Productos Naturales

Laboratorio de Investigaciones del SIDA
Instituto Superior de Ciencias Nucleares y Tecnologías

Inhibición de la replicación del virus de inmunodeficiencia humana por extractos de taninos de Pinus caribaea Morelet

Ignacio Juan Ruibal Brunet,1 Marta Dubed Echevarría,2 Francisco Martínez Luzardo,3 Enrique Noa Romero,4 Luis M. Vargas Guerra5 y Jorge L. Santana Romero6

Resumen

Diferentes concentraciones de 6 extractos de corteza de Pinus caribaea Morelet var. caribaea se enfrentaron a 2 dosis de virus en un ensayo in vitro, sobre células MT4; la actividad antiviral se midió por ensayo inmunoenzimático de captura de proteína 24 del virus. Todas las fracciones mostraron actividad citotóxica moderada y solo una fue altamente tóxica. La fracción 02 mostró un alto porcentaje de inhibición de la replicación viral, en relación con la dosis viral y la concentración del producto, con un índice de selectividad de 100, pero son necesarios estudios adicionales sobre la identificación de la estructura química para definir el mecanismo de acción del producto.

DeCS: TANINOS/uso terapéutico; VIH-1; AGENTES ANTIVIRALES/toxicity.

 

Los taninos vegetales son considerados compuestos polifenólicos que están presentes en diferentes partes de la planta, particularmente en la corteza de numerosos árboles, donde se pueden obtener gran cantidad de estos.1 De acuerdo con su estructura ellos pueden ser clasificados como hidrosolubles (galotaninos, elagitaninos), complejos oligoméricos y taninos condensados.2

Hace algunos años los taninos se consideraron compuestos con actividad biológica dudosa, y sin beneficios farmacológicos de relevancia reportados, ya que parte importante de su estructura aún era desconocida para la ciencia. La definición de la misma hizo posible el estudio y prescripción de nuevas propiedades para estos compuestos, así como la posibilidad de su uso en humanos.3,4

Indiscutiblemente, la actividad antiviral contra el virus herpes simple tipo 1 y 2 (HSV-1, HSV-2),5-7 y más recientemente sobre el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1)8-13 constituyen uno de los más importantes reportes acerca de la actividad biológica de estos compuestos, asociada esta con la estructura química.

La actividad anti VIH-1 se ha relacionado con los grupos hexahidroxidifenoil (HHDP), y valenoil de los elagitaninos punicalinos y complejo oligoméricos, capaces de inhibir la enzima transcriptasa reversa (TR) y la replicación in vitro del VIH-1,9 aunque se ha planteado que los elagitaninos punicalinos no son capaces de inactivar el virión, pero sí muestran una actividad inhibitoria máxima cuando están presentes durante la infección de las células H9.10

El presente estudio describe la actividad anti VIH-1 de seis fracciones de extractos de corteza de Pinus caribaea Morelet var. caribaea.

Métodos

Obtención de los extractos. Se tomaron 150 g de 3 muestras de la especie forestal denominada Pinus caribaea Morelet var. caribaea, la cuales se colectaron en febrero del 2001 en Viñales y se aserraron en La Palma, Pinar del Río; a partir de la corteza del tronco de los árboles (14 % de humedad), se maceraron y sometieron a extracción acuosa (1 L) a régimen de contracorriente por 45 min de 90 a 95 °C.

Los extractos se enfriaron a temperatura ambiente y se filtraron a través de papel Whatman No 1. Uno de ellos se liofilizó a razón de 3,2 g del extracto seco (01PC), el otro se dializó sobre una membrana semipermeable de celulosa contra 2 L de agua, durante 72 h sin agitación, con cambios cada 24 h. Después de la liofilización se obtuvo 2,8 g del extracto seco (02PC).

El análisis del contenido de taninos se hizo por el método espectrofotométrico en UV a una longitud de onda (l) de 280 nm (Martínez F. Obtención, caracterización general y uso industrial de taninos vegetales contenidos en la corteza de 5 especies forestales que crecen en Cuba . Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Técnicas. CNIC. Cuba. 1990).

Una cantidad aproximada de 10 mg del extracto seco de 02PC se diluyó en 1mL de acetona (v-v), se aplicó a una columna de Sefadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals), se eluyó con 30 mL de acetona y 20 mL de acetona acuosa al 25 % (p.a. Merck). Dos fracciones se obtuvieron, una menos polar (03PC), y otra con mayor polaridad (04PC).

El análisis de las fracciones se hizo de acuerdo con el método espectofotométrico de Folin-Denis14 para la determinación cuantitativa de taninos (l=760).

Las fracciones 05PC y 06PC se extrajeron separadamente con éter dietílico (p.a. Merck) (44,6 mL, 3 veces) y después con acetato de etilo (p.a. Merck) (870 mL, 3 veces) respectivamente, se concentraron a presión reducida y se liofilizaron para obtener extractos secos.

Sistemas células virus. La línea celular linfoblástica MT4, altamente susceptible a las cepas de VIH-1, gentilmente donada por el doctor Mark Wainberg, del Centro de SIDA Mc Gill, Montreal, Canadá, se cultivó en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10 % de suero fetal bovino (SFB) (Gibco), 2mM de L-glutamina (Flow) y 100 UI de penicilina por mL y 100 mg/mL de estreptomicina (Gibco) a 37 °C en atmósfera húmeda con 5 % de CO2.

Las células MT4 se infectaron con la cepa VIH-1 IIIB a una alta multiplicidad de infección (MOI), el sobrenadante se cosechó, se tituló por el método de dilución hasta el punto final en placas de 96 pozos15 y se almacenó a -85 °C hasta su uso en el ensayo de actividad antiviral.

Ensayo de citotoxicidad. Seis réplicas del cultivo de células se incubaron con varias concentraciones de las diferentes fracciones (500, 200, 50, 10, 1 y 0,5 mg/mL), la viabilidad se determinó al 7mo día de cultivo por el método de exclusión con azul de tripano, los resultados se expresaron en concentraciones citotóxicas medias (CC50).

Ensayo de actividad antiviral. Las células se pretrataron por 3 h con las concentraciones subtóxicas de los extractos y con 1 y 5 mM de azido timidina (AZT), droga con una potente actividad antiviral reconocida (Wellcome Burroughs Inc.). Después del período de pretratamiento se lavaron con solución de fosfato tamponada (PBS) y se infectaron con la cepa VIH-1 IIIB a una MOI de 0,1 y 0,01 durante 1 h a 37 °C. Posteriormente se lavaron una vez más de la misma forma y se cultivaron en placas de cultivo de 96 pozos, fondo plano, con el medio de cultivo mencionado anteriormente que además contenía las concentraciones de las fracciones seleccionadas (50, 25, 10, 1 y 0,5 mg/mL). Se utilizaron células controles sin droga y con AZT. Las placas se incubaron a 37 °C en atmósfera húmeda con 5 % de CO2.

Al 7mo día se realizó la cosecha, el sobrenadante se analizó por ELISA de captura Agp24 (DAVIH Agp24, DAVIHLAB, Cuba), los resultados se expresan como concentración inhibitoria media (CI50), el porcentaje de inhibición se calculó como sigue:

El índice de selectividad (IS) se determinó de acuerdo con la fórmula:16

Análisis estadístico. El porcentaje de inhibición se comparó mediante el método de comparación múltiple de proporciones.

Resultados

Por el sistema de purificación aplicado se obtuvieron 6 fracciones, la composición de cada una y el resultado del ensayo de citotoxicidad se muestran en la tabla 1.

TABLA 1. Composición y toxicidad de las diferentes fracciones

Fracción	Toxicidad	Composición
01	100 mg/mL	63 % de taninos condensados de origen floroglucinólicos y no taninos
02	100 mg/mL	>84 % d1e taninos condensados de origen floroglucinólicos y no taninos en menor concentración
03	>200 mg/mL	Taninos menos polares
04	100 mg/mL	Taninos de mayor polaridad
05	Altamente tóxico	Fenoles simples de bajo peso molecular
06	150 mg/mL	86 % de taninos

En esta tabla 1 puede apreciarse que la fracción 01PC que pertenece al extracto crudo soluble tuvo el 65 % aproximadamente de taninos y alcanzó una CC50 de 100 mg/mL. Mientras que 02PC mostró una cantidad de taninos mayor del 84 %, con mayor presencia de taninos concentrados, y una concentración citotóxica similar a la de la fracción mencionada.

Cuando 02PC se fraccionó por columna de Sefadex LH-20, el grupo de compuestos más polares (04PC) mostró una CC50 menor que la sustancia menos polar (03PC). Por su parte la fracción 05PC resultó altamente tóxica.

La mezcla de taninos de pequeña talla y bajo peso molecular, obtenidos por extracción con el acetato de etilo en la fracción 06PC mostró una CC50 =150 mg/mL.

De las 6 fracciones estudiadas, solo 02PC mostró actividad antiviral (tabla 2), la cual fue dependiente de la dosis con diferencias significativas entre estas (p = 0,01). Cuando se usó la concentración menor del producto frente a la MOI = 0,01, se evidenció una CI50 = 1mg/mL, con un IS de aproximadamente 100.

TABLA 2. Efecto de la fracción 02PC sobre la replicación del VIH-1 por ELISA de captura de Ag p24. n = 3

02PC Concentración mg/mL	MOI 0,1 % de inhibición	MOI 0.01 % de inhibición
50	89,8	95,4
25	76,1	84,5
10	38,6	81,7
1	56,3	75,6
0.5	0	43,8

 

Discusión

Al igual que otros taninos, los de la corteza de Pinus caribaea Morelet var, caribaea se consideran floroglucinólicos condensados, formados por la mezcla heterogénea de flavonoides policondensados con la presencia de proantocianidinas que poseen una configuración cis mayor del 70 %.

Mediante el sistema de purificación empleado se obtuvieron 6 fracciones, con diferentes composiciones y concentraciones de taninos y con diferente actividad biológica.

En la fracción 01PC, la actividad anti VIH-1 no se detectó posiblemente debido a la baja concentración de compuesto activo o la presencia de sustancias que bloquean la actividad antiviral.

La fracción 02PC mostró una fuerte actividad antiviral evidenciado por el IS, esta respuesta está relacionada con el mayor porcentaje de taninos presentes en esta muestra.

La actividad antiviral nula en 03 y 04PC probablemente fue debido a las cambios en la composición estructural que pudo producirse en el proceso de separación, y que se ha reportado como importante para la actividad anti-VIH.5,7,10

Al analizar la fracción 05PC no se evidenció actividad antiretroviral, porque la presencia de compuestos fenólicos de menor peso molecular reportados poseen actividad citotóxica y baja actividad anti-VIH, además la presencia de resinas detectadas pudo contribuir a este resultado.7,17

La ausencia de actividad inhibitoria de 06PC frente al virus probablemente estuvo mediada por la pérdida de taninos con actividad inhibitoria de la replicación viral en el proceso de separación o por la ocurrencia de transformaciones químicas durante el proceso de extracción líquido-líquido.

A pesar de las diferencias entre el tipo de ensayo realizado, la carga viral, la pureza y concentración de los compuestos, estos resultados son comparables con los reportados por otros autores en relación con los taninos y el VIH. 7-13,18

El presente estudio indica que el extracto dializado de la corteza de Pinus caribaea Morelet var. caribaea contiene actividad anti VIH-1 y aunque los hechos experimentales indican que la misma puede ser atribuida a los taninos de alta masas molecular, los cuales poseen una actividad trópica con proteínas y ácidos nucleicos,21 son necesarias más investigaciones para identificar la estructura activa del compuesto y el posible mecanismo de acción antiviral.

Summary

Six different fractions from the bark of Pinus caribae Moralet var. caribae were faced in five different concentrations against two viral doses (MOI 0,1 y 0,01) in a vitro assay on MT4 cell lines; the antiviral activity was measured by p24 Ag capture ELISA assay (DAVIH Agp24). All the fractions showed a mild cytotoxicity activity and only one fraction showed the highest cytotoxicity activity. The fraction 02 had the highest percentage of viral replication inhibition, correlated with the viral dose and the product concentration, having a selectivity rate of 100; however, more research about the chemical structure of active compounds, and possible mechanisms of action are needed.

Subject headings: TANNINS/therapeutic use; HIV-1; ANTIVIRM AGENTS/toxity.

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Recibido: 8 de enero de 2003. Aprobado: 13 de febrero de 2003.
Dr. Ignacio Juan Ruibal Brunet. Laboratorio de Investigaciones del SIDA. Apartado Postal 23031, Marianao 14, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

1 Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Laboratorio de Investigaciones del SIDA.
2 Master en Virología. Investigadora Auxiliar. Laboratorio de Investigaciones del SIDA.
3 Doctor en Ciencias Químicas. Investigador Auxiliar. Instituto Superior de Ciencias Nucleares y Tecnologías.
4 Master en Microbiología. Investigador Auxiliar. Laboratorio de Investigaciones del SIDA.
5 Técnico en producciones Forestales. Instituto Superior de Ciencias Nucleares y Tecnologías.
6 Master en Ciencias. Profesor Auxiliar. Instituto Superior de Ciencias Nucleares y Tecnologías.