Pontificia Universidad Javeriana

Metodología para la validación del llenado aséptico en un proceso de liofilización

Cindy Marlene Fernández López,1 Diana Marcela Moreno Mora,1 Janeth Arias Palacios2 y José Manuel Granados3

Resumen

Se presentó la metodología propuesta para la validación de un llenado aséptico en un proceso de liofilización. Para esto se realizaron 3 pruebas en las cuales se envasaron 3 lotes de 15 000 viales cada uno, con caldo casoy que se incubaron a 22,5 ± 2,5 ºC y 32,5 ± 2,5 ºC por 14 días respectivamente, con el fin de detectar la posibilidad de contaminación microbiana en la realización del proceso. Durante las 3 pruebas se realizó el monitoreo microbiológico de ambientes, superficies y operarios; en el muestreo se utilizó Petrifilm para detección de mesófilos aerobios y levaduras, procedimiento ejecutado en condiciones de reposo y operación. Así mismo, se efectuó el conteo de partículas en el área y pruebas de esterilidad para los materiales de envase (tapones y viales); finalmente, se diseñó la metodología de validación para la esterilización del liofilizador y se empleó como microorganismo indicador a Bacillus stearothermophilus. El diseño de la prueba se realizó teniendo en cuenta las recomendaciones de la Food Drug Administration (FDA) y la Organización Mundial de la Salud (OMS) para productos de administración parenteral. Estas son las organizaciones de referencia para la producción y control de calidad que utiliza la empresa de productos veterinarios en las que se hizo la prueba. Los viales envasados se leyeron por turbidez (presencia de contaminación) y los criterios de aceptación se establecieron por las 2 entidades nombradas anteriormente. Finalmente, se indicó un plan de monitoreo microbiológico para el área evaluada en el cual se incluyeron puntos de muestreo estratégicos; así como la realización de procedimientos operativos estándar específicos para esta área.

Palabras clave: Validación, envase aséptico, Food Drug Administration (FDA), Organización Mundial de la Salud (OMS), Bacillus stearothermophilus.

Dentro del concepto de garantía de la calidad, las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) constituyen el factor que asegura que los productos se fabriquen en forma uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos, y conforme a las condiciones exigidas para su comercialización. Las reglamentaciones que rigen las BPM tienen por objeto principal disminuir los riesgos inherentes a toda producción farmacéutica que no pueden prevenirse completamente mediante el control definitivo de los productos. Esencialmente, tales riesgos son de dos tipos: contaminación cruzada y confusiones.

Así, la buena calidad se debe construir desde adentro, durante el proceso de fabricación; pues las pruebas de control de calidad de los productos después de que se hayan fabricado no son suficiente garantía. Las BPM's previenen los errores que no se pueden detectar por el control de calidad del producto terminado. Sin BPM's es imposible asegurar que cada unidad de un lote de medicamento posea la misma calidad que la encontrada en las muestras ensayadas en el Laboratorio de Control de Calidad.

Ahora bien, la fabricación de productos estériles es realizada conforme a requisitos especiales para reducir al mínimo los riesgos de contaminación microbiológica, contaminación por partículas y contaminación por pirógenos; y depende no solo del diseño y construcción de las instalaciones o facilidades físicas, sino de los sistemas de apoyo crítico y de la habilidad, entrenamiento y actitudes del personal implicado. La garantía de calidad se vuelve un factor de importancia preponderante, porque este tipo de fabricación sigue métodos de preparación y procedimientos cuidadosamente establecidos y validados.

Así pues, uno de los procesos más complejos de la industria farmacéutica es la producción de medicamentos estériles por procesos asépticos. La gran mayoría de este tipo de medicamentos es de administración parenteral, lo cual los clasifica dentro del grupo de tecnologías especializadas de la producción farmacéutica. Sin embargo, dentro de esta clasificación, hay algunos medicamentos en los que se utiliza una tecnología de producción mucho más compleja, debido a los riesgos de manufactura al que es sometido el producto por una etapa adicional de fabricación intermedia denominada: liofilización.

Por lo tanto, es de vital importancia validar los procesos que se realizan en un área de producción y envase; es decir, establecer una prueba que se pueda utilizar como un método de la determinación de la probabilidad de contaminación microbiana en un proceso aséptico.

En este caso, se realizó la validación del llenado aséptico en un liofilizador adquirido recientemente por la empresa, teniendo en cuenta que es necesario establecer y asegurar la esterilidad del proceso, antes de iniciar la producción de vacunas, propósito para el cual ha sido diseñada esta máquina.

De hecho, uno de los mejores indicadores para demostrar que este proceso se lleve a cabo bajo condiciones estériles, es la realización de la validación de llenado aséptico, proceso que permite determinar la probabilidad de alcanzar la esterilidad bajo condiciones normales de manufactura. Este proceso se ejecutó en diferentes etapas: 1. Validación de la esterilización del liofilizador, mediante el uso de Bacillus stearothermophilus como microorganismo indicador. 2. Calificación del estado microbiológico del proceso mediante la simulación de un envase aséptico con medio casoy, el cual se realizó por triplicado según USP XXVIII.1 3. Control microbiológico y particulado del área durante los envases asépticos mediante la cuantificación de microorganismos viables, en ambientes, superficies y equipos; así como del personal en el área.

Después de haber realizado el llenado aséptico se espera que esta prueba permita reproducir y sistematizar el proceso de llenado, ya que este método requiere un alto nivel de exigencia en el proceso, lo que conllevaría a la obtención de un producto estéril que cumpla todas especificaciones (dentro de las cuales se encuentra FDA, BPM, ICA, INVIMA, y demás normas que apliquen al producto terminado).

Métodos

A) Envase aséptico

• Para la realización del envase aséptico se tuvo en cuenta el cumplimiento de algunos prerrequisitos sin los cuales no se pudo dar inicio al proceso de validación del llenado aséptico. Dichos prerrequisitos fueron realizados por el Área de Ingeniería de la Empresa de Productos Veterinarios, entre ellos, se encuentran:

  • Validación del horno, utilizado para la esterilización de los viales.
  • Validación de autoclave, utilizado para la esterilización de uniformes, mangueras y demás elementos que se necesiten en el área de envase.
  • Prueba de integridad de filtros usados.
  • Calificación del sistema de ventilación del área, de la instalación del liofilizador (CI) y de Operación (CO) del liofilizador.
• Alistamiento del material
  Antes de iniciar el proceso de envase (aproximadamente 5 días antes) los 15 000 viales (por envase) fueron llevados a esterilizar junto con los tapones, agrafes, uniformes y demás elementos utilizados, a cargo del Departamento de Producción.
  Se utilizaron viales de vidrio tipo II con una capacidad de 15 mL; el volumen de llenado fue de 3,1 mL y los tapones empleados de color gris referencia 4406.
  Así mismo, 15 días antes de la realización de la prueba se prepararon 240 L de caldo casoy,2 volumen necesario para llenar los viales. Después de preparado el medio de cultivo, este fue esterilizado por la técnica de filtración por membrana 0,22 µm. Posteriormente, el medio de cultivo se llevó a autocontrol por 14 días 32,5 ± 2,5 ºC , para verificar su esterilidad, a cargo del Departamento de Producción. De igual manera se realizó la preparación del agar Plate Count 2 utilizado para el muestreo de ambientes, este medio también fue dejado en autocontrol por 14 días 32,5 ± 2,5 ºC . Cinco días antes del inicio del envase, se realizó el alistamiento y la preparación del caldo letheen y de los Petrifilm de mesófilos,3 hongos-levaduras,4 los cuales fueron colocados en autocontrol a 32,5 ± 2,5 ºC.
• Realización del envase
  En el inicio del proceso de validación del llenado aséptico, se realizó un monitoreo. Este muestreo se realizó después de que el equipo fue esterilizado con peróxido de hidrógeno; sanitizante sugerido por el fabricante y antes de iniciar al envase aséptico.

Asimismo, se muestrearon los puntos más importantes de la envasadora (cuadros 1 y 2) y el área, “en reposo” y “en operación”.

Cuadro 1. Puntos de muestreo para la validación en el área de liofilizador Criofarma

Número		Punto a muestrear
Petrifilm AC Y YM
1	Formato
2	Banda trasportadora
3	Debajo banda trasportadora
4	Bordes de las ventanas
5	Vidrio izquierdo (agujas)
6	Vidrio frente
7	Vidrio derecho (taponadora)
8	Vidrio por dentro (puertas)
9	Tolva tapones
10	Tornamesa de entrada
11	Tornamesa de salida
12	Cortinas a lado de controles de liofilizador
13	Cortinas tornamesa de entrada
14	Cortinas a lado de la ventana
15	Piso flujo laminar
16	Ventana 1
17	Ventana 2
18	Piso ventanas exterior
19	Vidrio junto a controles del liofilizador
20	Pared a lado de los controles del liofilizador
21	Piso a lado controles del liofilizador
Hisopos
22	Manijas
23	Agujas
24	Taponadora
25	Suministro aire piso
26	Extracción a lado de la pared 1
27	Extracción aire 2
28	Suministro aire columna
29	Extracción aire junto a controles del liofilizador 1
30	Extracción aire junto a controles del liofilizador 2

Cuadro 2. Puntos de muestreo para el monitoreo de validación del liofilizador Criofarma

Número	Punto a muestrear
1A	Bandeja 1A
2A	Bandeja 2A
1B	Bandeja 1B
2B	Bandeja 2B
1C	Bandeja 1C
2C	Bandeja 2C
1D	Bandeja 1D
2D	Bandeja 2D
1E	Bandeja 1E
2E	Bandeja 2E
1F	Bandeja 1F
2F	Bandeja 2F
1G	Bandeja 1G
2G	Bandeja 2G
1H	Bandeja 1H
2H	Bandeja 2H
3	Círculo fondo
4	Detector de humedad
5	Área fondo
6	Techo abajo
7	Techo arriba
8	Izquierda arriba
9	Izquierda abajo
10	Manguera izquierda
11	Derecha arriba
12	Derecha abajo
13	Manguera derecha
14	Puerta arriba (interior)
15	Puerta abajo (interior)
16	Círculos puerta (interior)
17	Manija.
18	Visagra 1
19	Visagra 2
20	Marco derecha
21	Marco izquierda
22	Marco izquierda
23	Puerta arriba (exterior)
24	Puerta abajo (exterior)
25	Círculo puerta (exterior)
	Muestras tomadas con hisopo

Ahora bien, en condiciones de operación se envasaron 15 000 viales (por lote) con 3,1 mL de caldo casoy, los cuales fueron sellados con tapones de caucho y agrafes de aluminio. Al inicio y al final del envase se tomaron 1 500 viales (en total 3 000), los cuales fueron tapados y sellados con agrafe inmediatamente después de ser llenados. Por otra parte, los 12 000 viales restantes fueron sometidos a la simulación del proceso de liofilización.

Es decir, una vez llenos los viales, el liofilizador fue cargado haciendo un recorrido desde la tornamesa de salida hasta colocar las bandejas dentro de la cámara de liofilización, este recorrido se realiza a través de un módulo de filtración clase 100. Una vez el liofilizador se carga totalmente, los viales parcialmente taponados fueron expuestos al ambiente por el tiempo que dura un ciclo en condiciones verdaderas de liofilización; es decir, 21 h aproximadamente. No se realizaron los ciclos de congelación ni el ciclo de secado porque podría afectar el eventual crecimiento de microorganismos aerobios. Completado este intervalo de tiempo, los viales fueron envasados y grafados, llevándolos luego a incubar a 32,5 ± 2,5 ºC y a 22,5 ± 2,5 ºC , por 14 días a cada temperatura, iniciando con la de 22,5 ± 2,5 ºC según OMS5 y FDA.6 Después de terminar la simulación se realizó el muestreo de superficies dentro del liofilizador, para comprobar la calidad microbiológica de este después del tiempo de operación.

Luego de cumplido este tiempo de incubación, los viales fueron analizados por turbidez (fig.1), en donde se descartaron aquellos que presentaron daños físicos. Los resultados fueron registrados en el formato de inspección de envases.

Fig . 1. Lectura de viales por turbidez.

A los viales que presentaron contaminación se les realizaron las pruebas siguientes:

• Coloración de Gram.
• Aislamiento en agar TSA (4 cajas); incubando 2 cajas a 32,5 ± 2,5 ºC por 48 h y las 2 restantes a 20,5 ± 2,5 ºC durante 5 días.
• Solicitud de identificación de los microorganismos contaminantes en un laboratorio de referencia.

Después de realizadas estas pruebas se estableció el género y especie de los microorganismos contaminantes, y se determinó las posibles causas de dicha contaminación.

• Muestreo de ambientes

Para realizar el muestreo de aire, se utilizó el muestreador de aire MAS-100, el cual se programó para muestrear un volumen determinado de acuerdo con el área. El volumen de aire a muestrear, se determinó teniendo en cuenta la fórmula siguiente:

VOLUMEN (m3) = Largo x Alto x Ancho

Finalmente, se establecieron 5 puntos de muestreo de ambientes en el área de envase.
Para este monitoreo se utilizaron cajas de Petri desechables de 90 mm con agar Plate Count; procedimiento que se realizó por duplicado para mesófilos y hongos-levaduras.

El procedimiento para cada punto de muestreo fue el siguiente:

1. Se desinfectó el equipo empleado utilizando una gasa impregnada con alcohol etílico comercial al 70 %; procedimiento realizado antes de entrar a la zona estéril.
2. Ya calculado el volumen a muestrear se limpió la cabeza y succionador de aire con alcohol etílico comercial al 70 %.
3. Se ubicó el muestreador de aire en una superficie plana y se programó el volumen a muestrear siguiendo las indicaciones del tablero de control.
4. Se retiró la cabeza del equipo y se colocó una caja de Petri de 90 mm con agar Plate Count, luego se ajustó de nuevo la cabeza.
5. El muestreo se inició recorriendo toda el área (dependiendo el punto de muestreo) sin realizar movimientos bruscos.
6. Una vez terminado de muestrear el volumen total, se procedió a quitar la cabeza y a remover la caja de Petri tapándola inmediatamente. Este procedimiento se realizó por duplicado para cada área (1 caja para mesófilos y 1 caja para hongos-levaduras).
7. Se incubaron las cajas muestreadas a 2 temperaturas diferentes:

• Mesófilos: temperatura de 32,5 ± 2,5 ºC por 48 h.
• Hongos-levaduras: temperatura de 22,5 ± 2,5 º C por 5 días.

Cumplido el tiempo de incubación se realizó el recuento en un contador de colonias, resultado obtenido en UFC/m3, teniendo en cuanta la lectura para mesófilos u hongos-levaduras respectivamente.

• Muestreo de superficies

Para el muestreo de superficies se establecieron puntos de muestreo tanto en el área 100 como en el área 10 000, dichos puntos fueron muestreados mediante el uso de Petrifilm.

Una vez reconstituidos se procedió a realizar el muestreo de superficies de la manera siguiente:

1. Para mesófilos: se levantó la película superior (la cual tiene el medio letheen) y se colocó en contacto con la superficie a muestrear presionando suavemente, luego se colocó esta película en contacto con la placa. Se llevó a incubar a 32,5 ± 25 °C por 48 h. Posteriormente se realizó la lectura en un contador de colonias y se informó UFC/placa (fig.2).
2. Para hongos-levaduras: se levantó la película superior (la cual tiene el medio letheen) y se coloco en contacto con la superficie a muestrear presionando suavemente, luego se colocó esta película en contacto con la placa. Se llevó a incubar a 20 °C ± 2 por 5 días. Posteriormente se realizó la lectura en un contador de colonias y se informó UFC/placa.

Fig. 2. Muestreo de superficies con Petrifilm.

Para el muestreo de algunos puntos como: las agujas llenadoras, la máquina taponadora, los suministros y las extracciones de aire, se emplearon 2 hisopos Quick Swab (3M), (debido a que no es posible muestrear estos puntos con Petrifilm) de la manera siguiente:

• Muestreo de operarios

Se muestrearon los guantes de los operarios que se encontraban trabajando en el área de envase aséptico. Teniendo en cuenta los parámetros mencionados anteriormente.

Para ello se empleó Petrifilm de mesófilos y hongos-levaduras con los cuales se realizó muestreo en la palma de las manos, especialmente en las huellas dactilares. Después de realizado este procedimiento, se desinfectaron los guantes de los operarios con alcohol etílico comercial al 70 %.

Cumplido el tiempo de incubación, se realizó el recuento y se informó en UFC/placa si son mesófilos u hongos-levaduras respectivamente.

Asimismo, se realizó el muestreo del uniforme de los operarios, para lo cual también se emplearon Petrifilm (mesófilos y hongos-levaduras) después de haber sido reconstituidos; y se muestrearon las mangas (derecha e izquierda), el pecho de los uniformes, tapabocas y las polainas de los operarios (derecha e izquierda).

Todos los Petrifilm después de haber sido utilizados se llevaron a incubar de la manera siguiente:

• Mesófilos: se incubaron a una temperatura de 35 ± 2 ºC por 48 h.
• Hongos-levaduras: se incubaron a una temperatura de 20 ± 2,5 ºC por 5 días.

Cumplido el tiempo de incubación se realizó el recuento y se informaron UFC/100 ó 120 cm2 , si son mesófilos u hongos-levaduras respectivamente.

Ahora bien, durante el proceso de envase se realizó el monitoreo de ambiente y personal al inicio, mitad y final del envase. Así mismo se muestrearon las superficies y equipos al inicio y final del llenado aséptico.

Después de tener los resultados de las pruebas anteriores se determinaron las posibles causas de contaminación y se tomaron las acciones correctivas necesarias.

• Prueba de esterilidad

Filtración para muestras acuosas:

En la cabina estéril se colocaron los viales de caldo casoy y se hizo un pool del medio de cultivo en un frasco estéril.

Se agitó fuertemente.

Se armó el sistema de filtración dentro de la cabina de flujo laminar.

Se filtraron 100 mL de caldo casoy.

Se lavó 3 veces la membrana con 100 mL de diluyente.

Se tomó la membrana con pinzas estériles.

Se cortó la membrana con tijeras estériles en 3 partes iguales, una de ellas se colocó sobre el agar sangre y las otras dos en cada uno de los medios de cultivo (1 frasco de caldo tioglicolato y 1 frasco de caldo Casoy).6

La incubación de los medios se realizó a 32,5 o C ± 2,5°C (caldo tioglicolato y agar sangre) y 22,5 ± 25 °C (caldo casoy) durante 14 días.

Para los viales vacíos:

• Se colocó en cada uno de los viales muestreados 5 mL de solución salina peptonada estéril.
• Luego se procedió a grafarlos con tapones y agrafes estériles.
• Los viales grafados se dividieron en 2 grupos.
• Un grupo se incubó a una temperatura de 325 ± 2,5 °C y el otro grupo se llevó a incubar a 27,5 ± 2,5 °C durante 14 días.6

Para los tapones:

• Se tomó una cantidad representativa de tapones y se colocaron en un frasco schoot de 1 L (este procedimiento se realizó por duplicado).
• Se adicionó solución salina peptonada estéril, tapando fuertemente el frasco con los tapones.
• Se mezclo bien.
• Se llevo a incubar a 27,5 ± 2.5 °C y a 275 ± 2,5 °C durante 14 días.

• Prueba de promoción de crecimiento

El caldo casoy utilizado en los envases fue sometido a la prueba de promoción de crecimiento en cada uno de los envases, esto para saber si contenía todos los nutrientes necesarios para promover el crecimiento de microorganismos. Después de tomar una muestra representativa del lote, se realizó el procedimiento siguiente.6

1. Con anterioridad se sembraron por aislamiento en cajas de agar TSA los microorganismos siguientes: Candida albicans, Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus niger.
2. Se realizó una suspensión de cada microorganismo, según el patrón No. 1 de Mac Farland, el cual debe tener de 10-100 UFC para poder realizar la prueba.
3. Se hicieron 4 diluciones base 10.
4. De la última dilución se tomó 01 mL para inocular en el medio casoy.
5. Las muestras fueron inoculadas con Staphylococus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa, y luego incubadas a 32,5 ± 2,5 ºC por 48 h; mientras que aquellas que contenían Candida albicans y Aspergillus niger fueron incubadas a 22,5 ± 25 ºC durante 5 días.
6. La lectura se realizó por turbidez.
7. Se confirmó con tinción de Gram para las bacterias y azul de lactofenol para hongos.

B) Validación de la esterilización del liofilizador Criofarma

Para realizar la validación del proceso de esterilización de la cámara del liofilizador con peróxido de hidrógeno, se utilizaron las esporas de un microorganismo indicador para determinar la efectividad de los tiempos del ciclo de esterilización.

En este caso se sometió el microorganismo Bacillus stearothermophilus7 a un ciclo de esterilización normal del liofilizador. Es importante decir que la preparación de las esporas del microorganismo vienen contenidas en un sobre Tyveck/Mylar, el cual contiene en su interior un disco portador de las esporas del microorganismo.

Así pues, para realizar la prueba se colocaron diferentes sobres en lugares específicos dentro de la cámara de liofilización y se procedió a dar inicio al ciclo de esterilización.

Una vez terminado el ciclo de esterilización con peróxido de hidrógeno, los sobres que contenían el microorganismo indicador fueron retirados del liofilizador y transportados de inmediato al laboratorio para su procesamiento.

Así, se realizó el siguiente procedimiento en cabina de flujo laminar:8

1. Se abrió el sobre “Tyveck/Mylar” cortando en un extremo con unas tijeras estériles.
2. Se trasfirió el disco con las esporas a un tubo con 10 mL de caldo casoy; para ello se retiró el disco del sobre “Tyveck/Mylar” con unas pinzas estériles y se deposito en el caldo.
3. Se agitó el tubo vigorosamente.
4. Se procedió a realizar controles positivos, para los cuales se colocó el disco del microorganismo indicador en el caldo casoy sin someterlo a la esterilización.
5. Se procedió a hacer una prueba esterilidad al medio de cultivo casoy que se utilizó para cada prueba.
6. Se incubaron los tubos con los discos a una temperatura de 55-60 ºC por 7 días.

Interpretación de resultados:8

1. Se observaron los tubos, incluyendo los controles, diariamente durante los 7 días de incubación.
2. Se analizó que el tubo que contenía el disco del control positivo (el disco que no se sometió al proceso de esterilización con peróxido) apareciera turbio, a medida que transcurrían los días, pues esto indica crecimiento microbiano.
3. Los otros tubos fueron evaluados por ausencia de turbidez
4. El control del medio casoy, evaluado antes de la prueba se evaluó por turbidez.

Resultados

Monitoreo de ambientes

Para el primer envase en el muestreo microbiológico de ambientes “en reposo”, se pudo establecer que todos los puntos evaluados se encontraban dentro de los límites establecidos por la USP Cap. 1116; únicamente la esclusa de salida presentó crecimiento de bacterias y hongos-levaduras, identificadas como cocos grampositivos, y levaduras respectivamente, de acuerdo con la coloración de Gram. En el segundo envase el muestreo en el estado “en reposo”, presentó resultados de esterilidad en las áreas muestreadas pues no se detectó crecimiento de ningún tipo de microorganismo. Sin embargo, al inicio del envase se observó la presencia de bacterias en el área circundante (1 UFC/m3), identificada en la coloración de Gram como bacilo grampositivo; en la esclusa de salida (bacterias: 3 UFC/m3 y hongos: 2 UFC/m3) se identificó las bacterias contaminantes como cocos grampositivos; y en la esclusa de entrada (hongos: 1 UFC/m3).

Resultados conteo de partículas

En cuanto al conteo de partículas del primer envase en clase 100, de los 9 puntos muestreados (Tornamesa de entrada occidente, tornamesa de entrada oriente, Inicio banda trasportadora, final banda trasportadora, modulo de llenado, controles modulo de llenado, pretornamesa de salida, tornamesa de salida oriente y frente a la puerta del liofilizador), el único que presentó un recuento elevado fue el punto 9, frente a puerta del liofilizador. Ahora bien, tanto en el segundo como en el tercer llenado se obtuvieron resultados satisfactorios en esta área “en reposo” y “en operación”, pues el número de partículas no excedió de 100 partículas/pie3.1

En el ultimo envase las 2 extracciones del área evaluadas, presentaron desviaciones en el conteo tanto “en reposo” con 57 260 y 39 670 partículas/pie3 respectivamente, mientras que en operación los conteos fueron de 17 655 partículas/pie3 y 17 150 partículas/pie3.

Monitoreo de superficies

Para el primer envase, en condiciones de reposo los puntos muestreados dentro del área 100 mostraron recuentos de microorganismos dentro de los rangos permitidos (de acuerdo con USP XXVIII, 2005); sin embargo, en condiciones de operación al inicio y final del envase, en el punto 18 (piso del flujo laminar) se encontró un recuento de 5 UFC/placa en ambos casos.

En el liofilizador Criofarma bajo condiciones de simulación se obtuvo un recuento elevado de microorganismos en dos de las bandejas del liofilizador; los 2 puntos muestreados en la bandeja F para microorganismos mesófilos presentaron un recuento de MNPC (muy númeroso para contar) y en la bandeja G se presentaron recuentos de 33 y 18 UFC/placa.

Por otra parte, en el área 10 000 se obtuvo un recuento elevado de microorganismos mesófilos en el punto 22 (suministro del aire en el piso) con 22 UFC/placa y en el punto 28 (suministro de aire columna) 68 UFC/placa; estos resultados sugieren la posibilidad de que el aire que esté entrando al área 10 000 no este siendo filtrado adecuadamente.

En el segundo envase aséptico, el muestreo en reposo fue satisfactorio para los puntos contemplados en el área 10 000 y aquellos que se muestrearon en la envasadora; sin embargo, en el liofilizador la bandeja D y F presentaron un crecimiento de hongos-levaduras (15 UFC/placa respectivamente). En el área 10 000 el punto No. 22 (suministro aire piso) presentó recuentos elevados tanto al inicio (20 UFC/placa) y al final (25 UFC/placa).

En el tercer envase en el muestreo “en reposo” de la clase 100 la única contaminación presentada se relaciona con el piso de flujo laminar, en la cual se identificaron 14 UFC/placa de bacterias y 4 UFC/placa de hongos, y también el punto de extracción de aire uno presentó un recuento de 8 UFC/placa de bacterias; sin embargo, al final del envase tan solo hubo presencia de 5 UFC/placa en el piso de flujo laminar. En el muestreo del liofilizador en el tercer envase se obtuvo resultados fuera de especificaciones en las bandejas D (19 y 6 UFC/placa para mesófilos) y G (20 y 4 UFC/placa para mesófilos). Finalmente, en la linea de llenado al finalizar el envase se obtuvo un recuento de 19 UFC/placa en la tornamesa de salida.

Monitoreo de personal

Los resultados más importantes se encuentran en el inicio del primer envase, en este el operario de clase 100 presentó recuentos en su uniforme que se encontraban dentro de lo exigido por la norma; sin embargo, en la mitad del envase las polainas del operario presentaron 7 UFC/placa. En el segundo envase, en la mitad el operario clase 100 no cumplió con las especificación en 4 de los 5 puntos evaluados estos fueron: escafandra (5 UFC/placa), tapaboca (16 UFC/placa), pecho (17 UFC/placa) y guantes (6 UFC/placa); así pues, con estos resultados en el muestreo final la escafandra presentó un recuento de MNPC.

Por otra parte, los operarios de clase 10 000 presentaron recuentos elevados de los guantes (12 UFC/placa) en la mitad del envase. La misma situación del operario clase 100 se presentó en el tercer envase con recuentos en la mitad de pecho (19 UFC/placa), tapabocas (4 UFC/placa), pecho (13 UFC/placa) y guantes (17 UFC/placa), recuentos que sobrepasan los límites establecidos por la USP para el operario clase 100.

Prueba de promoción de crecimiento

En las 3 pruebas de promoción de crecimiento realizadas para este caldo se obtuvo un resultado positivo, lo cual indica que el medio utilizado tiene todos los nutrientes necesarios para permitir el crecimiento de diferentes microorganismos: bacilos grampositivos, gramnegativos, levaduras, cocos y hongos (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Staphylococus aureus y Aspergillus niger).

Lectura de viales del llenado aséptico

De acuerdo con los resultados obtenidos, se puede establecer que el número de viales contaminados excede en los 3 envases al número permitido según FDA. En la prueba de 12 000 viales (sometidos a la simulación del ciclo de liofilización), en el primer envase se identificaron 85 viales contaminados, resultado que disminuyó en el segundo envase (24 viales contaminados), pero aumentó notablemente en la tercera prueba, con un resultado muy similar al primer envase (86 viales). Por otra parte, en la prueba de 3 000 viales (sin hacer parte de la simulación del ciclo de liofilización) los resultados tampoco fueron satisfactorios para el primer (18 viales), segundo (2 viales) y tercer envase (18 viales); no obstante, el mejor resultado se obtuvo en el segundo llenado; pues a pesar de que no cumplió las especificaciones de la FDA, solo se obtuvieron 2 unidades contaminadas, acercándose al límite permitido por esta organización.

Pruebas de esterilidad

Dentro de las pruebas realizadas como control del proceso se llevó a cabo la prueba de la esterilidad del caldo casoy en cada corrida, por medio de la técnica de filtración de membrana (0,22 µm) y siembra en agar sangre, caldo casoy y tioglicolato, por 14 días. Es importante resaltar que dichas muestras fueron tomadas al inicio, mitad y al final del envase; así como después de la simulación de la liofilización. Las pruebas realizadas al inicio, mitad y final de los 3 lotes dieron como resultado: APROBADO. Sin embargo, después del ciclo de simulación, las muestras tomadas del primer lote, evidenciaron una contaminación con bacilos grampositivos después de haber realizado la coloración de Gram al caldo casoy, dando como resultado RECHAZADO. No obstante en el segundo y tercer envase las muestras tomadas después de la simulación dieron como resultado: APROBADO.

Los viales dieron como resultado: APROBADO, en las muestras tomadas en el inicio, mitad y final. En cuanto a los tapones en el caso de la muestra tomada en la mitad del proceso dio como resultado: RECHAZADO; esto debido a que se encontró contaminación por bacilos grampositivos según coloración de Gram. Las otras muestras tomadas en este mismo envase (inicio y final) y en la del primer y tercer envase dieron como resultado: APROBADO .

Validación del proceso de esterilización

En las 3 pruebas realizadas para la validación se determinó como resultado de esta VALIDADA, pues no hubo crecimiento del microorganismo indicador después de haber sido sometido al ciclo de esterilización por 4 h cada uno, en ninguno de los puntos evaluados. Sin embargo, 2 controles positivos por cada prueba fueron analizados; estos no fueron sometidos al ciclo de esterilización, pero se procesaron en el laboratorio como aquellos que sí estuvieron en contacto con el peróxido de hidrógeno. Por lo tanto, y como era de esperarse los controles positivos presentaron crecimiento propio de Bacillus stearothermophilus confirmado a nivel microscópico, lo cual en las 3 pruebas confirmó la viabilidad de las esporas del microorganismo.

Discusión

Realización de los 3 envases asépticos

Una vez establecidos los puntos de muestreo se procedió a la realización de los envases asépticos y sus respectivos muestreos, esto con el fin de establecer las condiciones reales de operación en el área y los factores críticos a controlar en el proceso de producción, además de evaluar las condiciones de esterilidad bajo las cuales el proceso es llevado a cabo.

Es importante resaltar que los viales que pasaron por la simulación del proceso de la liofilización (12 000 por cada envase) fueron analizados teniendo en cuenta los criterios establecidos por la FDA ; pues esta entidad exige que al llenar más de 10 000 unidades una unidad contaminada debe dar lugar a una investigación y dos unidades contaminadas se consideran causa para la revalidación, después de la investigación.

Asimismo, el número de viales a envasar se determinó teniendo en cuenta la capacidad máxima del liofilizador ya que esta prueba debía reflejar la cantidad de unidades que se envasan normalmente. Sin embargo, un factor importante es que el número de unidades a ser llenadas por corrida deben ser suficientes para proveer una alta probabilidad de detectar una baja incidencia de contaminación microbiana. Por ejemplo, con el fin de dar una confianza del 95 % de detectar una tasa de contaminación de uno en mil unidades llenadas (0,1 %) con un medio estéril nutritivo, 3 000 unidades necesitan ser llenadas y ninguna unidad contaminada debe ser encontrada como contaminada después del periodo de incubación.

Monitoreos microbiológicos

Teniendo en cuenta que las condiciones del área en operación varían considerablemente en relación con el estado “en reposo” se muestreó tanto el área como el liofilizador bajo estas condiciones el día anterior al envase para poder comparar los resultados de los mismos puntos ya en operación. De hecho, en condiciones de operación los patrones de la circulación de aire en zonas limpias pueden ser disturbados fácilmente por factores como la máquina (es decir, la barrera protectora), diseño del equipo, especificaciones componentes inadecuadas, o intervenciones necesarias. El efecto de estos problemas se acentúa con una interferencia manual inadecuada que contribuye a un riesgo potencial más alto de la contaminación por aire.9

Así pues se estableció que al inicio del envase hay mayor número de unidades formadoras de colonia por metro cúbico (detectadas a través del muestreador de aire MAS 100), principalmente hongos y levaduras en las 2 esclusas, lo cual probablemente se debe a que en estas áreas hubo un mayor movimiento constante del personal especialmente en el inicio, ya que en este envase muchos de los materiales que debieron entrar por la esclusa de materiales fueron entrados por la esclusa entrada, lo cual afectó la esterilidad de estas áreas.

De igual manera, hay que tener en cuenta que en estas áreas ocurre el cambio de ropa proveniente de áreas no estériles, por lo cual es importante afirmar que el flujo de personal es muy crítico para el mantenimiento de un ambiente estéril. Esto incluye el cambio de uniformes y todos los movimientos necesarios a través de todas las instalaciones del cuarto limpio. Es ideal asegurar que el flujo de personal es en una dirección, del área de vestido (esclusa de entrada) al área de operación y por último a la esclusa de salida; desde el área más limpia al área más sucia.10 En comparación con los envases anteriores, el tercer llenado se caracterizó por la presencia de hongos en la esclusa de entrada y en la esclusa de salida; este hecho sugiere que algún tipo de material que haya entrado a las esclusas, se encontraba contaminado con esporas que fueron liberadas al ambiente; la razón de esta afirmación es que en dicha área no hay zonas húmedas que puedan propiciar el crecimiento de este tipo de microorganismos.

En cuanto al conteo de partículas debido al mayor movimiento de personal dentro de la clase 100, se obtuvieron conteos elevados, ya que es allí en donde las bandejas cargadas con los viales son trasportadas dentro del liofilizador. Sin embargo, este resultado también puede estar relacionado con alguna falla en el sistema de aireación del área, pues dicho resultado es alarmante teniendo en cuenta que el número máximo de partículas según USP Cap. 1116 es de 100 partículas/pie3 .

Es importante decir que la razón de medir partículas aerotransportadas dentro de la industria farmacéutica es debido a la probabilidad de que algunas de las partículas pueden ser microorganismos. Esto se extrapola de que se asume que la partícula de 0,5 µm corresponde al tamaño aproximado de un microorganismo y la partícula del tamaño de 5,0 µm corresponde a una célula de piel humana; o que el nivel de partículas es de cierta manera proporcional a un número dado de microorganismos. Aunque esto nunca se ha determinado, la relación se considera 105 partículas: 1 microorganismo. La diferencia en el rango de las partículas y los posibles microorganismos está relacionada con varios factores incluyendo el vertimiento de partículas estériles por la ropa o la generación de partículas estériles de los aerosoles durante el llenado del producto.11

Así pues, en el área 10 000 el punto que se salió de límites fue el número seis, extracción del aire junto a controles del liofilizador dos; este punto es crítico debido a que queda a la entrada de la esclusa de materiales, en donde se colocan las cajas de viales estériles para luego ser trasportadas a la tornamesa de entrada.

Los resultados obtenidos en el último envase se relacionan con que en área existe una falla en el sistema de extracción de aire que debe ser reevaluada por el Departamento de Ingeniería, pues de acuerdo con los resultados de estos puntos en estado “en reposo” no se puede garantizar un comportamiento dentro de los límites esperados en operación.

Los resultados obtenidos en el monitoreo de superficies pueden ser atribuidos a diferentes razones: una de ellas se relaciona con el hecho de que en estas bandejas se presentó el rompimiento de algunos viales al momento de ser taponados; de hecho, cuando se realizó el muestreo se encontraron algunos remanentes de los vidrios y medio de cultivo que habían sido dispersados a la superficie de las bandejas.

No obstante, la cantidad de microorganismos encontrados puede obedecer a una mala sanitización en estos 2 puntos, teniendo en cuenta que aunque hacen parte del área no son vistos como un lugar importante en el momento de realizar el proceso de limpieza y desinfección.

Ahora bien, los recuentos obtenidos en el punto de tornamensa en el último envase aséptico se relacionan con el hecho de que en este punto hay un movimiento continuo de viales y en algún momento se pudo haber derramado parte del medio envasado contaminado; además teniendo en cuenta que en esta zona hay una manipulación constante por parte del operario de clase 100 que pudo haber contaminado esta superficie por una desinfección inadecuada de los guantes.

Asimismo, en el análisis microbiológico a operarios se encontraron recuentos elevados en tapabocas, pecho, guantes y polainas; lo cual sugiere que el personal no realizó adecuadamente durante el proceso de envase una desinfección constante del uniforme con alcohol etílico comercial 70 % desinfectante presente en el área de envase. Estos resultados se relacionan con el hecho de que al final de los envases asépticos la contaminación del uniforme es un factor constante para todos los operarios, pues la carga microbiana fue elevada en comparación con los resultados encontrados al inicio y mitad del envase.

Esta tendencia de obtener recuentos elevados al final de los envases obedece al hecho a que en esta etapa de muestreo los operarios ya habían estado en contacto con muchas superficies del área y factores como la transpiración y la exposición prolongada del uniforme al ambiente durante aproximadamente de 9 h, contribuyeron a la obtención de estos resultados. Así mismo, los recuentos elevados en los uniformes de los operarios se relacionan con una mala postura de este, además indica un inadecuado lavado de manos en el momento de la postura de él, lo cual ocasiona la transferencia de microorganismos de la piel a la superficie del uniforme del personal.

En cuanto a las pruebas de promoción de crecimiento los resultados fueron satisfactorios para los medios evaluados, estos tienen una gran relevancia teniendo en cuenta que mediante estas pruebas se aseguró la capacidad de todos los medios utilizados en las diferentes pruebas para permitir el crecimiento de los microorganismos recuperados durante los envases asépticos.

Ahora bien, para los 3 envases asépticos después de haber leído los viales por turbidez, el porcentaje de contaminación fue del 0,43 %, valor que es indeseable teniendo en cuenta que el valor esperado era del 0,1 %, es decir, máximo unidad contaminada.

Esta alta tasa de contaminación encontrada en los viales envasados obedece a varias razones; dentro de estas se destacan, las malas prácticas de manufactura por parte de los operarios. Uno de los factores más críticos que pudo afectar el resultado final de los envases, está relacionado con la contaminación aportada por el operario clase 100. Esto teniendo en cuenta los altos recuentos de microorganismos encontrados en el uniforme y guantes de este operario, hecho mencionado anteriormente. De hecho la contaminación microbiana en un proceso aséptico es causada principalmente por el personal. Se estima que más del 99 % de todos los microorganismos detectados en cuartos limpios son de origen humano.12

Cabe destacar que en dichos resultados se relacionan con una mala postura del uniforme, y un mal lavado de manos por parte de estos, pues solo así se explica los recuentos elevados que se presentaron en la mitad del proceso y al final; especialmente en la escafandra, tapabocas y pecho; teniendo en cuenta que los recuentos elevados en los guantes mejoraron desde que se sugirió la aplicación de alcohol periódicamente en el área estéril.

Otro factor relacionado con la contaminación generada en los lotes del caldo casoy, se debe a una adecuación deficiente del área en cuanto a la falta de implementos que faciliten la esterilidad dentro del área. Por otra parte, como se mencionó en los resultados mostrados por el contador de partículas Micro Air Royco 300, el estado del área en cuanto a los sistemas de aire (suministros y extracciones) no es adecuado pues tanto en condiciones “en reposo” como “en operación” varios de los puntos evaluados se salen de los límites establecidos. Este factor es crítico ya que si no se tienen las condiciones adecuadas a nivel del aire que circula en el área, la garantía de esterilidad tanto en el área como en los productos finales se ve comprometida de manera negativa, lo cual se refleja en los resultados del llenado aséptico.

Ahora, teniendo en cuenta que esta fue una prueba en la cual se simuló el proceso de envase aséptico y que se realizó por primera vez desde que el área fue construida, durante las 3 corridas realizadas la máquina envasadora presentó varios inconvenientes mecánicos que condujeron a varias paradas de esta durante los envases. Este hecho, es perjudicial, teniendo en cuenta que cada parada constituye un riesgo microbiológico al producto, pues en ocasiones requería la intervención directa de un operario en el módulo de envase, hecho que aumenta la carga microbiológica dentro de dicha área crítica.

Así pues, con estos resultados se puede determinar que no fue posible validar el llenado aséptico en el liofilizador Criofarma, estableciendo como concepto de validación: NO VALIDADO . Esto, teniendo en cuenta que para validar el proceso de envase aséptico por lo menos 2 de 3 corridas deben ser satisfactorias según normatividad establecida por la FDA ; y en este caso ninguna de las 3 corridas fue satisfactoria pues en todos los lotes más de una unidad contaminada fue encontrada.

Después de realizadas las identificaciones (de género y especie de los microorganismos aislados partir de los envases), se identificaron los siguientes microorganismos como contaminantes, entre las bacterias identificadas se encuentran: Staphylococcus epidermidis, Micrococcus luteus, Micrococcus roseus y Staphylococcus caprae; microorganismos grampositivos y cuya morfología corresponde a cocos.

De acuerdo con estos microorganismos identificados es posible afirmar que este tipo de contaminación proviene de los operarios; de hecho, los microorganismos mas frecuentemente aislados en áreas controladas usadas para llevar a cabo procesos asépticos son bacterias de piel de humanos.

Así pues, esto evidencia malas prácticas de manufactura, probablemente por una mala postura del uniforme, teniendo en cuenta que estos microorganismos se encuentran principalmente en al piel de humanos; de hecho, se puede determinar que los operarios constituyen un riesgo importante en lo que se refiere al mantenimiento de las condiciones de esterilidad dentro del área. Es importante resaltar, que l os cocos grampositivos se encuentran en alto número en piel humana y son fácilmente desprendidos. Sin embargo, las áreas controladas son protegidas contra los cocos con el uso de vestidos adecuados para dichas áreas, mascaras, guantes, técnicas de vestimenta apropiadas, y buenas prácticas asépticas.13

No obstante, como se había enfatizado anteriormente, factores como una mala desinfección de los elementos que ingresan al área puede contribuir de manera importante a la contaminación, pues también se identificó la presencia de microorganismos grampositivos esporulados como Bacillus cereus, cuyas esporas pueden ser transportadas por el aire.

Por otro lado, con el fin de determinar la efectividad del ciclo de esterilización con peróxido de hidrógeno, se utilizó un indicador biológico, en este caso dicho microorganismo fue Bacillus stearotermophillus. Es importante establecer que la farmacopea estadounidense ha definido un indicador biológico como una preparación caracterizada de un microorganismo específico que provee una resistencia estable y definida a un proceso de esterilización específico.

Es fundamental resaltar la importancia de los resultados de esta prueba, pues permitieron comprobar la efectividad del ciclo de esterilización, al comprobar la eliminación de microorganismos esporoformadores y por ende de cualquier otro tipo de microorganismos, lo cual asegura la esterilidad de la cámara del liofilizador en el proceso.

Definitivamente, a partir de los resultados anteriores es posible afirmar que la causa principal para que la prueba de llenado aséptico no hubiera sido satisfactoria se debe a deficientes prácticas de manufactura por parte de los operarios; deficiencia tecnológica en equipos, por la inexistencia de un horno de despirogenización de los viales de vidrio “en línea” con el área de llenado aséptico y deficiencias del sistema de ventilación del área, pues con los resultados anteriores se puede descartar la contaminación de los viales envasados por parte la desinfección del liofilizador.

En conclusión:

• Se realizó y estableció los procedimientos de validación del proceso de llenado aséptico en el liofilizador.
• Se generaron los procedimientos de muestreo de ambientes y superficies para el área de liofilizados, procedimiento de llenado aséptico, procedimiento de muestreo e inspección de producto en envase, validación de la esterilización con peróxido de hidrógeno en el liofilizador Criofarma. Aparte se creó una planilla de control y revisión antes del envase en el área de liofilizados (liofilizador Criofarma)
• El protocolo de validación del llenado aséptico en el liofilizador Criofarma fue realizado de acuerdo con los requerimientos propios del área y del proceso; elaborado para cumplir con las especificaciones microbiológicas establecidas por la USP XXVIII y propias de la Empresa Productora de Productos Veterinarios.
• La elaboración de los procedimientos operativos estándar permitirán tener documentación referente al proceso y posteriormente un registro que permita determinar posibles fallas en el proceso.
• Se establecieron límites de acción para el área del liofilizador Criofarma, dentro de los cuales se incluyen límites microbiológicos para operarios, superficies y equipos, ambientes. Estas herramientas permitirán detectar a tiempo posibles desviaciones en los monitoreos microbiológicos y tomar acciones correctivas oportunas que permitan controlar cualquier tipo de contaminación indeseable en el área.

Summary

Methodology for the validation of the aseptic filling in a lyophilization process

The methodology proposed for the validation of an aseptic filling in a lyophilization process was presented. To this end, 3 tests were made in which 3 batches of 15 000 vials each one were filled with casoy broth. They were incubated at 22.5 ± 2.5 ºC y 32.5 ± 2.5 ºC for 14 days, respectively, in order to detect the possibility of microbial contamination on carrying out the process. During the first three proceses, the microbiological monitoring of environments, surfaces and operators took place. Petrifilm was used in the sampling to detect aerobic mesophiles and yeasts, a procedure accomplished under rest and operation conditions. Likewise, the counting of particulars was made in the area and sterility tests were done for the packing materials (caps and vials). Finally, the validation methodology was designed for the sterilization of the lyophilizer, and Bacillus stearothermophilus was used as an indicator microorganism. The design of the test was made taking into account the recommendations of the Food and Drug Administration (FDA) and the World Health Organization (WHO) for products of parenteral administration.These are the reference organizations for the production and quality control used by the enterprise of veterinary products , where the test was performed. The filled vials were read by turbidity (presence of contamination), and the acceptance criteria were established by the 2 above mentioned entities. To conclude, it was indicated a plan of microbiological monitoring for the evaluated area, in which points of strategical sampling were included, as well as the accomplishment of specific standard operative procedures for this area.

Key words: Validation, aseptic filling, FDA, WHO. Bacillus stearothermophilus.

Referencias bibliográficas

1. Pharmacopea. The United States Phamacopeia. The official compendia of standards. USP XXVIII. USA: United States Phamacopeia Convention Inc; 2005.
2. Merck. Manual de Medios de Cultivo. Darmstadt: Merck; 1994.
3. 3M Productos Microbiológicos. Guía de interpretación para el recuento de mesófilos aerobios. USA. México. 2005. p 24-9.
4. 3M Microbiológicos. Guía de interpretación para el recuento de hongos y levaduras. USA. México. 2005. p. 24-9.
5. Organización Mundial de la Salud. Comité de expertos de la OMS en especificaciones para las preparaciones farmacéuticas. Serie de Informes Técnicos de la OMS. Ginebra: OMS; 1992. Serie de Informes Técnicos: 32.
6. FDA. Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing Draft. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. United States of America, Rockville: FDA; 2004.
7. Rickloff, J. Validation Fundamental Principles of Isolator Decontamination. Advanced Barrier Concepts, Inc. North Carolina, 2001. p. 1-4.
8. STERIS. SPORDEX-VPH, Culre Test. USA. 2006.
9. Ljungqvist B, Reinmüller B. The LR Method in Critical Areas Airflow Patterns and the Design of Aseptic Interventions. Pharmaceutical Technology. 2004.
10. Sandle T. Particle Monitoring and Control. PMPS Sterile Manufacturing. USA. 2003.
11. Cundell MA. Microbial Testing in Support of Aseptic Processing. Pharmaceutical Technology. 2004. p. 56-61.
12. Agalloco J, Akers J. Aseptic Processing: A Vision of the Future. Pharmaceutical Technology. 2005.
13. Groesbeck M. Apparel System Selection For Phamaceutical Cleanrooms. Controlled Environments Magazine. 2006.

Recibido: 11 de octubre de 2006. Aprobado: 17 de noviembre de 2006.
Cindy Marlene Fernández López. Pontificia Universidad Javeriana. Departamento de Microbiología. Facultad de Ciencias. Carrera 7 No. 43-82. Edificio Carlos Ortiz (51). Bogotá, Colombia. Correo electrónico: [e-mail]

1 Microbióloga Industrial.
2 Master en Ciencias.
3 Químico Farmaceuta. Director del Departamento de Control de Calidad. Empresa Colombiana de Productos Veterinarios.