Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Validación del método analítico para el estudio de estabilidad del inyectable de clonazepam 1 mg/mL

Caridad M. García Peña,1 Zenia Pardo Ruiz,2 Leonid Torres Amaro,3 Adriana Muñoz Cernada,4 Dianelys Fernández Mena5 y Vivian Martínez Espinosa6

Resumen

Se validó el método analítico desarrollado para el estudio de estabilidad en la cuantificación de clonazepam inyectable 1 mg/mL por cromatografía líquida de alta resolusión con detección ultravioleta a 310 nm. La curva de calibración se realizó en el rango de 20,8 a 43,2 µg/mL, la cual fue lineal con un coeficiente de correlación igual a 0,99624; la prueba estadística para el intercepto y la pendiente se consideró no significativa. Se obtuvo un recobrado del 99,6 % en el rango de concentración estudiado y las pruebas de Cochran´(G) y Student´s (t) resultaron no significativas. El coeficiente de variación en el estudio de la repetibilidad se comportó igual a 0,69 % para 10 réplicas ensayadas, mientras que en los análisis de la precisión intermedia las pruebas de Fischer y Student fueron no significativas. El método se cosidera específico, lineal, preciso y exacto.

Palabras clave: Clonazepam, cromatografía líquida de alta resolución.

El clonazepam es una benzodiazepina con marcadas propiedades anticonvulsivantes. Esta indicado para el tratamiento solo o como coadyuvante en la mayoría de las formas clínicas de la epilepsia, particularmente las ausencias típicas y atípicas, crisis de ausencias refractarias a succinimidas. Se absorbe completamente en el tracto gastrointestinal, es metabolizado extensivamente y su principal metabolito es 7-aminoclonazepam que presenta una mínima actividad anticonvulsivante.1, 2

La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas de que el método es lo suficientemente fiable para producir el resultado. En la validación del método analítico se estudiaron los parámetros siguientes: especificidad, linealidad del sistema, precisión y exactitud.3-6

En el presente trabajo se describe y valida un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución a fin de cuantificar el principio activo para los estudios de estabilidad en clonazepam inyectable 1mg/mL.

Métodos

El método por cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) para cuantificar el clonazepam en el estudio de estabilidad del inyectable, se basa en la separación de este en una columna cromatográfica con detección ultravioleta y la cuantificación de esta frente a una muestra de referencia con el empleo del método del patrón externo.

El estándar de referencia del clonazepam fue suministrado por la UCTB Aseguramiento de la Calidad del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). El producto terminado en forma de inyectable de 1 mg/mL, fue elaborado en la UCTB Tecnologías Básicas del CIDEM. Todos los reactivos utilizados fueron de calidad puro para análisis.

En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 310 nm, un dosificador (Loop) de 50 mL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna Lichrospher 250 x 4 m, RP 18, 5 µm. La fase móvil utilizada consistió en una mezcla desgasificada de 3 componentes, solución buffer hidrógeno fosfato de amonio dibásico a pH 8,0:metanol:tetrahidrofurano de proporción (62:50:13) con una velocidad de flujo de 1,0 mL/min.

Para el análisis se disolvió una cantidad exacta del estándar de referencia de modo que se obtuviera una solución con una concentración final de 32 µg/mL. Las muestras fueron preparadas de forma similar, disolviendo en diluente (mezcla desgasificada de agua:metanol:tetrahidrofurano de proporción (62:50:13), una alícuota de 4 mL del pool elaborado con 20 ámpulas.

Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizó una muestra placebo y una muestra sometida a condiciones drásticas como: hidrólisis ácida HCl 5 N, hidrólisis básica NaOH 5 N, oxidación H2O2 y exposición de la luz (debido a que el principio activo es fotosensible).7

Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones patrón de clonazepam en un rango de concentraciones de 20,8 a 43,2 mg/mL, que representan del 65 al 135 % de la concentración teórica del principio activo en el inyectable.8

Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 10 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método.9

En el estudio de la exactitud y linealidad del método se empleó el método de recuperación, preparando muestras con diferentes niveles de clonazepam en un rango de concentraciones de 25,6 a 38,4 mg/mL, que representaban el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en el inyectable, según la formulación propuesta.10

Todos los resultados obtenidos fueron evaluados estadísticamente con la ayuda del programa Microcal Origin 5.0 para Windows.

Resultados

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Como se observa en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (A) no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, al ser comparado con la señal obtenida para la solución estándar de referencia (B) y de la muestra de clonazepam en el inyectable (C), lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solución no interfieren en la determinación del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drásticas de exposición a la luz, hidrólisis básica, se observan en los cromatogramas (D, E, respectivamente) la aparición de 2 picos secundarios, a los 5 y a los 10 min aproximadamente, atribuible a un posible producto de degradación, el cual no interfiere en la determinación del principio activo. En los casos de las muestras sometidas a H2O2 e hidrólisis ácida, como se puede apreciar en los cromatogramas (F, G, respectivamente), en el primer caso solo aparece un pico secundario, el de los 5 min, mientras que en el segundo caso aparece solo el de los 10 min.

FIG. Resultados del estudio de especificidad del método. A: cromatograma del placebo; B: cromatograma del estándar
de referencia química; C: cromatograma de la muestra; D: cromatograma de la muestra degradada por exposición a la luz;
E: cromatograma de la muestra degradada por oxidación; G: cromatograma de la muestra degradada por hidrólisis
ácida HCL 5 N.

La ecuación de la recta de la curva de calibración en el rango de concentraciones entre 20,8 y 43,2 mg/mL, se expresa según y = 0,9815 X + 0,0136, con un coeficiente de correlación lineal de 0,99624. Al aplicar la prueba de significación del intercepto se obtuvo una tcal= 0,044 para una ttab= 3,18. Cuando se aplicó la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf se obtuvo como resultado un CV= 0,82 %.

Los resultados del estudio de la precisión aparecen en la tabla 1.

En la tabla 2 se muestran los resultados obtenidos en el estudio de la exactitud del método. En la curva de recuperación, se reportan los mg teóricos contra los mg prácticos, obteniéndose la ecuación de la recta: y = 1,4788 X - 0,2035, con un coeficiente de correlación de 0,99532.

TABLA 1. Estudio de la precisión del método analítico

Repetibilidad		Precisión intermedia
Muestras	%	Analista 1		Analista 2
1	102,0	Día 1	Día 2	Día 1	Día 2
2	102,1	102, 0 %	100,0 %	100,8 %	100,4 %
3	102,5	102, 0 %	102,2 %	101,3 %	100,5 %
4	101,9	101, 9 %	100 8 %	102,1 %	101,8 %
5	102,0	101, 9 %	102,1 %	100,5 %	101,3 %
6	102,2	102, 0 %	101, 8 %	101,0 %	101,5 %
7	103,1	X1= 102, 0%	X2= 101,4 %	X1= 101,1 %	X2= 101,2 %
8	104,1	DSR = 0,4 %	DSR = 0,9 %	DSR = 0, 6 %	DSR = 0,6 %
9	102,0	Fcal = 0, 094		t cal = 0,4483
10	101,9	Ftab (4; 4; 0, 05) = 6, 39		t tab (8; 0, 05) =2,306
Media = 102,3 % DSR = 0,7 % CV = 0, 69 %	Intervalo de confianza: 101,7 ± 0,71%

TABLA 2. Resultados de estudio de exactitud

mg adicionados	mg recuperados			Recobrado (%)	CV (%)
0,8	0,81	0,79	0,83	100,8	1,89
1,0	0,99	1,01	0,98	99,3	1,54
1,2	1,20	1,22	1,20	100,1	0,96

Al aplicar la prueba de significación para conocer la influencia de la concentración (G de Cochran), se obtuvo una Gcal= 0,8204 para una Gtab= 0,8709.

Al realizar la prueba de significación entre la recuperación media y el 100 % de recuperación, se obtuvo una tcal= 0,3705 para una ttab= 2,306.

Discusión

Los resultados obtenidos del análisis de la muestra placebo, la solución de referencia, la muestra del producto terminado y la muestra degradada por hidrólisis ácida HCl 5 N, hidrólisis básica NaOH 5 N, oxidación H2O2 y por exposición a la luz (fig.), demuestran la especificidad del método al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elución del producto principal.

La curva de calibración resultó ser lineal en un rango de concentraciones entre 20,8 y 43,2 mg/mL.

Al aplicar la prueba del intercepto, este resultó ser no significativo ya que la tcalc fue menor que la tcalculada para 4 grados de libertad y una probabilidad de 0,05. En la prueba de linealidad mediante los coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf se obtuvo un coeficiente de variación menor del 5 %, lo que demuestra la adecuada linealidad de acuerdo con el límite establecido, y así el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentración estudiado.

En el estudio de la repetibilidad se alcanzó un coeficiente de variación adecuado, lo que demuestra la buena precisión del método según el límite para los métodos cromatográficos CV £ 2 %. Los valores obtenidos para el estudio de la precisión intermedia demuestran que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días, para una probabilidad de 0,05 % ya que el valor de Fcalculada es menor que la Ftabulada. Al realizar la prueba t de Student el valor calculado resultó ser menor que el tabulado para una probabilidad de 0,05 y 8 grados de libertad, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas con un nivel de significación del 5 %.

En el rango seleccionado en el estudio de exactitud, los valores de porcentaje de recobro estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos (98-102 %), y los valores del coeficiente de variación para cada uno de los niveles de concentración estudiados resultaron ser menor que el 2 %.

En la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran se obtuvo que Gexperimental fue menor que la Gtabulada para una probabilidad de 0,05, k =3 y n = 3; por tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes e indican que la concentración no influye en la variabilidad de estos.

No existen diferencias significativas entre la recuperación media (99,6 %) y el 100 % de recuperación al aplicar la prueba de la t de Student, ya que la tcalculada fue menor que la ttabulada para 8 grados de libertad y una probabilidad de 0,05, por lo que el método es exacto.

La curva de recuperación reportada de mg teóricos contra los mg prácticos demostró un comportamiento lineal.

La prueba de significación del intercepto resultó no significativa y el valor de la pendiente no difiere significativamente de la unidad.

Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación demostraron la exactitud y linealidad del método.

En conclusión, el método analítico desarrollado por cromatografía líquida de alta resolución para el estudio de estabilidad del clonazepam inyectable resultó ser lineal, preciso, exacto y específico en el intervalo de concentraciones de 20,8 y 43,2 mg/mL.

Summary

The analytical method developed by the stability study in the quantification of injectable clonazepam 1 mg/mL was validated by high resolution liquid chromatography with ultraviolet detection at 310 nm. The calibatrion curve was performed in the range from 20.8 to 43.2 mg/mL, which was lineal, with a correlation coefficient equal to 0.99624. The statistical test for the interval and the slope was considered as non significant. It was attained a recovery of 99,6 % in the studied concentration range. Cochran (G) and Student's (t) tests were not important. The variation coefficient in the repeatability study was equal to 0.69 % for 10 tested replicas, whereas Fischer and Student's tests were not significant in the analysis of intermediate precision. The method was considered specific, lineal, accurate and exact.

Key words: Clonazepam, high resolution liquid chromatography.

Referencias Bibliográficas

1. Goodman AG, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Tomo II. 3 ed. La Habana: Editorial Científico Técnica; 1994. p.791. (Edición Revolucionaria).
   
2. Martindale W. The Extra Pharmacopoeia. 28 ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. p.1234-5.
   
3. Castro M, Gascón S. Validación de Métodos Analíticos. Sección Catalana de AEFI. Comisión de normas de buena fabricación y control de la calidad. Sept, 1989. p.1-94.
   
4. United States Pharmacopoeial Convention, USP 23. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville: Mack Printing; 1995. p.1982-4.
   
5. Standar Procedure: Protocol for the validation of analytical method. 1992.22-3.
   
6. ICH Tepic Q2B. Validation of Analytical Procedures. Methodology. Step 4. Consensos Guideline, Nov. 6/1996.
   
7. Sarrio RV, Silvestre LJ. Validation of Analytical Assays and Test Methods for the Pharmaceutical Laboratory. The Regulatory Forum. Bioserch. 1996.
   
8. Text on Validation of Analytical Procedures. Federal Register, Vol. 60. No. 40; Wednesday March 1, 1995. Docked No. 94 D-0016.
   
9. Tissue BM. Accuracy and Precision. Encyclopedia of Analytical Instrumentation. 1996.
   
10. Reviewer Guidanc. Validation of Chromatographic Methods. Analytical Methods Technical Committee of the Chemistry, Manufacturing Controls Coordinating Committee of CDER at FDA. November 1, 1994.

Recibido: 13 de enero de 2004. Aprobado: 20 de febrero de 2004.
Lic. Caridad M. García Peña. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave 26, No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de la Revolución, CP 10 600, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

1 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Investigador Aspirante.
2 Técnica en Tecnología Farmacéutica.