Instituto de Farmacia y Alimentos
Universidad de la Habana

Bloqueo de las crisis audiogénicas y del choque electroconvulsivo por la 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina

Milena Díaz Molina,1 Héctor Pérez Saad,2 Nora Sánchez Rodríguez3 y Margarita Bu Wong3

Resumen

Algunas aril-oxazolinas han sido descritas como sustancias activas sobre el sistema nervioso central, con efectos y aplicaciones diversas como depresoras, anestésicos, anticonvulsivos, etc. El presente trabajo se trazó como objetivo fundamental estudiar el posible efecto de la 2-fenil-4,4-bis (hidroximetil)-2-oxazolina (OX) obtenida por síntesis química bajo microondas, en 2 modelos experimentales de epilepsia: el choque electroconvulsivo por estimulación repetitiva en ratones y el de inducción de crisis convulsiva por estímulo audiogénico en el gerbo mongol. La dosis de 150 mg/kg de OX redujo el número de pulsos eléctricos necesarios para inducir la crisis tónica producida por el choque eléctrico, así como su duración. Esta misma dosis bloqueó las crisis inducidas por el estímulo audiogénico en el gerbo, y disminuyó significativamente su severidad (grados de crisis) y ocurrencia. Estos resultados permiten afirmar que OX presenta un efecto antiepiléptico relacionado posiblemente con una inhibición de la sinapsis glutamatérgica en el hipocampo.

Palabras clave: Anticonvulsivante, crisis audiogénica, choque electroconvulsivo, 2-oxazolinas.

Algunos compuestos de la familia de las 2-oxazolinas han demostrado poseer actividad sobre el sistema nervioso central, con posibilidades de aplicación farmacológica como antidepresivos, relajantes musculares, ansiolíticos, hipnóticos, antiepilépticos etcétera.1-3

Desde hace más de una década, se desarrollan métodos de síntesis química que utilizan la activación bajo microondas como fuente energética, en ausencia de disolventes, con altos rendimientos y elevada pureza de los productos. Por esta vía se obtienen gran cantidad de compuestos orgánicos, entre los cuales se encuentran alquil- y aril- oxazolinas.4, 5

Teniendo en cuenta el permanente interés por encontrar compuestos antiepilépticos cada vez más eficaces y selectivos, las ventajas en cuanto al método de síntesis utilizado y los antecedentes de actividad antiepiléptica de algunas aril-oxazolinas, el presente trabajo se propuso como objetivo principal evaluar el posible efecto anticonvulsivante de la 2-fenil-4,4-bis(hidroximetil)-2-oxazolina (OX), mediante la utilizaión de 2 modelos de epilepsia experimental.

Métodos

Drogas utilizadas. La preparación de la solución de 2-fenil-4,4-bis-(hidroximetil)-2-oxazolina (OX) se realizó con ácido tartárico al 0,3 % en solución salina fisiológica. El diazepam, utilizado como control positivo, se preparó a partir de concentraciones conocidas de ámpulas producidas por la Industria MédicoFarmacéutica (IMEFA), Cuba.

Los fármacos fueron administrados por vía intraperitoneal 1 h antes de la inducción de las crisis. Los controles recibieron solución salina fisiológica con ácido tartárico al 0,3 %. En todos los casos se administró un volumen de 0,01 mL/g de peso corporal.

Animales. Se emplearon ratones de la cepa OF1 y gerbos mongoles (Meriones unguiculatus) con pesos corporales de 26 a 30 g y de 60 a 80 g, respectivamente, los que fueron adaptados al laboratorio y mantenidos durante 15 días antes del experimento en condiciones de ciclo luz-oscuridad 12/12 h, a temperatura de 25 oC, con comida y agua ad libitum.

Choque electroconvulsivo.6, 7 Se emplearon 3 grupos de 12 animales cada uno: 1) control, 2) tratados con diazepam (1 mg/kg) y 3) tratado con OX (150 mg/kg). La inducción de la convulsión tónica se realizó por la estimulación eléctrica repetitiva de pulsos cuadrados, con el empleo de electrodos de pinzas colocados en el pabellón auricular del ratón. Los parámetros de estimulación utilizados fueron: frecuencia de 7 Hz, duración del pulso de 1 ms, intensidad de 100 mA y un máximo de 100 pulsos. La estimulación se mantuvo hasta el momento de la flexión del tren posterior previo a la convulsión tónica, y quedó registrado en el equipo (NEUROCID 4M) el número de estímulos requeridos. La duración de la extensión tónica de las patas traseras se midió con un cronómetro manual. Para la comparación estadística se asignó el valor de 100 pulsos a los animales que no tuvieron convulsión tónica.

Crisis audiogénica.6 Se utilizaron 3 grupos de 17 animales cada uno: 1) control, 2) tratados con diazepam (1 mg/kg) y 3) tratado con OX (150 mg/kg). La inducción de las crisis se efectuó en una cámara de estimulación auditiva con un emisor de sonido de 200 Hz y 100 dB durante 20 seg. La severidad de las crisis se estimó según el método descrito por Loskota.8

Métodos estadísticos empleados. Para el procesamiento estadístico de los resultados se emplearon los programas Statgraphic y Statistica para Window, versión 5.5. En la comparación de los grupos en ambos modelos de epilepsia se realizó utilizando la prueba U de Mann-Whitney como método no paramétrico. Para determinar las diferencias entre los estados de crisis inducidas por estímulo auditivo en el gerbo mongol, se empleó la prueba de la probabilidad exacta de Ficher.

Resultados

Choque electroconvulsivo. La dosis de 150 mg/kg de OX bloqueó las crisis inducidas por el choque electroconvulsivo en ratones, con un aumento significativo del número de estímulos necesarios para la ocurrencia de la convulsión tónica y una disminución altamente significativa de su duración (fig. 1).

A) Número de estímulos necesarios para la inducción de la convulsión tónica; B) Tiempo de duración de la extensión de las patas traseras. * p<0,05 y ** p<0,01, de acuerdo a la prueba U de Mann-Whitney.
FG. 1. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetiloxazolina (OX) (150 mg/kg) en la inducción de crisis epilépticas por choques electroconvulsivos en ratones.

Crisis audiogénica. La dosis de 150 mg/kg bloqueó las crisis inducidas por estímulos auditivos en el gerbo (fig. 2), tanto en severidad (grados de crisis) como en la ocurrencia de estas. La prueba de la probabilidad exacta de Ficher mostró diferencias significativas de OX y diazepam con respecto al control para los estados de crisis 1, 2 y 3.

Grado 0, ausencia de crisis; grado 1, desplazamientos normales y mioclonías de orejas y vibrisas; grado 2, inmovilidad y mioclonías de orejas y vibrisas; grado 3, sacudidas mioclónicas de las extremidades; grado 4, crisis convulsivas tónico-clónicas; grado 5, crisis generalizadas con caídas y volteretas; grado 6, crisis y muerte del animal.
FIG. 2. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetiloxazolina (150 mg/kg) sobre la frecuencia de grados de crisis audiogénicas en el gerbo mongol. Efecto de la 2-fenil-4,4-bis-hidroximetil-2-oxazolina (OX) (150 mg/kg) y diazepam (1 mg/kg) en la intensidad y frecuencia de las crisis.

Discusión

Para predecir las potencialidades terapéuticas de nuevos fármacos antiepilépticos, es imprescindible la utilización de modelos animales que se asemejen lo más posible a las crisis que ocurren en los humanos. Los modelos aquí empleados han sido utilizados ampliamente para estos fines, conjuntamente con otros estudios de tipo conductuales y electrofisiológicos.9

Los resultados obtenidos en este estudio ponen de manifiesto una actividad antiepiléptica para OX, tanto en el choque electroconvulsivo en el ratón como en el modelo de epilepsia genética del gerbo mongol. El gerbo mongol, animal genéticamente epiléptico, desarrolla crisis espontáneas y presenta además un bajo umbral convulsivo frente a diferentes estímulos externos medioambientales. Las crisis audiogénicas en el gerbo han sido relacionadas con un incremento en la actividad de neurotransmisores excitatorios, principalmente glutamato y aspartato.10 Este tipo de neurotransmisión excitatoria es considerado hoy en día como uno de los mecanismos más involucrados en el fenómeno epileptogénico.11

Llama la atención que la dosis utilizada de OX en las pruebas realizadas, es muy superior a la del diazepam. Sin embargo, esto no excluye su potencialidad como futuro fármaco antiepiléptico, ya que esta no depende solo del valor absoluto de la dosis, sino de su relación con la dosis tóxica o con las que producen sedación y/o somnolencia, efectos adversos que constituyen algunos de los inconvenientes de la mayoría de los fármacos antiepilépticos.12 En estudios preliminares realizados por nuestro laboratorio, OX no manifestó un efecto depresor, sedante o hipnótico per se.13 El diazepam, por otra parte, aunque es un buen control positivo en relación con los modelos de convulsiones, desde el punto de vista terapéutico no es el fármaco antiepiléptico más idóneo como referencia.14

Los resultados obtenidos en el presente trabajo permiten concluir que la dosis de 150 mg/kg de OX presenta un efecto antiepiléptico, manifestado en 2 modelos de epilepsia experimental. Dicho resultado, conjuntamente con la ausencia de efecto sedante a esta dosis, sugiere la necesidad de profundizar en la caracterización de este efecto neurofarmacológico.

Paralelamente, se hace necesario continuar trabajando en la caracterización neurofarmacológica de OX, haciendo énfasis en el estudio de sus efectos conductuales y tóxicos, así como en la determinación de su índice terapéutico.

Summary

Some aryl-oxazolines have been described as active substances on the central nervous system, with diverse effects and applications as depressants, anesthetics, anticonvulsants, etc. The purpose of the present paper is to study the possible effect of 2-phenyl-4,4-bis (hydroxymethyl)-2-oxazoline (OX) obtained by chemical synthesis under microwaves in 2 experimental models of epilepsy: the electroconvulsive shock by repetitive stimulation in mice and that of induction of convulsive seizures by audiogenic stimulus in gerbo mongol. The dose of 150 mg/kg of OX reduced the number of electric pulses, as well as its duration. This same dose blocked the seizures induced by audiogenic stimulus in gerbo and significantly reduced its severity (seizure degrees) and occurrence. These reults allow to assert that OX present an antiepilectic effect possibly related to an inhibition of glutamatergic synapse in the hippocampus.

Key words: Anticonvulsant; audiogenic crisis; electroconvulsive shock; 2-oxazolines.

Referencias bibliográficas

1. Bosc JJ, Forfar I, Jarry C, Laguerre M, Carpy A. 2-Amino-2-oxazolines. VII. Influence of structural parameters on the antidepressant activity of 5-(1-aryl-4-piperazino) methyl-2-amino-2-oxazolines. Arch Pharm 1994;327:187.

2. Goodman LS, Grewal M, Brown WC, Swinyard EA. Comparison of maximal seizure evoked by pentylenetetrazol (metrazol) and electroshock in mice and their modification by anticonvulsant. J Pharm Exp Ther 1953;108:168-76.

3. Ito M, Miyajima T, Fujii T, Okuno T. Cloxazolam treatment for patient with intractable epilepsy. Pediatr Neurol 2004;2:111-4.

4. Marrero-Terrero AL. Synthesis of 2-oxazoline from carboxilic acid and , , - tris (hydroximethyl) methylamine under microwaves condition. Synlett 1996;3:245-6.

5. García-Tellado F, Loupy A, Petit A, Marrero-Terrero A L. Solvent free Microwave assisted efficient synthesis of 4,4-disubstituted 2-oxazolines. Eur J Org Chem 2003;3:4387-91.

6. Pérez de Alejo J, Miranda R, Rodríguez G. Actividad anticonvulsivante (antiepiléptica) del extracto fluido de Indigofera suffructicosa (añil cimarrón). Rev Cubana Plant Med 1996;1(2):7-10.

7. Chopade R, Bahekar R, Khedekar P, Bhusari K, Raghu A. Synthesis and Anticonvulsant Activity of 3-(6-Substituted-benzothiazol-2-yl)-6-phenyl-[1, 3]-xazinane-2-thiones. Archiv Pharmazie 2002;8:381-8.

8. Loskota W J, Lomas P. The Mongolian Gerbil (M. Unguiculatus) as a model for the study of the epilepsies. EEG records of seizures. Electroenceph Clin Neurophysiol 1975;38:597-604.

9. Kupferberg H. Animal models used in the screening of antiepileptic drugs. Epilepsy 2001;42(4):1528-57.

10. Pittaluga A, Raiteri M. N-methyl-D-aspartic acid (NMDA) and non-NMDA receptors regulating hippocampal norepinephrine release. Location on axon terminals and pharmacological characterization. J Pharmacol Exp Ther 1992;260:232.

11. Matthew E, Barton S, Peters C, Harlan E. Comparison of the effect of glutamate receptor modulators in the 6 Hz and maximal electroshock seizure models. Epilepsy Res 2003;56:17-26.

12. Ramsay RE, Rowan AJ, Pryor FM. Special considerations in treating the elderly patients with epilepsy. Neurology 2004;62(5):24-9.

13. Díaz M, Pérez-Saad H, Sánchez N, Bu M, Umpierrez S. Síntesis y evaluación neurofarmacológica de compuestos de la familia de las 2-oxazolinas obtenidas bajo irradiación de microondas. IV Encuentro Iberoamericano sobre las Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias. Libro Resumen. La Habana: Ed. Ciencias Médicas; 2000.

14. Rall T, Scheilfer L. Drogas efectivas en el tratamiento de la epilepsia. En: Goodman A, Goodman L, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 9 ed. México, DF: Ed. Graw- Hill Interamericana; 1996. p.449-74.

Recibido: 21 de junio de 2004. Aprobado: 25 de junio de 2004.
MSc. Milena Díaz Molina. Instituto de Farmacia y Alimentos. San Lázaro y L, El Vedado, municipio Plaza de La Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

1Master en Ciencia Química Farmacéutica. Profesora Asistente.
2Doctor en Ciencias. Investigador Titular.
3Licenciada en Bioquímica. Investigadora Asistente.