Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana

Validación de los métodos analíticos empleados en el estudio del inyectable de fosfato de disopiramida (13 mg/mL)

Gisela Gra Ríos,1 Sol Amalia Fernández Monagas,1 Mirta Castiñeira Díaz2 y María Aurora Barrios Álvarez3

Resumen

Se realizó la validación de un método espectrofotométrico para ser utilizado en el control de la calidad del inyectable fosfato de disopiramida (13 mg/mL), en la que se determinó la absorbancia a 269 nm, y se empleó como disolvente una mezcla de metanol-sulfúrico. También se realizó la validación de una técnica de cromatografía líquida de alta resolución, en la que se utilizó una columna de Lichrosorb RP-8 y como fase móvil una solución de fosfato de sodio monobásico (0,05 mol/L) pH 3:acetonitrilo (73:27 v/v). Ambos métodos resultaron ser lineales, precisos y exactos, en el rango de concentraciones estudiado. Para la técnica de cromatografía líquida de alta resolución se comprobó, además, su especificidad.

DeCS: DISOPIRAMIDA; ESPECTOFOTOMETRIA; CONTROL DE CALIDAD.

En los países desarrollados y en Cuba, las enfermedades cardiovasculares constituyen la primera causa de muerte, al ser controladas las enfermedades infecciosas. Esto hace que el obtener medicamentos que resulten cada vez más eficaces en el tratamiento de este tipo de afecciones constituya una de las tareas de la industria farmacéutica.

El fosfato de disopiramida es un medicamento utilizado en el tratamiento de la arritmia cardíaca. Se comercializa con los nombres de Dirytmin, Durbis, Norpace, Rytmodan, entre otros.

Al acometerse la producción de este medicamento en Cuba, en la forma farmacéutica de inyectable (13 mg/mL), se hizo necesario, entre otros estudios, adaptar la técnica analítica para el control de la calidad del producto terminado que aparece para otras formas farmacéuticas del mismo principio activo, en las farmacopeas consultadas. De esta adaptación surgió la necesidad de validar la técnica para el control de la calidad del inyectable, así como la empleada en el estudio de estabilidad.

Métodos

Para el desarrollo del trabajo se utilizó un lote de fosfato de disopiramida de código 70931503 de procedencia finlandesa. También se empleó el estándar de referencia USP (SR USP) de fosfato de disopiramida suministrado y avalado por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos y el lote 1001 del inyectable de concentración 13 mg/mL.

El trabajo de validación de la técnica del control de la calidad del producto terminado se realizó con un espectrofotómetro UV-VIS Philips PU-8720 fijado a una longitud de onda de 269 nm. La solución patrón con una concentración de 0,052 mg/mL se preparó en una mezcla de metanol-sulfúrico. La solución del inyectable también se preparó en metanol-sulfúrico con una concentración aproximada de 0,052 mg/mL.1

Los análisis por HPLC se realizaron en cromatógrafo líquido de alta resolución de la firma Knauer, con una columna Lichrosorb RP-8 (250 x 4 mm; 10 mm). Como fase móvil se utilizó una mezcla de una solución de fosfato de sodio monobásico (0,05 mol/L) pH 3 y acetonitrilo (73:27 v/v), siendo la velocidad de flujo de 1,8 mL/min.2 Como detector se empleó un equipo UV-VIS de longitud de onda variable fijado a una longitud de onda de trabajo de 254 nm. El volumen de inyección fue de 20 mL la concentración del patrón de 260 mg/mL. El trabajo se desarrolló de forma isocrática a una temperatura de 25 ºC.3

Para ambas técnicas se evaluaron los parámetros de linealidad, precisión y exactitud. Por HPLC también se consideró la especificidad.

La evaluación de la linealidad al utilizar la espectrofotometría UV-VIS se realizó en el rango de concentraciones comprendido entre 62,40 y 124,80 mg/mL, lo que equivale a valores del 60 al 120 %. Se efectuaron 3 réplicas para cada uno de los 5 puntos de la curva en ambos métodos.

En el estudio de la precisión, para la repetibilidad, en ambos casos, se ensayaron 6 muestras, correspondientes al 100 % de la concentración. Para el análisis de la reproducibilidad se estudiaron 3 muestras, por 2 analistas, 2 días diferentes.

Para la evaluación de la exactitud se realizó un ensayo de recuperación con concentraciones de 80, 100 y 120 %. Los ensayos se realizaron por triplicado.

En el estudio de especificidad la muestra se sometió a condiciones drásticas de pH (1,7) y temperatura (100 ºC) durante 2 semanas.

Resultados

La tabla 1 muestra los resultados obtenidos en la validación de la técnica espectrofotométrica a utilizar en el control de la calidad del medicamento.

TABLA 1. Resultados de la validación de la técnica analítica realizada por UV

	Parámetro	Resultado	Criterio
Linealidad	Coeficiente de correlación (r)	0,9968 tr = 43,16 ttab = 2,16	³ 0,99 tr > ttab
	Coeficiente de determinación (r2)	0,9936	³ 0,98
	Coeficiente de variación de los factores respuesta (CVf)	1,89 %	< 5 %
	Coeficiente de variación de la pendiente (CVb)	1,78 %	< 2 %
	Intervalo de confianza del intercepto	- 0,895 - 0,0535	Debe incluir el cero
Repetibilidad	Media	99,67 %
	Desviación estándar (DE)	0,97
	Coeficiente de variación (CV)	0,97 %	< 1,5 %
Reproducibilidad	Prueba de Fisher	Fexp = 1,25 Ftab = 5,05	Fexp < Ftab
	Prueba t de Student	texp = 0,082 ttab = 2,23	texp < ttab
	CV	0,77 %	< 3 %
Exactitud	Prueba de Cochran	Gexp = 0,4791 Gtab = 0,7997	Gexp < Gtab
	% de recuperación	100,17 %	97-103
	Prueba t de Student	texp = 0,30 ttab = 2,31	texp < ttab

Para la técnica de HPLC los resultados de la validación aparecen en la tabla 2.

TABLA 2. Resultados de la validación de la técnica analítica realizada por HPLC

	Parámetro	Resultado	Criterio
Linealidad	Coeficiente de correlación (r)	0,9996 tr = 124,42 ttab = 2,16	³ 0,99 tr > ttab
	Coeficiente de determinación (r2)	0,9992	³ 0,98
	Coeficiente de variación de los factores respuesta (CVf)	2,32 %	< 5 %
	Coeficiente de variación de la pendiente (CVb)	0,80 %	< 2 %
	Intervalo de confianza del intercepto	- 0,45 - 1,63	Debe incluir el cero
Repetibilidad	Media	99,74 %
	Desviación estándar (DE)	0,82
	Coeficiente de variación (CV)	0,82 %	< 1,5 %
Reproducibilidad	Prueba de Fisher	Fexp = 1,16 Ftab = 5,05	Fexp < Ftab
	Prueba t de Student	texp = 1,93 ttab = 2,23	texp < ttab
	CV	0,87 %	< 2%
Exactitud	Prueba de Cochran	Gexp = 0,6932 Gtab = 0,7997	Gexp < Gtab
	% de recuperación	99,515	98-102 %
	Prueba t de Student	texp = 0,57 ttab = 2,31	texp < ttab

Como puede apreciarse, en ambos casos los resultados se encuentran dentro de los límites establecidos.

El cromatograma obtenido en la determinación de la especificidad por HPLC se muestra en la figura.

FIG. (a) Cromatograma del estándar de referencia USP (SR USP) de fosfato de disopiramida. (b) Cromatograma del inyectable de fosfato de disopiramida sometido a pH ácido y 100 oC durante 2 semanas.

Discusión

Validación de la técnica espectrofotométrica UV-VIS utilizada en el control de la calidad del inyectable. Atendiendo a los datos que aparecen en la tabla 1, el método resultó lineal en el rango de concentraciones analizadas, ya que el valor de los coeficientes de correlación y determinación resultaron mayores que 0,99, además, al aplicar la prueba t de Student y obtener una texp > ttab se comprobó que existe una correlación lineal significativa entre los valores de "x" y "y".

El coeficiente de variación de la pendiente fue menor que el límite máximo de este parámetro (< 2 %).

Además, al considerar la variación de los factores respuesta, estos dieron similares entre sí y cercanos al valor de la pendiente. El resultado hallado para el coeficiente de variación de estos factores es menor que el valor máximo establecido (< 5 %), para una p = 0,05.

En el estudio de precisión, el coeficiente de variación para la repetibilidad fue de 0,97, siendo el criterio establecido para la repetibilidad de un método analítico, por determinaciones independientes a una concentración equivalente al 100 %, que dicho coeficiente debe ser menor o igual a 1,5 % (Consejo de Expertos de México. Métodos Analíticos. Validación. 1987).

Los resultados del estudio de reproducibilidad demuestran que no existe diferencia significativa entre los resultados alcanzados por los analistas, ya que al aplicar la prueba de Fisher se obtuvo una Fexp < Ftab para una probabilidad que 0,05. Al realizar la prueba t de Student, el valor calculado resultó menor que el tabulado para el 95 % de confianza, lo que demostró que no existe diferencia significativa entre las medias de los analistas.

En el análisis de los resultados del estudio de la exactitud a varias concentraciones, fueron aplicadas 2 pruebas estadísticas. En la tabla 1 aparecen representados los resultados de la prueba de Cochran (mediante el cálculo del estadístico G), donde se observa que las varianzas no difieren significativamente, por lo que se puede plantear que el parámetro concentración no afecta la exactitud del método.

Los resultados expresados como porcentaje de recuperación y de acuerdo con la prueba t de Student, con p = 0,05, indican que no existe diferencia significativa entre la recuperación media y el 100 % de recuperación.

Validación de la técnica de HPLC utilizada en el estudio de la estabilidad del inyectable. La evaluación de la especificidad de las condiciones cromatográficas seleccionadas indica que estas permiten separar el principio activo de sus productos de degradación (fig.).

Atendiendo a los resultados que aparecen en la tabla 2, el método resultó lineal en el rango de concentraciones estudiado (20-120 %), ya que el valor del coeficiente de correlación resulta mayor que 0,99, el coeficiente de determinación superior a 0,98 y al aplicar la prueba t de Student, se obtiene un valor de t experimental mayor que el tabulado, lo que indica que existe una correlación lineal significativa entre los valores de "x" y "y". Los restantes aspectos considerados en el análisis de la linealidad también cumplen con los criterios establecidos.

En el estudio de la precisión se obtuvo un coeficiente de variación para la repetibilidad del 0,82 % (tabla 2).

Los resultados del estudio de la reproducibilidad indican que no existe diferencia significativa entre las precisiones alcanzadas por los analistas, ya que al aplicar la prueba de Fisher se obtiene una F experimental menor que la F tabulada para una probabilidad de 0,05. Con la prueba t de Student se comprueba, para el 95 % de confianza, que no existe diferencia significativa entre las medias obtenidas por los analistas.

De la evaluación de la exactitud se puede concluir en primer lugar, que el factor concentración no influyó en la variabilidad de los resultados, al determinarse que la G calculada es menor que la tabulada para una probabilidad de 0,05. El valor obtenido para la recuperación cumple con el criterio establecido para los métodos cromatográficos. Al obtener una t experimental menor que la tabulada, es posible afirmar que no existe diferencia significativa (para el nivel de confianza requerido) entre el 100 % y la recuperación media, lo que confirma la buena exactitud del método.

Estos resultados, confirman la validez de los métodos analizados para ser empleados en el control de la calidad y el estudio de estabilidad del inyectable (Fernández A. Validación de métodos analíticos. II Taller de Validación, La Habana, 1996. González RH, Capote RH, Nuevas LP, Paneque AQ, Alberto NP. Protocolo de validación de técnicas analíticas. Centro de Química Farmacéutica, División de Calidad, La Habana, 1996:1-32.)

Summary

The validation of an spectrophotometric method, which will be used in the quality control of injectable disopyramide phosphate (13 mg/mL), was made in which absorbance was estimated at 269 nm and the dissolvent used was a sulfuric methanol mix. Also, the validation of a high performance liquid chromatography technique was carried out in which a Lichrosorb RP-8 column, and a solution of monobasic sodium phosphate (0,05 mol/L) ph3: acetonitrile (73:27 v/v) as mobile phase were employed. Both methods turned out to be linear, precise and accurate, within the range of concentrations already studied. Also, this paper proved the specificity of high performance liquid chromatography technique.

Subject headings: DISOPYRAMIDE; SPECTROPHOTOMETRY; QUALTY CONTROL

Referencias Bibliográficas

1. United States Pharmacopoeia. National Formulary (USP XXII, NF 17). Rockville: Marck Printing; 1990.
2. Ahokas JT, Davies C, Ravenscroft PJ. Simultaneous analysis of disopyramide and quinidine by high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1980;183:65-71.
3. Quattrochi OA, Abelaira S, Laba RF. Introducción al HPLC. Aplicación y práctica. Buenos Aires: Artes Gráficas, 1992.p.302-28.
   

Recibido: 18 de enero de 2003. Aprobado: 24 de febrero de 2003.
M.C. Gisela Gra Ríos. Facultad de Farmacia y Alimentos. Universidad de La Habana. San Lázaro y L, El Vedado, municipio Plaza de La Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Master en Ciencias. Profesora Auxiliar.
2 Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Titular.
3 Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Auxiliar.