estará entrenando específicamente en este tipo de trabajo y su entrenamiento estará rigurosamente documentado.

5. Procedimiento normalizado de operación del método. Refleja el procedimiento exacto de ejecución del método analítico y estará anexado al protocolo de validación.

VALIDACION

1. Linealidad. Es la capacidad del método analítico para obtener resultados directamente proporcionales a la concentración o cantidad del analito en un rango definido.² Se determina mediante el tratamiento matemático de los resultados obtenidos en el análisis del analito a diferentes cantidades o concentraciones. La selección del rango y del número de puntos experimentales está estrictamente relacionado con la aplicación del método.

Así, Comellas¹² recomienda en la validación de métodos por CLAR para la cuantificación de un principio activo en forma de materia prima de 80,0 hasta 120,0 % del valor teórico y de 3 a 5 puntos experimentales, mientras que para su aplicación en la determinación del analito como ingrediente activo de una formulación recomienda un ran-go desde 50,0 hasta 150,0 % y con 5 ó 7 puntos experimentales.

Rampazoo³ especifica que cuando el método se aplica para determinaciones del analito en estudios de estabilidad se utilizará un rango más amplio desde 0,0 hasta 120,0 %. El estudio de linealidad se realiza durante 3 ó 4 días.^13,14 La curva de regresión se determina sobre los puntos individuales sin promediar por el método de los mínimos cuadrados. En el eje de las "x" aparecerá la cantidad o la concentración del analito y en el eje "y", la respuesta analítica (absorbancia para métodos espectrofotométricos, área o altura para métodos cromatográficos, cantidad de agente valorante gastado en el caso de métodos titrimétricos, etcétera). Los estimadores de regresión para un nivel de significación (a ) dado (en la mayoría de trabajos químicos a = 0,05 [5 %])¹⁵ son:

a) Coeficiente de correlación (r). Muchos autores plantean^9,13,14 que para que el método se considere lineal, el coeficiente de correlación debe ser mayor que 0,999. Sin embargo, Quattrocchi et al.¹⁶ consideran que la mejor forma de indicar la linealidad del método estudiado será realizar una prueba estadística de t (t de Student), en la cual se calculará la correlación lineal significativa (t_r) a partir de la hipótesis nula de no correlación entre las magnitudes estudiadas ("x" y "y"). Para ello se empleará la ecuación siguiente:

     ?r?Ö (n - 2)   tr = ------------ (1)                  Ö (1 - r2)

donde: r es el coeficiente de correlación, r² es el coeficiente de determinación y n es el número de réplicas. El valor de t_r obtenido se compara con el valor tabulado de t para el nivel de significación utilizado y con n-2 grados de libertad (donde n corresponde al número total de determinaciones de "y").

b) Pendiente (conocida también como coeficiente de regresión). Indica la sensibilidad de calibración o del método y se expresa en unidades de respuesta sobre unidades de concentración o cantidad del analito. La sensibilidad analítica relaciona la aleatoriedad de la respuesta con la aleatoriedad debida a la variación de la concentración, es inversamente proporcional a la capacidad de detectar pequeñas diferencias en la concentración del analito, y se obtiene dividiendo la pendiente de la curva de calibración por la desviación estándar de las respuestas en cada punto o concentración. Se considera que a mayor pendiente, mayor sensibilidad y que mientras más pequeño sea el coeficiente de variación de la pendiente mayor será la linealidad (coeficientes de variación de la pendiente mayores que el 5,0 % indican falta de linealidad).

c) Intercepto. Es el estimador que se relaciona con la presencia de interferencias o errores sistemáticos. El intervalo de confianza del intercepto debe incluir al cero para cumplir con el requisito de proporcionalidad (como se exige para el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer en los métodos espectrofotométricos). Según Camacho et al.¹³ se determinará la prueba de proporcionalidad mediante una prueba t considerando como hipótesis nula que el intercepto tiene que ser cero. El valor de t se calculará mediante la siguiente ecuación:

      a   texp = -- (2)          Sa

donde: a es el valor del intercepto, S_a es la desviación estándar del intercepto y deberá ser menor que el valor tabulado de t para el nivel de significación dado y n-2 grados de libertad.

2. Precisión. Refleja la medida en que los valores de una serie repetida de ensayos analíticos que se realizan sobre una muestra homogénea son semejantes entre sí.¹ Aunque la USP XXII² expresa que la precisión es la expresión del grado de la reproducibilidad, Calpena¹ incluye dentro de este acápite la repetibilidad, la reproducibilidad y la robustez del método analítico, mientras que la Norma Británica¹⁷ incluye sólo la repetibilidad y la reproducibilidad.

a) Repetibilidad. Refleja la precisión de un método, cuando se desarrolla bajo las mismas condiciones, utilizando la misma muestra, analizada por el mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos y durante una misma sesión de trabajo en un período corto.¹

El parámetro estadístico que caracteriza a este estudio es la desviación estándar¹⁷ o preferiblemente el coeficiente de variación (desviación estándar relativa).³ Este parámetro permite evaluar la incertidumbre en la estimación de la media, es decir, el error aleatorio que se corresponde con la dispersión de los datos alrededor de la media.

Según Hoffman F.-La Roche,¹⁸ este parámetro se determina mediante uno de los siguientes métodos:

-Realizando varias determinaciones a una muestra homogénea.
- Realizando varias determinaciones a muestras de cantidades o concentraciones diferentes. Se selecciona la cantidad o concentración inferior, media y superior del rango lineal definido. En este caso se recomienda realizar una prueba g (Prueba de Cochran) de homogeneidad de varianza y si se demuestra que las varianzas son homogéneas, entonces se puede afirmar que el factor cantidad o concentración de la muestra no influye en la determinación. Este método generalmente se utiliza cuando se cuenta con poca cantidad de muestra. Cuando el número de muestras es pequeño (menor que 30), el intervalo de confianza del valor de la media (rango en el cual se incluye el valor real con la probabilidad indicada) se calcula mediante la distribución t de Student.¹⁵

Un aspecto importante será seleccionar la cantidad o concentración de muestra que se analiza. Kolthoff¹⁹ plantea que el error en el porcentaje del componente hallado no deberá ser mayor que un valor aproximado. Según la teoría de Hortwitz,²⁰ el coeficiente de variación disminuye con la disminución de la concentración en que se encuentre el analito en la muestra. Así:

CV (%) = 2 ^{(1- 0,5 log C)} (3)

donde: C es la concentración de la muestra expresada como potencia de 10 (1 ppb = 10^-9, 1 ppm = 10^-6, 1 % = =10^-2, 10 % = 10^-1, etc.). De acuerdo a las teorías de Kolthoff y Hortwitz se reportan tablas que establecen el coeficiente de variación máximo aceptable de un método analítico en función del por ciento del analito en la muestra (tabla).¹³

TABLA. Coeficientes de variación máximos (CV_máx) de aceptación en dependencia del por ciento del analito en la muestra (% A), según las teorías de Kolthoff (I) y Hortwitz (II)

% A	CVmáx (I), %	CVmáx (II), %
100	0,1-0,3	2
50	0,3	2,2
10	1	2,8
1	2-5	4
0,1	5-10	5,7
0,01-0,001	10	8-11,3
0,0001	-	16

El coeficiente de variación máximo aceptable en función de los límites de aceptación y del número de réplicas o el número necesario de repeticiones para un cierto nivel de aceptación también pueden calcularse a partir de la ecuación siguiente:¹³

         ?x - 100?Ö n   CV (%) = ------------   (4)                t.01

donde: x es límite del nivel de aceptación superior o inferior (según USP XXII² entre 98,0 y 102,0 % para materias primas y según Comellas¹² entre 95,0 y 105,0 % para formulaciones), n es el número de repeticiones y t_.01 es el valor tabulado de la t de Student para un nivel de confiabilidad menor que el 99 % e infinitos grados de libertad (t_.01 = 2,58).

Si se tiene duda acerca de la presencia de un dato erróneo, Rampazoo³ propone dos métodos para comprobarlo, uno para cuando existan 10 determinaciones y otro para menos de 10.

Para los métodos cromatográficos, Rampazoo³ recomienda estimar también la repetibilidad instrumental, la cual se calcula a partir de una serie de inyecciones de la misma muestra. Estos valores ofrecen información acerca de la resolución límite del equipo. Según el criterio de Martin-Smith y Rudd,⁹ considerando que la mayoría de las formulaciones farmacéuticas contienen entre 1 y 10^-3 de principio activo, el coeficiente de variación en el estudio de repetibilidad para los resultados obtenidos mediante un método por CLAR debe ser menor que el 1,0 %.

b) Reproducibilidad. Es la medida de la precisión de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homogénea, pero ejecutados por diferentes analistas en días diferentes¹ y se expresa con los mismos parámetros matemáticos que la repetibilidad. El coeficiente de variación en el estudio de la reproducibilidad debe ser igual o mayor que el obtenido en el estudio de repetibilidad para la misma cantidad o concentración debido a la mayor fuente de error que existe en la reproducibilidad. De un estudio de reproducibilidad interlaboratorios, Hortwitz²⁰ estableció que el coeficiente de los coeficientes de variación del estudio de repetibilidad y reproducibilidad debe tener un valor comprendido entre 1,5 y 2,3, relacionando valores mayores que 2,3 a un método muy personal y valores menores que 1,5 a una pobre repetibilidad de algún analista. DeSain, Martin-Smith y Rudd^8,9 plantean que para la mayoría de los métodos analíticos el coeficiente de variación de la reproducibilidad debe ser menor que un 2,0 %.

c) Robustez (tolerancia). Es el grado de reproducibilidad de los resultados obtenidos mediante la ejecución del método sobre una misma muestra variando algunas condiciones operacionales como, por ejemplo, diferentes laboratorios, reactivos, analistas, equipos, temperaturas de ensayo, etcétera.² Se determina como una función de las variables seleccionadas en la ejecución y los resultados se comparan con los resultados del estudio de reproducibilidad del método para obtener una medida de la tolerancia del método analítico. Según Hoffman F.-La Roche,¹⁸ el resultado más real es el que se obtiene en las pruebas interlaboratorios, sin embargo, éstos resultan muy costosos y consumen una gran cantidad de tiempo. Para la determinación de este parámetro en los métodos por CLAR, Martin-Smith y Rudd⁹ proponen cambiar la composición de la fase móvil adicionando disoluciones tampones, variar el flujo, cambiar la columna, manteniendo la temperatura y utilizando el modo isocrático.

3. Exactitud. Indica la capacidad del método analítico para obtener resultados lo más próximos posibles al valor verdadero.^1,2 A diferencia de la precisión, que refleja el error aleatorio, la exactitud refleja el error sistemático o la tendencia a él.⁷ Cuando existen interferencias en el método por falta de selectividad (desviación por exceso en los resultados), o cuando se trata de métodos analíticos muy laboriosos, con varias etapas, como extracciones, purificaciones, etcétera (desviación por defecto en los resultados), el método se considera no exacto o biasado.¹ Para asegurar una buena exactitud, según Martin-Smith y Rudd,⁹ es necesario eliminar los errores que no están sujetos a tratamiento estadístico (calibración o control incorrectos de equipos), los errores inherentes a blancos (errores constantes) y los que dependen de la cantidad del analito presente (errores proporcionales). Ellos opinan que la mejor manera de identificar estos errores será realizando una prueba interlaboratorio.

Generalmente se utilizan los datos experimentales de la linealidad correspondientes a la concentración inferior, media y superior del intervalo lineal establecido. Hoffman F.-La Roche¹⁸ presenta 2 métodos para analizar los resultados:

a) Comparar el valor medio obtenido por el método propuesto para la determinación del analito contra el valor medio obtenido por un método ya validado o el valor teórico (100 %). Para ello se realizará una prueba t de acuerdo con la siguiente ecuación:

      ?m-_?Ö n    ?100-R?Ö n   texp = --------  = ----------      (5)            S            CV

donde: t_exp es el valor experimental de t, m es el valor real, _ es el valor medio, n es el número de determinaciones, S es la desviación estándar, R es el por ciento de recobrado y CV el coeficiente de variación.

El valor de t_exp debe ser menor que el valor tabulado de t para poder afirmar que ambos valores no difieren significativamente para el nivel de significación seleccionado.

b) Analizar cantidades conocidas del analito (para materias primas) o cantidades conocidas del analito añadidas a sistemas placebo (para formulaciones) para calcular el recobrado por comparación de las cantidades teóricas con los valores determinados. Para ello se grafica la masa encontrada en el eje "x" contra la masa agregada en el "y". La ecuación de la línea de regresión y sus estimadores se determina por el método de los mínimos cuadrados. El coeficiente de correlación debe ser mayor que 0,997.⁸ Para descartar cualquier error de tendencia constante, el intervalo de confianza del intercepto debe incluir al cero y para descartar cualquier error proporcional el intervalo de confianza de la pendiente debe incluir el 1.^16,18 Según Camacho et al.¹³ si se observa un error proporcional el método es válido siempre que se utilice la curva de calibración previamente calculada.

4. Selectividad (especificidad). Se define como la capacidad de un método analítico para medir exacta y específicamente el analito sin interferencias de impurezas, productos de degradación o excipientes que pueden estar presentes en la muestra.¹ Se expresa como el grado de inexactitud del método.² La evaluación de este parámetro es especialmente importante en el caso de los métodos analíticos diseñados para la cuantificación del analito en formulaciones y en estudios de estabilidad.³

Aunque la especificidad y la selectividad se consideran términos equivalente,^1-3 algunos autores⁸ los diferencian, considerando la selectividad como la capacidad de detectar simultánea o separadamente sustancias químicas diferentes presentes en una misma muestra y a la especificidad como la capacidad de detectar el analito sin interferencias de otro compuesto. La selectividad se determina comparando los resultados del análisis de muestras con los resultados del análisis de las muestras en presencia de productos relacionados.¹ Rampazoo³ recomienda el análisis de muestras del analito sometidas a condiciones de degradación artificial hasta el 20 % de degradación, lo cual constituye un criterio de especial interés cuando se desconocen los productos de degradación.

Según Martin-Smith y Rudd⁹ los métodos cromatográficos se consideran selectivos, si se demuestra que los picos (en la CLAR y en cromatografía gaseosa) o que las manchas (en la cromatografía de capa fina), son homogéneas y corresponden a un solo compuesto, mediante una buena separación de analito y productos relacionados y utilizando técnicas de detección como UV con arreglo de diodos, espectrometría de masas, etcétera.

Los métodos espectroscópicos (UV, IR, colorimetría, etcétera) frecuentemente adolecen de selectividad.¹ Sin embargo, Murrillo et al.²² han demostrado que la utilización de la espectrofotometría UV de derivadas incrementa consideradamente la selectividad del método, permitiendo la determinación cuantitativa simultánea de varios productos que posean un máximo de absorción en la misma zona espectral.

INFORME FINAL

Incluirá las referencias de la calibración y verificación de los equipos utilizados, los resultados primarios y estadísticos de cada parámetro, la discusión de los resultados y las conclusiones de la validación.

Concluido el procedimiento de validación el personal de aseguramiento de calidad emitirá un certificado de validación, que unido al protocolo y el informe final se archivarán durante el tiempo de vida del producto.

Este protocolo ha sido verificado en la práctica y los resultados que se han obtenido aseguran una alta confiabilidad en 5 métodos analíticos propuestos para control de calidad, un estudio de estabilidad de materia prima y un ensayo de formulación.

SUMMARY

A summary of the general considerations fot the formulation of a validation protocol of the analytical methods used in drug quantitative determination in a raw material form, or in formulations and firmness studies. The validation process is fully described; it includes the necessary requirements for the usage of raw materials, reference materials, supplying, personnel, and determination of linearity, preciseness, exactness, and selectiveness (with the statistical processing of experimental results, and acceptance criteria), as well as the presentation of outcomes in the validation final report.

Key words: CHEMISTRY, PHARMACEUTICAL; DRUG STABILITY; CHEMISTRY, ANALYTICAL; TECHNOLOGY, PHARMACEUTICAL.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Calpena AC, Escribano E, Fernández C. Validación de los métodos analíticos. Farm Clin 1991;7(9):749-58.
2. United States Pharmacopeial Convention USP XXII: United States Pharmacopeia. 22ed. Easton: Mack Printing, 1990:1225,1710.
3. Rampazoo P. Standardisation and validation of analytical methods in the pharmaceutical industry. Il Farmaco 1990;45:807-15.
4. Food and drug administration. Center for Drugs and Biologics, Departament of Health and Human Service. Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Method Validation. February, 1987.
5. Analytical Validation, Volumen 3A of The Rules Governing Medicinal Products in the European Community. Washington D.C.: The Office Publications of the European Community Information Service, 1990;1-16.
6. Comisión Permanente de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos. Métodos Analíticos Validación. México: Secretaría de Salud, 1991:73.
7. Norma Cubana NC: 26-212. Evaluación de características y validación de métodos de ensayo. Buenas prácticas de laboratorio. Comité Estatal de Normalización. La Habana: Ministerio de Salud Pública, Marzo, 1992:16.
8. DeSain C. Master method validation protocols. Biopharm 1992;30-4.
9. Martin-Smith M, Rudd DR. The importance of proper validation of the analytical methods employed in the quality control of pharmaceuticals. Acta Pharm Jugosl 1990;40:7-19.
10. British Pharmacopeia Commission. British Pharmacopeia. London: Her Majesty's Stationery Office, 1988:2.
11. Farmacopeia Europea 2ed. Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo, 1991.
12. Comellas L. Desarrollo de métodos en HPLC. Barcelona: Instituto Químico de Sarria, 1994:68.
13. Camacho MA, Torres AI, Gil ME, Obregón MM, Ruz V. Validation protocol of analytical methods for finished pharmaceutical products. ATP Pharma Practique 1993;3(3):197-202.
14. Torres AI, Camacho MA. Validation of two analytical methods applied to two new cytostatic drugs. STP Pharma Practique 1992;2(2):93-9.
15. Alpízar J, Iglesias M, López R. Introducción a la elaboración matemática de los resultados experimentales. La Habana: Universidad de La Habana, 1990:56.
16. Quattrochi OA, De Andrizzi SA, Laba LF. Introducción a la HPLC: aplicación y práctica. Buenos Aires: Artes Gráficas Farro, 1992:301.
17. British Standard No. BS 5497. Precision of Test Methods. 1979; pte 1.
18. Statistical validation: Quantitative determination (General Explanations). Basle: Hoffman F. La Roche, 1987:1-9.
19. Kolthoff IM, Sandell EB. Tratado de química analítica cuantitativa. La Habana: 1966:333,339. (Edición Revolucionaria.)
20. Hortwitz W. Evaluation of analytical methods used for regulation of food and drugs. Anal Chem 1982;54(1):67A.
21. United States Pharmacopeial Convention USP XXII: United States Pharmacopoeia. 22ed. Easton: Mack Printing, 1990:466,1086,1682.
22. Murillo JA, Lemus JM, García LF. Simultaneous determination of 7-ACA and 7-ADCA by second derivative spectrophotometry. Anal Lett 1991;24(4):683-99.

Recibido: 26 de mayo de 1995. Aprobado: 13 de diciembre de 1995.

Lic. Beatriz Castillo Aguilar. Centro de Química Farmacéutica. Ave 200 y 21, Atabey, municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.