Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Validación de un método analítico alternativo para la cuantificación de hidralazina en un inyectable de 20 mg/mL

Lisette Martínez Miranda1 y Aleyda Chang Valdés2

Resumen

Se desarrolló un método analítico por espectrofotometría ultravioleta para la cuantificación de hidralazina en un inyectable de 20 mg/mL. En la validación se evaluaron los parámetros de especificidad para estos fines, linealidad del sistema, exactitud y precisión expresada en sus 2 formas, repetibilidad y reproducibilidad. El método analítico resultó ser sencillo y rápido, además de específico, lineal, preciso, exacto en el rango de concentraciones estudiadas.

Palabras clave: hidralazina, espectrofotometría, validación.

La hidralazina ejerce efectos importantes sobre el sistema cardiovascular. Las dosis adecuadas disminuyen la presión arterial, la diastólica más a menudo que la sistólica, y la resistencia vascular periférica.

Este principio activo comercialmente se presenta en forma de tabletas de 10, 25, 50 y 100 mg para administración por vía oral y en ámpulas de 1 mL de 20 mg para inyección por vía intravenosa o intramuscular con mayor biodisponibilidad.1

Existen reportes sobre métodos analíticos empleados para la cuantificación de hidralazina en diferentes formas farmacéuticas. Por ejemplo, en los últimos años se reportan diversos métodos espectrofotométricos y colorimétricos para la cuantificación de este principio activo en formulaciones combinadas que contienen otros principios activos como isoniacida, oxoprenolol y clortalidona, hidroclorotiazida entre otros.2-7

La USP 24 reporta para este medicamento un método titrimétrico para el control de calidad del producto terminado y otro por cromatografía líquida de alta resolución para la cuantificación de clorhidrato de hidralazina, materia prima, donde se utiliza una columna de fase reversa y detección ultravioleta a una longitud de onda fija de 230 nm.8

El desarrollo de técnicas o métodos analíticos novedosos o la adecuación de algunos ya reportados es un problema cotidiano. Siempre que esto suceda se exige como parte integral del estudio la validación del método en cuestión. La validación proporciona un alto grado de confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico así como la calidad de los resultados.

Los parámetros analíticos que pueden ser considerados en la validación de un método analítico, según se expresa en la USP 24, son exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, tolerancia y robustez.9,10

El objetivo de este trabajo fue el desarrollo y validación de un método analítico especrofotométrico alternativo, sencillo y rápido para la cuantificación del principio activo en el inyectable.

Métodos

Las muestras utilizadas para el desarrollo de este trabajo fueron identificadas según los ensayos tecnológicos 134, 135 y 136, fabricados en el Departamento de Formas Terminadas del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).

En el desarrollo del método analítico por espectrofotometría ultravioleta se utilizó un espectrofotómetro Spectronicâ GénesisTM 2PC; para la selección adecuada de la longitud de onda a utilizar, se realizaron previamente espectros UV-Vis de sustancia de referencia de hidralazina HCl USP, materia prima de hidralazina HCl, producto terminado y placebo, disueltos en ácido clorhídrico 0,1 N.

La solución de referencia se obtiene disolviendo hidralazina HCl sustancia de referencia en ácido clorhídrico 0,1 N hasta obtener una concentración de 20 µg/mL aproximadamente.

En la preparación de la disolución de ensayo para la valoración se disuelve una alícuota de la muestra del inyectable en ácido clorhídrico 0,1 N hasta una concentración de alrededor de 20 µg/mL. La extracción de los excipientes se realiza con 3 volúmenes de cloroformo. Se desecha la fase clorofórmica y se determina la fase acuosa a 303 nm contra un blanco de ácido clorhídrico 0,1 N.

En la validación del método de análisis en el estudio de la linealidad del sistema se prepararon muestras con diferentes niveles hidralazina HCl que representan el 20, 40, 60, 80, 100, 110 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en el inyectable.

Se realizó el cálculo de la precisión del método expresada en sus 2 formas: repetibilidad y reproducibilidad. La repetibilidad se realizó sobre la base de 10 determinaciones y se estudió la reproducibilidad haciendo las valoraciones por 2 analistas y en diferentes días.
Para el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación, se prepararon muestras placebos por triplicado, adicionando a éstas concentraciones conocidas de hidralazina HCl que correspondían al 80, 100 y 120 % de lo declarado de principio activo.

Se determinó también para el ensayo de exactitud, la influencia del factor concentración en los resultados mediante la prueba de G de Cochran.

El procesamiento estadístico se llevó a cabo mediante el programa Microcal Origin (Versión 5.0).

Resultados

El espectro UV realizado a la sustancia de referencia y materia prima coinciden, con un máximo a 303 nm, longitud de onda escogida. Las muestras de producto terminado y placebo presentaron interferencias en las determinaciones a esa longitud de onda por la presencia de metilparabeno y propilparabeno en la formulación.

La curva de calibración a una longitud de onda de 303 nm resultó ser lineal en un rango de concentraciones entre 4 y 24 µg/mL.

La ecuación de la recta se expresa según:

Y = -0,00075 + 0,02782

y el coeficiente de correlación (r) fue igual a 0,99975.

Al aplicar la prueba del intercepto este resultó ser no significativo ya que la texp < ttab (texp = 0,316; ttab= 2,571).

Cuando se aplicó la prueba de linealidad mediante el coeficiente de variación de los factores de respuesta, se obtuvo como resultado un CV = 1,94 % (tabla 1).

En la tabla 2 se presentan los resultados correspondientes a la repetibilidad y reproducibilidad.

Es posible encontrar valores registrados en el intervalo comprendido entre 99,061 y 99,689 con un nivel de significación del 5 %.

En la tabla 3 se muestran los resultados obtenidos en el estudio de exactitud.

TABLA 1. Resultados del estudio de linealidad

Concentración(µg/mL)	Absorbancia	f
4 4 4	0,107 0,107 0,08	0,0267 0,0267 0,0270
8 8 8	0,231 0,229 0,229	0,0288 0,0286 0,0286
12 12 12	0,329 0,329 0,330	0,0274 0,0274 0,0275
16 16 16	0,444 0,444 0,444	0,0277 0,0277 0,0277
20 20 20	0,552 0,549 0,552	0,0276 0,0275 0,0276
22 22 22	0,615 0,615 0,614	0,0279 0,0279 0,0279
24 24 24	0,671 0,666 0,667	0,0279 0,0277 0,0278

X = 0,0277; S = 0,0005; CV = 1,94

TABLA 2. Resultados del estudio de precisión

Reproducibilidad (%)	Día 1	Día 2
Analista 1	x1 = 100,0 x2 = 99,03 x1 = 98,25 x2 = 99,22	x1 = 100,0 x2 = 99,27 x1 = 99,44 x2 = 98,70
Analista 2	x1 = 98,25 x2 = 99,22 x1 = 100,1 x2 = 99,81	x1 = 100,0 x2 = 99,44 x1 = 99,44 x2 = 99,84
X analista 1 = 99,24 %     S1 = 0,59 X analista 2 = 99,51 %     S2 = 0,59 Fexp  = 1,01  Ftab  = 3,79  gl = 7/7 t exp  = 0,91  t tab  = 2,145	X día 1 = 99,23 %            S1 = 0,72 X día 2 = 99,51 %            S2 = 0,43 Fexp = 2,76  Ftab  = 3,79  gl=7/7 t exp = 0,94  t tab  = 2,145
Intervalo de confianza: 99,375 ± 0,314; CV = 0,59 %; S = 0,59

 

TABLA 3. Resultados del estudio de exactitud

Niveles de concentración estudiados (%)	mg teóricos (adicionados)	mg prácticos (recuperados)	Recobrado (%)
80	16,1 16,1 16,4	16,23 16,17 16,17	100,80 100,47 98,53
100	20,6 20,6 20,6	20,47 20,70 20,66	99,37 100,48 100,29
120	24,4 24,2 24,4	24,55 24,24 24,43	100,61 100,16 100,12

R = 100,09 %; S = 0,713; CV = 0,71 %

Al aplicar la prueba de G de Cochran no se observó influencia del factor concentración en la variabilidad de los resultados de la exactitud, para p = 0,05; K = 3 y n = 3; Gexp = 0,5957 < Gtab = 0,871.

Al aplicar la prueba de la t de Student se comprobó que no existen diferencias significativas entre la recuperación media (100,09 %) y el 100 % de recuperación de acuerdo con los resultados obtenidos (texp = 0,38 < ttab = 2,306).

En la curva de recuperación obtenida, la ecuación de la recta resultó ser y = -0,99941 + 1,00987 x, con un coeficiente de correlación (r) igual a 0,99941.

Al aplicar la prueba de significación del intercepto y de la pendiente resultaron no significativos.

Discusión

Las muestras de producto terminado y placebo presentaron interferencias en las lecturas a 303 nm en el espectro UV realizado; por tanto, se realizó una extracción previa con disolvente (cloroformo), la cual nos permitió eliminar estas interferencias y que el método sea específico para la determinación del principio activo.

En la prueba de linealidad el coeficiente de variación de los factores de respuesta demuestra una adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido (CV < 5 %).

Para el caso de la repetibilidad el coeficiente de variación alcanzado muestra una buena precisión, ya que para los métodos espectrofotométricos se permite como límite máximo el 3 %.

Como se indica en la tabla 2 los valores de reproducibilidad demuestran que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por ambos analistas, al igual que los obtenidos en el análisis de la precisión en días diferentes, para el 95 % de probabilidad, ya que el valor calculado de la prueba de Fisher es menor que el tabulado.

Al realizar la prueba de la t de Student el valor calculado resultó ser menor que el tabulado para el 95 % de probabilidad y 14 grados de libertad, lo que demostró que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas por ambos analistas, así como entre las medias obtenidas en días diferentes.

En el estudio de exactitud, en el rango seleccionado, los valores del coeficiente de variación para cada nivel de concentración analizados resultaron menor del 2 %, y los valores del porcentaje de recobrado cumplieron con los límites establecidos para este tipo de método.

Los resultados al aplicar la prueba de G de Cochran indican que las varianzas de las concentraciones que se emplearon son equivalentes, por lo que se asume que la concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

Al aplicar la prueba de de la t de Student se confirma la buena exactitud del método. La curva de recuperación obtenida demuestra la linealidad del método. Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación demuestran la exactitud y linealidad del método.

El método analítico alternativo espectrofotométrico desarrollado para el control de calidad de un inyectable de hidralazina HCl de 20 mg/mL es adecuado y rápido para estos fines, y en la validación resultó ser lineal, preciso, exacto y específico en el rango de concentraciones estudiado

Summary

An analytical method was developed by ultraviolet spectrophotometry to quantify hydralazine in an injection of 20 mg/mL. In the validation, the parameters of specificity to these ends, lineality of the system, accuracy and precision expressed in its 2 forms, repeatablity and reproducibility, were evaluated. The analytical method proved to be simple, fast, linear, accurate and exact in the range of the studied concentrations.

Key words: hydralazine, spectrophotometr,. validation.

Referencias Bibliográficas

1. Goodman A, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Tomo 3. La Habana: Editorial Científico-Técnica; 1982. p.791. (Edición Revolucionaria).
   
2. Mahrous MS. Daabees HG. New colorimetric method for detemination of isoniazid and hydralazine hydrochloride. Egyp J Pharm Sci 1992;33:3-4.
   
3. Mari-Buigues J. Manes VJ. Spectrophotometric determination of hydralazine with 2-hidroxy-1-naphthaldehyde in pharmaceuticals. J Pharm Sci 1991;80:690-2.
   
4. Barary MH, Elsayed MA. Spectrophotometric determination of hydralazine hydrochloride, oxoprenolol hydrochloride and chlorthalidone in combination and for oxoprenolol hydrochloride as single component dosage form. Drug Develop Indust Pharm 1990;16:1539-54.
   
5. Bedair M. Korany MA. UV-derivate spectrophotometric determination of hydralazine hydrochloride in combination with hydrochlorothiazide or propranolol hydrochloride. Sci Pharm 1986;54:31-6.
   
6. Stewart JP, Park EH. Colorimetric determination of hydralazine hydrochloride with 9-methoxyacridine. Int J Pharm 1983;17:161-6.
   
7. Dutt MC. Spectrophotometric determination of hydralazine hydrochloride tablets using ninhydrin. J Assoc Off Anal Chem 1983;66:1455-7.
   
8. United States Pharmacopoeia 24 and National Formulary 19. United States Pharmacopeial Convention. Rockville: Mck Printing; 2000. p.818.
   
9. United States Pharmacopoeia 24 and National Formulary 19. Validation of Compendial Methods. United States Pharmacopeial Convention. Rockville: Mck Printing; 2000. p.2149.
   
10. Standar Procedure: Protocolo for the validation of analitical method. 1992. p.22-3.
    

Recibido: 6 de octubre de 2003. Aprobado: 14 de noviembre de 2003.
Lic. Lisette Martínez Miranda. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave. 26 No. 1605, entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

1Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
2Técnica en Tecnología Farmacéutica.