Instituto de Farmacia y Alimentos. Universidad de la Habana

Caracterización neurofarmacológica de la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina obtenida bajo irradiación de microondas

Milena Díaz Molina,1 Héctor Pérez Saad,2 Margarita Bu Wong3 y Nora Sánchez Rodríguez3

Resumen

Algunas aril-oxazolinas han sido descritas como sustancias activas sobre el sistema nervioso central, con efectos y aplicaciones diversas como depresoras, anestésicos, anticonvulsivantes, etc. En el presente trabajo se realizó la caracterización neurofarmacológica primaria de la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina, obtenida por un método de síntesis bajo radiación de microondas como fuente energética. La realización de la prueba de Irwin mostró que este compuesto presenta un efecto depresor sobre el sistema nervioso central, con una notable inhibición de la actividad motora y del tono muscular, con pérdida de los reflejos posturales. A dosis moderadas estos efectos se acompañaron de signos de excitación central. Estas características sugirieron una acción de tipo periférica, confirmado por el efecto bloqueador de las contorsiones en la prueba de irritación peritoneal por ácido acético al 0,8 % y la disminución de la amplitud del potencial de acción neuromuscular compuesto durante la estimulación supramáxima del nervio ciático, pruebas que evidenciaron una acción anestésica local para la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina.

Palabras clave: 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina, 2-aril-oxazolinas, anestesia local, potencial de acción muscular compuesto (PAMC).

Los compuestos de la familia de las 2-oxazolinas han suscitado un gran interés desde hace más de un siglo, por sus amplias posibilidades de aplicación práctica en diferentes ramas de la industria química: como aditivos para pinturas y cosméticos, tensoactivos, inhibidores de la corrosión, etc. En el campo de la industria médico farmacéutica, compuestos de esta familia han sido reportados como vasoconstrictores, depresores del sistema nervioso central, supresores de las secreciones gástricas y del apetito, anestésicos locales, etcétera.1

Por otra parte, en Cuba se desarrollan métodos de síntesis química que utilizan la activación bajo microondas como fuente energética. Por esta vía se obtienen gran cantidad de compuestos orgánicos, entre los cuales se encuentran alquil- y aril- oxazolinas.2, 3 Estos procedimientos de síntesis transcurren en muy cortos tiempos de reacción con elevados rendimientos y purezas, y en la mayoría de los casos el proceso se realiza en ausencia de disolventes, por lo que disminuyen tanto los costos como el impacto ambiental. Con los antecedentes de actividad sobre el sistema nervioso central de algunos compuestos de la familia de las 2-oxazolinas y teniendo en cuenta las ventajas en cuanto al método de síntesis utilizado, el presente trabajo se trazó como objetivo fundamental efectuar la caracterización, desde el punto de vista neurofarmacológico, de la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina, obtenida por síntesis química bajo irradiación de microondas como fuente energética.

Métodos

Animales: Se emplearon ratones de la cepa OF1, adultos machos con rango total de pesos corporales entre 18 y 30 g, procedentes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), con certificado de calidad y control veterinario, los cuales fueron adaptados a las condiciones del laboratorio y mantenidos durante 15 días antes del experimento en condiciones naturales de luz-oscuridad (12/12 h), a temperatura ambiental de 25 oC, con comida y agua ad libitum.

Fármacos utilizados: Todos los fármacos se administraron por vía intraperitonial (ip), en volúmenes de 0,01 mL/g de peso corporal. Los animales utilizados como controles recibieron solución salina fisiológica con ácido tartárico 0,3 %, en iguales volúmenes. Las drogas empleadas como controles positivos fueron: morfina, pentobarbital y lidocaína, preparadas a partir de concentraciones conocidas de inyectables producidos por la Industria Médico Farmacéutica (IMEFA), Cuba.

Prueba neurofarmacológica de Irwin.4 Se emplearon 3 animales por cada una de las dosis evaluadas: 100, 200, 300, 400, 600, 800 y 900 mg/kg de la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina (OX), las cuales fueron administradas 20 min antes de la observación conductual.

Toxicidad aguda (Método de Litchfield y Wilcoxon).5 Permitió la determinación de los diferentes niveles de dosis letales (DL): DL10, DL50, y DL90. Se utilizaron 5 subgrupos de 6 animales cada uno, correspondientes a cada una de las dosis empleadas de OX (500, 600, 700, 800 y 900 mg/kg.) Para esta determinación se utilizaron ratones con rango de peso entre 18 y 22 g.

Irritación peritonial por ácido acético.6 Se inyectó por vía ip ácido acético al 0,8 % en volúmenes de 0,2 mL/ por 20 g de peso corporal y se contaron las contorsiones o estiramientos abdominales durante 20 min después de aplicada la inyección. Se utilizaron 5 grupos de 7 ratones cada uno, cuyo peso corporal osciló entre 22 y 26 g: un grupo control y los otros fueron tratados con dosis de 10, 25, 40 y 50 mg/kg de OX, respectivamente, 20 min antes de aplicar la inyección de ácido acético.
Analgesia plantal. Prueba del plato caliente.7 Se colocaron los animales, de peso corporal entre 24 y 28 g, en una plancha a una temperatura de 48 oC regulada por un ultratermostato, restringiendo el movimiento del animal en un cilindro plástico transparente de 10 cm de diámetro y 15 cm de altura. Como medida de respuesta al dolor, se tomó el tiempo de lamido de las patas traseras. El tiempo máximo de medición fue de 3 min. Se ensayaron 3 dosis de OX: 30, 100 y 300 mg/kg y una dosis de morfina de 5 mg/kg como control positivo.

Medida del potencial de acción neuromuscular compuesto.8 Se registró el potencial neuromuscular durante la estimulación eléctrica del nervio ciático en ratones cuyo peso corporal oscilaba entre 29 y 30 g. Se utilizaron cuatro electrodos de agujas: dos de registro, colocados en una de las extremidades posteriores del animal y dos de estimulación, situados subcutáneamente en el borde anterior (cátodo) y posterior (ánodo) de la parte proximal del muslo, respectivamente. Se utilizó un pulso cuadrado de 25 V, 0,1 Hz y 0,1 ms de duración. Se estudió el efecto de OX utilizando 2 dosis: 650 y 750 mg/kg, así como el del pentobarbital a una dosis de 40 mg/kg y de la lidocaína, 50 mg/kg como drogas de referencia.

Resultados

Prueba de Irwin. Esta prueba puso de manifiesto un perfil de acción neurofarmacológica de OX dependiente de la dosis, con diferentes alteraciones conductuales. Las dosis por encima de 300 mg/kg produjeron primeramente cierto grado de excitación, seguido de una notoria reducción de la actividad motora. La dosis de 400 mg/kg produjo un estado de estupor y somnolencia, reflejada en una pérdida marcada de la actividad motora, con ptosis parpebral, disminución de la respuesta de alerta, con una notable insensibilidad a estímulos táctiles dolorosos e hipotermia. Dosis de 600 y 700 mg/kg provocaron pérdida de los reflejos posturales, que incluyen el reflejo de enderezamiento, con disminución marcada del tono muscular y de los movimientos respiratorios. Con dosis de 800 mg/kg se produjo total inmovilidad, paro respiratorio y muerte, lo que permitió calcular las dosis letales con sus respectivos límites (tabla I).

TABLA 1. Dosis efectivas analgésicas (prueba de irritación peritoneal por ácido acético) y letales de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetil-2-oxazolina

Dosis (mg/kg)	10	50	90
Efectivas	23,07 (15,92-33,43)	37,38 (28,33-49,32)	60,57 (41,80-87,78)
Letales	790,84 (764,55-818.04)	829,64 (809,75-850,02)	870,34 (841,40-900,27)

Los números entre paréntesis representan los límites de confianza.

Irritación peritoneal por ácido acético. OX redujo el número de contorsiones inducidas por ácido acético, efecto que fue dependiente de la dosis empleada (fig. 1).

El asterisco indica diferencia estadísticamente significativa con respecto al control (p<0,05), según prueba U de Mann-Withney.
FIG. 1. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetiloxazolina sobre las contorsiones inducidas por la administración ip de ácido acético 0,8 %.

A partir de estos resultados se pudo calcular las dosis efectivas para la analgesia periférica (DE 10, DE50 y DE90) con sus respectivos límites (tabla 1). Con estos datos y los de las dosis letales, se calcularon los índices terapéuticos IT50 e IT10, cuyos valores fueron: IT50= 22,2 e IT10=37,7.

Analgesia plantal. La 2-fenil-4,4-bis-hidroximetil-2-oxazolina mostró un efecto analgésico dependiente de la dosis en el plato caliente (fig. 2). A las dosis empleadas, los animales no mostraron otros efectos conductuales de interés.

Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas: un asterisco p<0,01 y dos asteriscos p<0,001, según prueba de Wilcoxon para muestras pareadas.
FIG. 2. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetiloxazolina sobre el tiempo de reacción en la prueba del plato caliente.

Medida del potencial de acción neuromuscular compuesto. Dosis de 650 y 750 mg/kg de OX redujeron la amplitud del potencial neuromuscular (fig. 3), con una disminución de la velocidad de conducción (tabla 2).

FIG. 3. Efecto de la administración sistémica de: a) pentobarbital 40 mg/kg; b) lidocaína 50 mg/kg; c) 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina (OX) 650 mg/kg; d) 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina (OX) 750 mg/kg.

TABLA 2. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetil-2-oxazolina (OX) y otras drogas de referencia sobre la velocidad de conducción del potencial de acción muscular compuesto (PAMC) en el ratón

Drogas	Dosis (mg/kg)	n	Reducción de la velocidad de conducción del PAMC (%)
Pentobarbital	40	3	0
Lidocaína	50	3	30,1
OX	650	3	1,3
OX	750	3	25

Discusión

En la prueba de Irwin, la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina (OX) mostró un efecto depresor del sistema nervioso, sobre todo por la ostensible inhibición de la actividad motora y del tono muscular, con bloqueo total de los reflejos posturales, de la respuesta a la manipulación general y a los estímulos táctiles y nociceptivos. Sin embargo, llamó la atención que estos efectos se acompañaron de movimientos de la cabeza, los ojos y la vibrisas. A dosis letales, la muerte sobrevino por reducción progresiva de los movimientos respiratorios. La ausencia de ataxia previa a la parálisis sugirió descartar una acción anestésica general, así como una acción de tipo benzodiacepínica.9

Ante los efectos hasta aquí discutidos de OX, fue obligada la exploración de una posible actividad analgésica (central o periférica), con el empleo de dosis más bajas. Es conocido que drogas con efectos depresores a nivel del sistema nervioso central, presentan respuestas diferentes frente a estímulos dolorosos. Debido a esto las pruebas de analgesia en compuestos potencialmente depresores o sedantes del sistema nervioso central son obligadas para poder clasificarlos dentro de un tipo u otro de sedante.10

Los experimentos de las pruebas de analgesia (irritación peritoneal por ácido acético y plato caliente) demostraron una acción analgésica para OX. La prueba de irritación peritoneal por ácido acético es sensible tanto para los analgésicos de tipo central como para los periféricos. Sin embargo, la prueba del plato caliente es más sensible a los analgésicos de tipo central, como los opiáceos. Para el caso de OX, su acción analgésica no puede ser atribuible a una acción sobre receptores opiáceos, pues a las dosis ensayadas no aparece en los animales las manifestaciones típicas de los opiáceos, como es la cola de Straub.11

En el caso de la prueba del ácido acético, las dosis de OX fueron considerablemente más bajas que las efectivas en el plato caliente, lo que nos permite sugerir que la inhibición de las contorsiones puede ser debido a una acción analgésica de carácter periférico. La potente acción analgésica en la prueba del ácido acético, en dosis que no exhibieron ningún efecto conductual en la prueba de Irwin, y el efecto paralizante de las dosis altas, hicieron pensar en una acción anestésica local. El efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetil-2-oxazolina sobre el potencial de acción neuromuscular no parece ser debido a una acción bloqueadora de la placa neuromuscular, tal como ocurre con la d-tubocurarina y la succinil-colina, ya que en el caso de estos fármacos el bloqueo de las extremidades suele acompañarse -en la experimentación animal- de un bloqueo de igual intensidad en los músculos respiratorios, y sería prácticamente imposible realizar un registro sin previa canulación de la tráquea y asistencia respiratoria. Además, la acción paralizante de los anestésicos locales no solo suele involucrar los nervios motores, sino todas las aferencias provenientes de los receptores sensoriales, tanto táctiles como propioceptivos. Por tanto, el mecanismo de acción responsable de la muerte de los animales puede atribuirse a la acción anestésica local expresada a nivel sistémico, debido a las altas dosis empleadas.

Summary

Some aryl-oxazolines have been described as active substances on the central nervous system with diverse effects and applications as depressants, anesthetics, anticonvulsants, etc. In the present paper, the primary neuropharmacological characterization of 2-phenyl-4, 4-bis-(hydroxymethyl)-2-oxazoline, obtained by a method of synthesis under microwaves irradiation as an energy source, was made. The application of Irwin's test showed that this compound has a depressive effect on the central nervous system, with a marked inhibition of the motor activity and muscular tone and with loss of postural reflexes. At moderate doses, these effects were accompanied with signs of central excitation. These characteristics suggested an action of peripheral type, confirmed by the blocking effect of the contorsions in the peritoneal irritation test caused by acetic acid 0.8 % and the reduction of the potential amplitude of the composed neuromuscular action during the supramaximal stimulation of the cyatic nerve, tests that evidenced a local anesthetic action for 2-phenyl-4, 4-bis-(hydroxymethyl)-2-oxazoline.

Key words: 2-phenyl-4, 4-bis-(hydroxymethyl)-2-oxazoline, local anesthesia, composed muscular action potential (CMAP)

Referencias bibliográficas

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3. García-Tellado F, Loupy A, Petit A, Marrero-Terrero AL. Solvent free microwave assisted efficient synthesis of 4, 4-disubstituted 2-oxazolines. Eur J Org Chem 2003;3:34387-91.

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8. Robert J, Brian B, Palmer T. Neurotransmisión. Sistemas nerviosos autónomo y motor somático. En: Goodman A, Goodman L, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 9ed. México, DF: Ed. Graw- Hill Interamericana; 1996. p.113-48.

9. Guidotti A. Mecanismos sinápticos en la acción de las benzodiacepinas. En: Lipton MA, DiMascio A, Killam KF, eds. Psicofarmacología. Científico-Técnica; 1982. p.1505-14.

10. Hobbs WR, Rall TW, Verdoom TA. Hipnóticos y sedantes, etanol: En: Goodman A, Goodman L, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 9ed. México, DF: Ed. Graw-Hill Interamericana; 1996. p.385-422.

11. Goldstein A. Receptores opiáceos y péptidos opioides: revisión general de 10 años. En: Lipton MA, DiMascio A, Killam KF, eds. Psicofarmacología (a los 30 años de progreso). La Habana: Editorial Científico-Técnica; 1982:1729-35.

Recibido: 14 de mayo de 2004. Aprobado: 14 de junio de 2004.
MSc. Milena Díaz Molina. Instituto de Farmacia y Alimentos. San Lázaro y L, El Vedado, municipio Plaza de Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Máster en Ciencia Química Farmacéutica. Profesora Asistente
2 Doctor en Ciencias. Investigador Titular.
3 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Asistente