PRODUCTOS NATURALES

 

Extracción, caracterización y actividad antioxidante del aceite esencial de plectranthus amboinicus L

 

Extraction, characterization and antioxidant activity of essential oil from plectranthus amboinicus L

 

 

QF Glicerio León Méndez,^I MSc. María del Rosario Osorio Fortich, ^I MSc. Miladys Esther Torrenegra,^I Dr.C. Jesús Gil González^II

^I Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Cartagena. Grupo de Investigación en Tecnología Farmacéutica, Cosmética y de Alimento (GITFCA). Cartagena, Colombia.
^II Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. Medellín, Colombia.

 

 

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RESUMEN

Objetivo: extraer, caracterizar y determinar la actividad antioxidante del aceite esencial de orégano francés (Plectranthus amboinicus L) cultivado en la zona norte del departamento de Bolívar, Colombia.
Método: el aceite esencial se obtuvo por hidrodestilación e hidrodestilación asistida por radiación con microondas, a partir de las hojas; se determinó densidad relativa a 20 °C, índice de refracción; solubilidad de los aceites esenciales en etanol (70 % v/v) y rotación óptica. La composición química se evaluó mediante cromatografía de gases/espectrómetro de masa. La actividad antioxidante fue determinada mediante las técnicas de actividad antiradicalaria por los métodos DPPH^., ABTS ^.+, y ORAC.
Resultados: los rendimientos oscilaron entre 0,05 y 0,78 %, dependiendo del método de extracción utilizado. Los resultados de la prueba de actividad antioxidante mostro que los aceites esenciales de orégano francés (Plectranthus amboinicus L) obtenidos mediante ambos métodos de extracción tuvieron resultados promisorios; además, estos aceites presentaron altos contenidos de monoterpenos oxigenados con reconocida actividad antioxidante, como son el carvacrol y el timol.
Conclusiones: El aceite esencial de orégano francés (Plectranthus amboinicus L) se considera como promisorio para diseñar productos magistrales con actividad antioxidante.

Palabras clave: actividad antioxidante, aceite esencial, Plectranthus amboinicus L.

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ABSTRACT

Objectives: to extract, to characterize and to determine the antioxidant activity of the essential oil of French Oregano (Plectranthus amboinicus L) grown in the northern part of the Department of Bolívar, Colombia.
Methods: essential oil was extracted by distillation and radiation microwave-assisted hydrodistillation, from the leaves; relative density at 20 °C, refractive index; solubility of the essential oils in ethanol (70 % v/v) and optical rotation were determined. The chemical composition was assessed using gas chromatography/ mass spectrometer. The antioxidant activity was determined using the techniques of antiradical activity by the DPPH., ABTS.+ and ORAC methods.
Results: yields ranged from 0.05 to 0.78 %, depending on the extraction method used. The results of the test of antioxidant activity showed that the essential oils of French oregano (Plectranthus amboinicus L) obtained by both methods of extraction had promising results; in addition, these oils had high contents of ,oxygenated monoterpeneswith recognized antioxidant activity, such as carvacrol and thymol.
Conclusions: the essential oil of French oregano (Plectranthus amboinicus L) is considered as promising to design products with antioxidant activity.

Keywords: antioxidant activity, essential oil, Plectranthus amboinicus L.

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INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes son sustancias que pueden impedir, retrasar o inhibir las oxidaciones catalíticas y los procesos que inducen a la formación de radicales libres.^1,2 Existe actualmente un creciente interés en los aditivos naturales como antioxidantes potenciales, por lo cual en los últimos años han sido objeto de estudio muchas fuentes de origen vegetal.

Entre las propiedades antioxidantes de muchas plantas aromáticas se destaca la capacidad de regular las alteraciones relacionadas con el estrés oxidativo inducido por las especies reactivas de oxigeno (ERO) y radicales libres (RL), por lo cual ganan en el interés de muchos grupos de investigación.^2,3

Los aceites esenciales (AE) de plantas aromáticas y medicinales contienen principios activos que exhiben bioactividades como la antioxidante, antifúngica, antimicrobiana, entre otras.^4-5 En particular, el AE de la especie vegetal Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng perteneciente al género Plectranthus conocida en Colombia como Orégano Francés, contiene compuestos fenólicos como el timol y el carvacrol, a los cuales se les atribuye propiedades antisépticas, bactericidas y antioxidantes.^5-7

Adicionalmente, hoy por hoy, la tendencia de los consumidores se inclina hacia el consumo de “cosméticos naturales” libres de productos de síntesis y aditivos químicos (neutralizantes, preservantes, antioxidantes, colorantes y saborizantes), por lo que resulta interesante estudiar la actividad antioxidante de los aceites esenciales (AE) de plantas nativas. Este se trazó como objetivo extraer, caracterizar y evaluar la actividad antioxidante in vitro del aceite esencial del Orégano francés (Plectranthus amboinicus L.) cultivado en la zona norte del departamento de Bolívar, Colombia.

 

MÉTODOS

RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Las hojas de las plantas orégano francés (P. amboinicus), fueron recolectadas en el barrio Membrillal, cerca de la carretera que conduce a la zona industrial de la ciudad de Cartagena, Colombia, aproximadamente a 12 kilómetros de la región suroriental. Se tomaron 1 000 g de hojas por semana, en el periodo comprendido de febrero a marzo del 2014. El material vegetal fue identificado en el Herbario Gabriel Gutiérrez V. (MEDEL) de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, registro nacional de colecciones biológicas. El números de colección de dicha planta fue conservado con Nº de colección Torrenegra M. N°02.

PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

Las hojas colectadas fueron lavadas con agua y seleccionadas para garantizar buen estado; seguidamente se trocearon, pesaron y procesaron inmediatamente. Obtención del AE por HD, se realizó en un equipo de hidrodestilación del tipo Clevenger 500 g del material vegetal, se introdujeron en el balón de extracción, el cual contenía 500 mL de agua destilada. El tiempo de extracción fue de 3 horas.^8-10

En la obtención del AE por MWHD, se llevó a cabo en un equipo de destilación tipo Clevenger con un reservorio de destilación Dean Stark adaptado a un sistema de calentamiento por radiación de microondas, un horno microondas convencional marca (Samsumg, Estados Unidos), con una potencia del 70 %, dentro del cual se colocó un balón de extracción de 4 L con 500 mL de agua destilada y 500 g del material vegetal. El tiempo de extracción fue de 1 hora.^8-10

En ambos casos los aceites esenciales obtenidos se separaron por decantación e inmediatamente fueron almacenaron en viales ámbar a 4 ºC hasta la realización de los respectivos análisis.

DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES FÍSICAS DEL AE

A cada muestra de AE se le midieron las siguientes propiedades físicas: a) densidad relativa a 20 °C; b) índice de refracción; c) solubilidad del AE en etanol 70% (v/v): en un tubo de plástico con tapa de 1,5 mL se adicionaron 100 μL de etanol al 70 % (v/v) y 2 µL del AE. La mezcla se homogenizó en un vórtex a 200 rpm hasta obtener una solución homogénea; d) rotación óptica: se preparó una disolución al 10 % (p/v) del AE en etanol (96 %). El análisis fue realizado utilizando un polarímetro (Sper Scientific, Estados Unidos) provisto de una celda de 10 mL, a una temperatura de 20 ºC y la línea D del sodio (589 nm).^10-12

ANÁLISIS DEL AE POR CROMATOGRAFÍA DE GASES/ESPECTRÓMETRO DE MASA (CG/EM)

Se empleó un equipo CG/EM 7890A/5975C Agilent (Estados Unidos) en interfase con un detector selectivo de masas HP5973 Network conectado en línea con un sistema HP-MS ChemStation y la base de datos NIST-2008. Las condiciones de operación fueron: columna capilar HP-5MS (5% phenyl methyl silox, 30 m x 250 µm x 0.25 µm), temperatura inicial 45 °C, temperatura de la línea de transferencia de 280 °C y volumen de inyección 1,0 µL en modo split (20:1), con temperatura del inyector de 250 °C.^10-15 La detección de los compuestos se realizó por comparación del espectro de masas, en cada tiempo de retención, con los reportados en la base de datos NIST-2008.

MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS AE

Para determinar la actividad antioxidante de cada AE se emplearon tres metodologías: DPPH^., ABTS^.+ y ORAC.

MÉTODO DEL RADICAL DPPH•

La actividad captadora de radicales libres DPPH• se determinó empleando el método descrito por Silva et al¹⁶ (con algunas modificaciones 75 µL de muestra fueron adicionados a 150 µL de una solución metanólica de DPPH• (100 ppm) y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min, luego de los cuales se determinó espectrofotométricamente la desaparición del radical DPPH• a 550 nm en lector de microplacas Multiskan Ex (Thermoscientific). Se utilizó ácido ascórbico (25 µg/mL como control positivo de captación de los radicales DPPH•).

% Inhibición= [(AO - AF) /AO] x 100 (Ecuación 1)

Donde AO y AF son los valores de absorbancia del blanco (solucion de DPPH en alcohol) y la muestra (solucion de DPPH más antioxidante disueltos en alcohol) respectivamente.

MÉTODO DEL RADICAL ABTS•⁺

La actividad captadora del radical libre ABTS• se determinó empleando el método descrito por Re et al¹⁷ con algunas modificaciones. El radical ABTS• se formó tras la reacción de 3.5 mM de ABTS con 1.25 mM de persulfato potásico (concentración final). Las muestras fueron incubadas entre 2-8 °C y en oscuridad durante 16-24 h. Una vez formado el radical ABTS se diluyó con etanol hasta obtener una absorbancia de 0,7±0,05 a 734 nm. A un volumen de 190 µL de la dilución del radical ABTS se le adicionaron 10 µL de la muestra de AE y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos; luego de transcurrido este tiempo, se determinó espectrofotométricamente la desaparición del radical ABTS a 734 nm en el lector de microplacas Multiskan Ex (Thermoscientific). Se utilizó ácido ascórbico (4 µg/mL) como control positivo de captación de los radicales ABTS•.

MÉTODO ORAC

a) ORAC hidrofílico: en esta evaluación se empleó trolox como estándar y condiciones controladas de temperatura (37 °C) y pH (7,4). Las lecturas se realizaron a una  de excitación de 493 nm y de emisión de 515 nm. Para el desarrollo de la técnica se utilizaron soluciones de fluoresceína 1x10^-2 M en PBS (75 mM) y AAPH 0,6 M en PBS (75 mM). La muestra se preparó mezclando 21 µL de fluoresceína, 2,899 µL de PBS, 30 µL del extracto (muestra problema) y 50 µL de AAPH. Como referencia se usó trolox. El efecto protector del antioxidante se calculó usando las diferencias de áreas bajo la curva de decaimiento de la fluoresceína con el blanco y la muestra, y el resultado se comparó con la curva obtenida para el trolox. Los resultados se expresaron en micromoles de equivalentes de trolox por cada 100 gramos de muestra (µmol Tx/100 g muestra), de acuerdo a la siguiente ecuación (2).^18,19

ORAC = [(AUC – AUC°)/(AUC_Trolox – AUC°)] x f (Trolox) (Ecuación 2)

Donde AUC es el área bajo la curva de la muestra, AUC° es el área bajo la curva para el control, AUC_Trolox área bajo la curva para el trolox, f es el factor de dilución de los extractos.

b) ORAC lipofílico: se siguió el procedimiento previamente descrito a excepción de que la muestra y el trolox fueron preparados con ciclodextrina metilada (7 %) y en una mezcla de acetona-agua al 50 %. Las disoluciones se agitaron durante 1 hora y se procedió al análisis de acuerdo con lo descrito en el método ORAC hidrofilico.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Todos los ensayos se realizaron por triplicado siguiendo los protocolos establecidos anteriormente, los resultados se expresaron como el promedio ± el error estándar de la media (ESM) y se analizaron mediante Prueba t de Student. Valores de P<0,05 fueron considerados significativos. Para los análisis estadísticos el paquete GraphPadPrism Versión 5 para Windows.

 

RESULTADOS

La eficiencia de la extracción, las propiedades físicas y el análisis de la composición química del AE por CG/EM se presentan en la tabla 1 y 2.

La actividad antioxidante del AE de P. amboinicus, se evaluó por tres métodos diferentes: DPPH•, ABTS•⁺ y ORAC. Los antioxidantes pueden actuar por múltiples mecanismos, dependiendo del sistema de reacción o de la fuente radicalaria u oxidante utilizada.²⁰ Los resultados se expresan como actividad antiradical o IC₅₀, la cual está definida como la concentración del antioxidante que disminuye la absorción del radical a un 50% de la cantidad inicial.²¹

El valor IC₅₀ mide la capacidad captadora de radicales ABTS^•+ o DPPH^• de los AE con respecto a un estándar antioxidante como el ácido ascórbico, el cual cede un hidrógeno, produciéndose una transferencia de electrones de doble enlace, hacia el oxígeno, que sufrió la pérdida de un electrón, repitiendo la misma acción en el siguiente átomo de oxígeno, que sufrió la pérdida del átomo de hidrógeno, hasta establecerse el equilibrio de energía. De acuerdo a esta reacción, el ácido ascórbico cede dos hidrógenos.²²

En la tabla 3 se presentan los resultados obtenidos en la determinación de la capacidad antioxidante de las muestras provenientes de los AE extraídos por los métodos HD y MWHD analizadas por los métodos DPPH^•, ABTS^•+ y ORAC.

 

DISCUSION

Los AE de la especie vegetal obtenidos por los dos métodos de extracción presentaron propiedades físicas en común, tales como: olor intenso y característico, líquidos a temperatura ambiente, arrastrables por vapor de agua e insolubles en ella, rango de color amarillo pálido a intenso.

Con respecto al rendimiento se encontraron diferencias estadísticas significativas por ambos métodos; cabe resaltar que para MWHD, además de utilizar menos tiempo de extracción, mostró un porcentaje de rendimiento mayor que el valor obtenido por el método de HD, esto posiblemente puede atribuirse a que las microondas involucran un flujo de calor más eficiente que el obtenido por los métodos clásicos de calentamiento conductivo, las microondas pueden calentar toda la muestra casi simultáneamente y a un ritmo muy alto, generando un menor consumo de energía.^9-12,23

La prueba de solubilidad en etanol al 70 % fue positiva para los diferentes AE obtenidos ambos métodos. El comportamiento de solubilidad es semejante al reportado por Torrenegra;¹⁰ lo anterior, se debe principalmente al contenido de compuestos oxigenados en los AE. La presencia de compuestos oxigenados aumenta la afinidad por el solvente y, adicionalmente, los aldehídos y alcoholes poseen la capacidad de formar puentes de hidrógeno; por tal razón, el contenido de compuestos oxigenados, además de proveer las notas aromáticas agradables a los AE, aumentan su solubilidad en etanol haciéndolos más aptos para su aplicación en la industria.^2,10

Los resultados de los análisis de CG/EM indican que en ambas metodologías se obtienen componentes que aparecen a un mismo tiempo de retención y con un porcentaje de abundancia relativa similar.

Muñoz-Acevedo y otros encontraron como componente mayoritario del aceite esencial de Plectranthus amboinicus al carvacrol (53,7 %), ⁶ resultado que este compuesto está presente en el perfil cromatográfico mostrados y es el componente mayoritario igualmente.

Sin embargo es visible una pequeña variación con respecto a los componentes minoritarios encontrados por Muñoz-Acevedo,⁶ ocasionado por el efecto de diferentes factores ambientales sobre el contenido de compuestos en plantas medicinales.^2,10,12 La intensidad de la luz y el fotoperíodo, que varían de región en región; época de recolección y edad de las plantas afectan la composición del aceite esencial.²⁴

Castillo et al²⁵ y Loziene et al²⁶ encontraron que la oxidación del AE de orégano es dependiente del contenido de timol y carvacrol. Por su parte, el grupo de Yanishlieva y Marinova²⁷ informa sobre algunos aspectos del mecanismo y la cinética de la oxidación de diferentes sistemas lipídicos inhibidos por la presencia timol y carvacrol, hallando mayor efectividad del timol, debido a la mayor estabilidad del radical timoil, originada por el efecto inductivo del grupo isopropil localizado en la posición orto con relación al grupo hidroxilo.

Los resultados de la actividad captadora de radicales DPPH^• y ABTS^•+ del AE de P. amboinicus obtenido por los dos métodos de extracción variaron entre 240,3 y 327,5 µg/mL para el DPPH•, y de 23,97 a 29,08 µg/mL para el ABTS^•+. De los dos AE que se estudiaron el más promisorios, debido a que mostró actividad significativa, fue el AE de P. amboinicus obtenido por HD. Es posible inferir que cada técnica de extracción por sus condiciones de reacción y solubilidad propicie la existencia de diversos compuestos con potencial antioxidante en la mezcla.

Los resultados muestran que para los dos AE los valores obtenidos con el ABTS^•+ y expresados como µg/mL, son menores que los obtenidos con la técnica del DPPH^•; el método de la decoloración del catión-radical ABTS ^•+ es aplicable a antioxidantes lipofílicos e hidrofílicos lo que le permite ser implementado para sistemas tanto acuosos como lipofílicos,^17,28,29 además, el ABTS es muy soluble en agua y químicamente estable,^30-32 en cambio, el DPPH^• solo puede disolverse en medio orgánico por lo que mide preferentemente la capacidad antioxidante de compuestos poco polares o no polares.³²

La mayor actividad antioxidante se obtuvo para el AE de P. amboinicus obtenido por HD. El valor ORAC lipofílico e hidrofílico fue de 682 952,60 y 392 918,53 µmol trolox/100 g de muestra, respectivamente. El resultado anterior demuestra que este AE tiene una alta capacidad de inhibir la decoloración de la molécula de fluoresceína.

La mayor actividad antioxidante del AE de P. amboinicus se obtuvo por el método ORAC lipofílico, obteniéndose el menor valor de decoloración que representa la mayor actividad antioxidante con un valor de 682 952.60 µmol trolox/100 g de muestra, este valor supera los reportados en la literatura para muchas frutas, vegetales, aceites y legumbres.^18,19,33,34

Se puede decir que el rendimiento del AE de P. amboinicus es dependiente del método de extracción utilizado para su obtención. El mayor contenido de AE se obtiene cuando se emplea la extracción mediante hidrodestilación asistida por microondas (MWHD), en comparación con el método de hidrodestilación (HD) y químicamente el aceite esencial contiene mayoritariamente monoterpenos siendo el carvacrol el que se encuentra con un mayor porcentaje de abundancia relativa, destacando que AE obtenido por HD presentó resultados promisorios; lo cual, convierte a este AE, en un excelente activo para el diseño de productos magistrales con actividad antioxidante.

 

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a la Universidad de Cartagena por facilitar espacio, recursos y tiempo de los investigadores.

 

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Recibido: 7 de febrero de 2015.
Aprobado: 21 de abril de 2015.