ARTÍCULOS ORIGINALES

 

Validación del método analítico para el control de la calidad y estudio de estabilidad de ketotifeno colirio 0,025 %

 

Validation of analytical method to quality control and the stability study of 0.025 % eyedrops Ketotiphen

Yenilen Troche Concepción^I; Jacqueline Aylema Romero Díaz^II; Caridad M. García Peña^III; Martha Botet García^I; Marisleydi Begué David^IV

^ILicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Empresa Farmacéutica "Julio Trigo". La Habana, Cuba.
^IILicenciada en Bioquímica. Investigadora Aspirante. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana, Cuba.
^IIIMáster en Tecnología y Control de Medicamentos. Investigadora Agregada. CIDEM. La Habana, Cuba.
^IVTécnico en Tecnología de la Salud. CIDEM. La Habana, Cuba.

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RESUMEN

El colirio de ketotifeno se indica para aliviar los signos y síntomas de las conjuntivitis alérgicas, por ser este un potente antihistamínico H₁ que muestra cierta capacidad para inhibir la liberación de histamina y otros mediadores en mastocitos. En este trabajo se desarrolló y validó un método analítico por cromatografía líquida de alta resolución, para el control de la calidad y los estudios de estabilidad del ketotifeno colirio 0,025 %. El método se basó en la separación del principio activo a través una columna cromatográfica Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 x 4 mm), con detección ultravioleta a 296 nm, para lo cual se empleó una fase móvil compuesta por una mezcla desgasificada de metanol:buffer fosfato (75:25; pH 8,5) y
se le añadió 1 mL de isopropanol por cada 1 000 mL de la mezcla anterior, con una velocidad de flujo de 1,2 mL/min. El método analítico resultó lineal, preciso, específico y exacto en el intervalo de concentraciones estudiadas.

Palabras clave: Cromatografía líquida de alta resolución, métodos, ketotifeno, validación.

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ABSTRACT

The Ketotiphen eyedrop is prescribed to relief the signs and symptoms of allergic conjunctivitis due to its potent H₁ antihistaminic effect showing some ability to inhibit the histamine release and other mediators in cases of mastocytosis. The aim of present paper was to develop and validate an analytical method for the high-performance liquid chromatography, to quality control and the stability studies of 0.025 % eyedrop Ketotiphen. Method was based on active principle separation by means of a Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 x 4 mm), with UV detection to 296 nm using a mobile phase including a non-gasified mixture of methanol:buffer-phosphate (75:25; pH 8.5) adding 1 mL of Isopropanol by each 1 000 mL of the previous mixture at a 1.2 mL/min flow velocity. The analytical method was linear, accurate, specific and exact during the study concentrations.

Key words: High-performance liquid chromatography, methods, Ketotiphen, validation.

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INTRODUCCIÓN

El ketotifeno es un potente antihistamínico H₁ que muestra cierta capacidad para inhibir la liberación de histamina y otros mediadores en mastocitos. Se cree que actúa inhibiendo la liberación de mediadores químicos producidos por los leucocitos y los mastocitos sensibilizados.^1,2

El desarrollo de técnicas o métodos analíticos novedosos o la adecuación de algunos ya reportados es un problema cotidiano. Siempre que esto suceda se exige como parte integral del estudio, la validación del método en cuestión. La validación proporciona un alto grado de confianza y seguridad del proceso productivo o del método analítico así como también en la calidad de los resultados.^3,4

Los parámetros analíticos evaluados en la validación del método analítico, fueron exactitud, precisión, especificidad, robustez y linealidad.^4-6

El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo y la validación de un método analítico para la determinación del principio activo en el colirio de ketotifeno 0,05 %, por cromatografía líquida de alta resolución (CLAR).

MÉTODOS

La sustancia de referencia química de ketotifeno fumarato fue suministrada por el grupo de sustancias de referencia del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM, La Habana, Cuba), el cual fue analizado por el método cromatográfico establecido para realizar el control de la calidad de la materia prima, con una pureza de 99,8 %. El producto terminado en forma de colirio, fue elaborado en la Empresa Farmacéutica "Julio Trigo", identificado como el lote 7001, fabricado en diciembre de 2007, con fecha de vencimiento diciembre de 2009, el cual cumplió con las especificaciones de calidad establecidas para el control de la calidad de los colirios.

Todos los reactivos utilizados fueron de grado HPLC. En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 296 nm, un inyector con un loop de 20 µL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente empleando una columna Lichrosorb RP-18 (5 µm) (250 x 4 mm) y un flujo de 1,2 mL/min. La fase móvil óptima, consistió en una mezcla desgasificada de solución A y acetonitrilo en una proporción de 80:20.^4,5 La solución A se preparó empleando metanol:buffer fosfato, en una proporción de 75:25, ajustando pH a 8,5; una vez preparada esta solución se le añadió 1 mL de isopropanol por cada 1 000 mL de la mezcla anterior de solución amortiguadora fosfato de potasio monobásico 0,025 Molar a pH= 4,6.

La solución de referencia se obtuvo disolviendo ketotifeno fumarato, sustancia de referencia, en 20 mL de fase móvil; se aplicó ultrasonido durante 10 min hasta disolución y se completó hasta un volumen de 100 mL con metanol, a una concentración de 40 µg/mL.

En la preparación de la solución de ensayo para la valoración, se disolvió una alícuota de la muestra del colirio en metanol hasta un volumen de 10 mL, a una concentración de 40 µg/mL

Validación del método analítico

La validación fue realizada según la categoría I (USP 30) y la Regulación 41-2007 del Centro para el Control Estatal de la Calidad de los Medicamentos (CECMED), para la validación de métodos de análisis; se evaluron los parámetros que a continuación se describen:^3,6

Linealidad

Para el análisis de la linealidad se realizó el modelo de 3 determinaciones para 5 concentraciones diferentes: 60, 80, 100,120 y 140 %. Se determinó la ecuación de la recta, el coeficiente de correlación, la prueba de significación estadística de significación de la pendiente Sb rel (%), los coeficiente de variación de los factores de respuesta, ensayo de proporcionalidad.

Exactitud

Para el análisis de exactitud se realizó el modelo de 3 réplicas para 3 concentraciones diferentes: 80, 100, 120 %; se determinó el % de recuperación, la desviación estándar y el coeficiente de variación. Se aplicó además el ensayo de Gochran con vistas a comprobar si la variación de la concentración producía diferencias significativas en los resultados y la prueba t de Student para determinar diferencias significativas entre la recuperación media y el 100 %.

Precisión

Para el estudio de la precisión se aplicó el modelo de repetibilidad con 6 réplicas. Con ellas se determinaron los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

De igual manera para el ensayo de la precisión intermedia se utilizaron 3 valores de concentración que correspondieron al 80, 100 y 120 % para 2 analistas y 3 días diferentes. Se aplicó la prueba de Fisher y de la t de Student para determinar si existían diferencias significativas entre los resultados al variar las condiciones de análisis.

Especificidad

Para el estudio de especificidad se analizaron: la sustancia de referencia de ketotifeno fumarato, el placebo, las muestras del producto terminado (colirio) y muestras sometidas a condiciones drásticas como: hidrólisis ácida (con ácido clorhídrico 5 N), hidrólisis básica (con hidróxido de sodio 5 N), oxidación (con peróxido de hidrógeno) y exposición a la luz durante 7 días. Criterio de aceptación: No se debían obtenerse señales del placebo y de los productos de degradación en la zona de elusión del principio activo. Las áreas bajo las curvas del patrón y del ketotifeno en el producto terminado debían ser similares.

RESULTADOS

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Se observa en el cromatograma correspondiente a la muestra placebo (A) que no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, al ser comparado con la señal obtenida para la sustancia de referencia (B) y de la muestra de ketotifeno en el colirio (C), lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la formulación no interfieren en la determinación del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drásticas de oxidación, hidrólisis ácida, hidrólisis básica y la muestra sometida a la luz que se observan en los cromatogramas (D, E, F y G), la aparición de picos secundarios es atribuible a un posible producto de degradación, el cual no interfiere en la determinación del principio activo.

En la tabla 1 se reportan los resultados de los estudios de la linealidad del sistema, el coeficiente de regresión lineal fue de 0,9987 y el coeficiente de variación del factor de respuesta resultó igual a 1,50 %.

Los resultados del estudio de precisión del método aparecen reportados en la tabla 2. En el estudio de repetibilidad realizado, la media obtenida fue de 100,44 % y el coeficiente de variación fue de 0,20 %, mientras que los valores de F calculadas y los valores de t calculadas fueron menores que los valores tabulados, para un 95 % de confianza, para cada uno de los niveles estudiados.

Tabla 2. Resultados del estudio de la precisión intermedia del método analítico

Niveles	Analista 1 (%)				Analista 2 (%)
	Día 1	Día 2	Día 3		Día 1		Día 2			Día 3
80 %	80,9	80,7	80,8		80,6		80,9			80,6
	80,5	80,6	80,6		80,6		80,8			80,7
	80,6	80,6	80,8		80,7		80,9			80,7
100 %	100,5	100,3	100,7		100,8		100,3			100,3
	101,0	100,2	100,8		100,8		100,6			100,9
	100,5	100,4	100,3		100,6		100,4			100,1
120 %	120,1	121,0	120,6		121,1		120,5			120,3
	120,0	121,0	120,6		120,8		120,6			120,2
	119,5	120,5	120,7		120,5		120,5			121,0
Análisis estadístico
Parámetros				Resultados					Límites
Prueba de Fisher por analistas (Ftab (8/8; 0,05) = 3,44)				1,05					Fcalc≤ Ftab
				1,28
				2,90
Prueba de Fisher por días (Ftab (5/5; 0,05)= 5,05)				1/2		2/3		1/3	Fcalc≤ Ftab
				3,86		3,50		4,34
				1,22		2,39		4,76
				5,01		1,25		3,99
Prueba t de Student por analistas (ttab (16; 0,05)=2,12)				0,58					tcalc≤ ttab
				0,04
				1,03
Pueba t de Student por días (ttab (10; 0,05)= 2,22)				1/2		2/3		1/3	tcalc≤ ttab
				0,15		0,85		1,05
				2,17		0,55		1,10
				1,45		0,93		1,28

tcal: t calculada; Fcal: F calculada; ttab: t tabulada; Fcal: F tabulada; %: Los datos corresponden al porcentaje de principio activo en la formulación.

En la tabla 3, aparece reportado los resultados del estudio de exactitud. La recuperación media fue de 100,23 % y el valor de t calculada (2,05) y de G calculada (0,412) fueron menores que los valores tabulados, para un 95 % de confianza, t tabulada 2,306 y G tabulada 0,797.

DISCUSIÓN

Los resultados del estudio de especificidad del método, que se muestran en la figura, demuestran la especificidad del método al no presentarse interferencias de picos adicionales en la zona de elución del producto principal, ya que los productos de degradación y los excipientes de la formulación presentan tiempos de retenciones diferentes al principio activo, todos inferiores al tiempo de retención del ketotifeno. Este estudio permite concluir que el método cromatográfico resultó ser específico pues permite cuantificar el principio activo después de la degradación de este en muestras de medicamento sin interferencias de excipientes y/o producto de degradación.⁴

Los resultados del estudio de linealidad muestran coeficientes de regresión y de determinación superiores a los exigidos, 0,99 y 0,98 respectivamente; se demostró con el valor del coeficiente de correlación obtenido, cercano a la unidad, la existencia de correlación con una probabilidad elevada, así como el grado de relación entre las variables concentración y respuesta detectada por el equipo empleado. También el coeficiente de variación de los factores de respuesta y la desviación estándar relativa de la pendiente fueron inferiores al normado como máximo para estos indicadores: 5 y 2 %, respectivamente, ambos son considerados estimadores puntuales que permiten caracterizar la variabilidad. El valor obtenido del (CV_f) permitió demostrar que existe variabilidad en la relación respuesta y concentración para cada nivel evaluado. El intervalo de confianza del intercepto incluye al cero, lo que permite excluir la significación del error del intercepto. Se demostró con estos resultados la linealidad del método propuesto.

En el estudio de la repetibilidad realizado a una misma muestra, por el mismo analista, el mismo día, a través de 6 réplicas, se alcanzó un coeficiente de variación adecuado (0,20 %), lo que demostró la buena precisión del método, observándose una variabilidad de los resultados dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos: CV£ 2,0 %.⁶

Los valores que se obtienen en el estudio de precisión intermedia, de las pruebas de Fischer y t de Student, para el estudio de la precisión intermedia demostraron que no existían diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días para una probabilidad de 0,05 %, ya que el valor de F calculada es menor que la F tabulada, este resultado permite establecer que las precisiones son similares. Al realizar la prueba de t de Student el valor calculado resultó menor que el tabulado, para una probabilidad de 0,05, lo cual demostró que no existían diferencias significativas entre las medias alcanzadas, con un nivel de significación de un 5 %.

Los valores de porcentaje de recobrado estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos cromatográficos (98-102 %) y los valores del coeficiente de variación para cada uno de los valores de concentración estudiados resultaron ser menor que el 2 %.⁴ En la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran, se obtuvo que G calculada fue menor que G tabulada para una probabilidad de 0,05, k= 3 y n= 3; por lo tanto, las varianzas de las concentraciones empleadas son equivalentes, lo cual indica que la concentración no influye en la variabilidad de estos. Al realizar la prueba de significación entre la recuperación media y el 100,0 % de recuperación, con un coeficiente de variación de 0,35 %, se obtuvo una t calculada menor que t tabulada.⁶ Los resultados demostraron la capacidad del método para dar resultados cercanos al valor verdadero, observándose una buena exactitud.

El método analítico validado por CLAR, para la cuantificación del principio activo del colirio de ketotifeno 0,025 % para el control de la calidad y el estudio de estabilidad resultó ser lineal, preciso, exacto, robusto y específico en el intervalo de concentraciones establecido del 60 al 140 %.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Goodman A, Gilman A. Las bases farmacológicas de la terapéutica. Tomo II. 3ra. ed. La Habana: Editorial Científico Técnica; 1994. p. 460-1.

2. PDR. Physician´s Desk Reference. 57 ed. New York: Inc at Montuale; 2003. p. 2920.

3. United States Pharmacopoeial Convention. USP 30. United States Pharmacopoeia. Rockville: Mack Printing; 2007. p. 2621-5.

4. Quattrocchi OA, Laba RF. Introducción a la HPLC. En: Aplicación y práctica. Buenos Aires: Ed. Artes Gráficas Farro SA; 1992. p. 106-122, 284, 302-328.

5. Dierksneier G. Métodos cromatográficos. La Habana: Ed. Científico-Técnica; 2005. p. 1-4, 256-412.

6. Validation of Analytical Procedures. Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Geneve: International Conference on Harmonization, ICH-Q2A; 1995.

Recibido: 8 de abril de 2010.
Aprobado: 17 de mayo de 2010.

M. C. Caridad Margarita García Peña. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1 605 entre Boyeros y Puentes Grandes. CP 10 600. Plaza de la Revolución, La Habana, Cuba. Correo electrónico: [e-mail]