Instituto de Gastroenterología

Perfil inmunológico de enfermedades inflamatorias del intestino

Lic. Georgina Rousseau González,¹ Lic. Lucas Collazo Borrego,² Lic. Elizabeth Somoza Soto,³ Dra. Elvira Borbolla Busquets⁴ y Dra. Graciela Jiménez Mesa⁵

1. Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada.
2. Licenciado en Ciencias Biológicas. Investigador Auxiliar.
3. Licenciada en Matemáticas. Aspirante a Investigadora.
4. Especialista de II Grado en Gastroenterología. Investigadora Agregada.
5. Especialista de II Grado en Gastroenterología. Investigadora Titular.

RESUMEN

Se estudió la función linfocitaria mediante la activación de los linfocitos en cultivo por efecto de la fitohemaglutinina y las distintas poblaciones linfoides en sangre periférica. Se cuantificaron las inmunoglobulinas séricas y la IgA, IgG e IgM. Se determinaron los niveles de inmunocomplejos circulantes en 22 pacientes con enfermedad de Crohn y 23 con colitis ulcerativa, de ambos sexos, con diagnóstico clínico, endoscópico, radiológico e histológico. No se observaron alteraciones de la actividad linfocitaria en ninguno de los 2 grupos estudiados, hubo disminución de las subpoblaciones T3 (CD3) y T4 (CD4) en ambos grupos, la cual resultó significativa para el grupo con colitis ulcerativa. La IgA y la IgM tendieron a estar elevadas, así como los inmunocomplejos circulantes.

Palabras clave: ENFERMEDAD DE CROHN/inmunología; COLITIS ULCERATIVA/inmunología.

INTRODUCCION

La etiología y patogenia de las enfermedades inflamatorias del intestino aún son desconocidas.1,2 Algunas manifestaciones extraintestinales como la artritis, púrpura trombocitopénica, eritema nodoso, anemia hemolítica autoinmune, así como la respuesta terpéutica a glucocorticoides y a la azatioprina indican que el sistema inmune desempeña un papel importante en ellas.3

Pallone et al. plantean que cada día existe mayor evidencia de que los mecanismos inmunológicos pueden resultar importantes en la patogénesis del daño del tejido en la enfermedad de Crohn y que en dicha enfermedad existe un desbalance de las células T reguladoras. Se plantea además que en estos pacientes existe una activación inmune crónica, tanto dentro como fuera del intestino, se desconoce aún el origen y la función de las células T preactivadas, definidas por la expresión de los antígenos de activación precoz que se han encontrado en este grupo de pacientes.4

Teniendo en cuenta el papel que desempeñan los linfocitos T en los mecanismos inmunológicos y conociendo la participación de las inmunoglobulinas en la patogenia de las enfermedades inflamatorias del intestino nos propusimos en el presente trabajo, estudiar la función de los linfocitos T de sangre periférica mediante su activación con el mitógeno fitohemaglutinina (PHA) en la enfermedad de Crohn (EC) y en la colitis ulcerativa idiopática (CUI), analizar las distintas subpoblaciones de linfocitos T en sangre periférica en ambos grupos de pacientes y evaluar los niveles de inmunoglobulinas séricas (IgA, IgM e IgG) y de los inmunocomplejos circulantes (IC).

MATERIAL Y METODO

Se estudiaron 22 pacientes adultos de ambos sexos con enfermedad de Crohn y 23 con colitis ulcerativa idiopática cuyo diagnóstico se determinó por criterios clínicos, endoscópicos, radiológicos e histológicos. Como grupo control se estudiaron 45 donantes de sangre, supuestamente sanos, negativos al HIV y al AgsHB.

La población de linfocitos se aisló a partir de sangre heparinizada por el método de Boyum mod. por centrifugación sobre un gradiente de densidad de Ficoll-Visotrast.5

Se cultivaron los linfocitos en placas de 96 pozos en medio de cultivo 199 al 10 % de suero fetal bovino con estímulo de PHA (10 mg/mL) y sin él, a 37 oC y en atmósfera con 5 % de CO2, durante 72 horas. La activación linfocitaria se determinó por criterio de incorporación de timidinatritiada al DNA celular durante las últimas 6 horas de cultivo.6 Se determinó la actividad espontánea y posestímulo con PHA. Los resultados se expresaron en cuentas por minuto (cpm) y se calculó el índice de estimulación (IE) por la siguiente fórmula:

      X cpm cultivo estimulado con PHA   IE = ------------------------------------         X cpm cultivo control no estimulado

Las subpoblaciones linfocitarias se cuantificaron por la técnica de inmunofluorescencia indirecta mediante anticuerpos monoclonales ior-T3 (CD3), ior-T4(CD4) e ior-T8(CD8) producidos por el Centro de Inmunología Molecular (CIMAB), Ciudad Habana, Cuba. Los linfocitos aislados se incubaron con antiinmunoglobulina de ratón conjugada con fluoresceína. Los resultados se expresaron en porcentaje de células teñidas.

Las inmunoglobulinas séricas se cuantificaron por el método turbidimétrico, por el sistema ultramicroanalítico (SUMA).

Los inmunocomplejos circulantes se determinaron por el método de inmunoprecipitación en PEG-6000 al 3,7 %.7

Las pruebas se realizaron en ayunas y sin terapia con inmunosupresores, al menos durante 3 meses antes del muestreo. Las técnicas estadísticas utilizadas fueron: análisis de varianza de una vía, la prueba de hipótesis para proporciones y la t de Student con un nivel de significación alfa = 0,05.

RESULTADOS

En la figura 1 se muestra como la activación linfocitaria espontánea de los linfocitos en ambos grupos de pacientes, así como la activación después del estímulo con fitohemaglutinina no difirió de la observada en el grupo control. Cuando se calculó el índice de estimulación para cada grupo de estudio no hubo diferencia significativa entre ellos.

En cuanto al estudio de la cuantificación de las poblaciones linfocitarias, las subpoblaciones T3(CD3) y T4(CD4) disminuyeron, en ambos grupos con respecto al control, con una significación estadística para el grupo con CUI. No observamos diferencia significativa entre ambos grupos de estudio en ninguna de las subpoblaciones. La subpoblación T8 de los 2 grupos no difirió de la del grupo control (figura 2).

Los resultados de la cuantificación de las inmunoglobulinas séricas mostraron que ambos grupos se comportaron de forma similar en cuanto a este parámetro, sin diferencias significativas entre ellos (figuras 3 y 4). En ambos grupos se observó un elevado número de pacientes que tenían los niveles séricos de IgA e IgM elevados en comparación con el número de aquéllos que mantenían estas inmunoglobulinas en niveles normales (los rangos normales establecidos fueron de 1,40-2,60 y 0,75-1,25 g/L, respectivamente), esta diferencia resultó significativa para los niveles de IgA en ambos grupos de estudio.

Por el contrario, el número de pacientes que tenían las IgG elevadas fue menor que el de aquéllos que las mantenían en niveles normales (rango de normalidad establecido 8,55-14,65 g/L).

En la figura 5 se puede observar que los niveles de inmunocomplejos circulantes medidos en unidades de densidad óptica (do), en ambos grupos de pacientes, estuvieron elevados significativamente con respecto al nivel observado en el grupo control y que los niveles de IC de los grupos con EC y CUI no difirieron entre sí, estos fueron de 0,040 y 0,047 do, respectivamente. El 47 % de los pacientes con EC y el 62 % con CUI mostraron niveles elevados de inmunocomplejos circulantes.

DISCUSION

Una de las pruebas in vitro más frecuentemente utilizadas para valorar la función de los linfocitos T es la transportación blástica en respuesta a la fitohemaglutinina, lectina vegetal que tiene la propiedad de estimular la población de linfocitos T. La transformación blástica (TB) puede ser espontánea (sin ninguna activación mitogénica conocida) o activada (estimulada por mitógenos o antígenos).

Hasta el presente se han obtenido resultados muy contradictorios y diversos en los estudios realizados en las enfermedades inflamatorias del intestino.

En la CUI, la actividad espontánea de las células mononucleares de sangre periférica se ha presentado normal o incrementada.3,8,9 La actividad linfoblástica activada por mitógenos también ha tenido resultados diversos: en algunos estudios se mostró reducida cuando se activó con la máxima dosis de PHA,10 en otros, disminuida cuando se utilizaron la PHA y la concanavalina A (Con A) como agentes mitogénicos en las enfermedades inflamatorias.11 Por el contrario, Soppi et al.12 demostraron una actividad normal con estímulo de PHA. Los resultados de la TB por estímulo con diferentes antígenos también han sido diversos en la CUI.

En la enfermedad de Crohn también se ha obtenido la misma diversidad de resultados con respecto tanto a la actividad espontánea como a la estimulada de las células mononucleares periféricas. La espontánea en el síndrome de Crohn se comportó de forma normal o reducida.2,9 La actividad linfoblástica estimulada se mostró reducida cuando se activó con la PHA, la Con A y con el mitógeno de la fitolaca americana (PWM).11 En contraste con estos hallazgos, Davidsen y Kristensen 2,9 encontraron una actividad normal con estímulo de Con A.

En nuestro estudio, la capacidad de los linfocitos de activarse espontáneamente o frente a un estímulo no específico (PHA), en ambos grupos de pacientes, no difirió de la del grupo control, lo cual coincide con los resultados de otros autores,2,9,12 aunque dentro de cada grupo de estudio existieron pacientes con esta capacidad muy disminuida expresada tanto en su actividad posestímulo como a través del índice de estimulación calculado para cada uno.

Existen evidencias de que la capacidad de los linfocitos de activarse espontáneamente o en respuesta a un estímulo está en dependencia del estado nutricional del paciente, esta incapacidad se considera una consecuencia del deterioro del mismo, así como también de las terapias utilizadas en ellos.1,10,13

Los resultados reportados sobre la cuantificación de las poblaciones linfocitarias reflejan un desbalance de las células T4, se plantea su reducción, así como la de las T totales en sangre periférica, lo cual concuerda con nuestros resultados en ambas enfermedades.

Algunos autores han planteado que la reducción observada en sangre periférica de estas poblaciones se debe a una migración de estas células hacia las zonas afectadas del intestino para participar en diversos procesos a nivel del mismo.14

Danis y Heatley plantean que un rasgo característico de la CUI y de la EC es la densa infiltración de linfocitos en la pared intestinal.15

Nuestros resultados contradicen los de otros autores que han encontrado un aumento de células T4 y disminución de células T8 en sangre periférica de pacientes con CUI o Crohn en comparación con los controles sanos. Esto pudiera estar en dependencia del grado de actividad de la enfermedad o de la utilización o no de esteroides en su tratamiento, de las exacerbaciones clínicas de la enfermedad y sus remisiones.

Se ha reportado el aumento de IgA en ambos grupos de pacientes. La síntesis y secreción espontánea de IgA en estudios in vitro mostró un aumento marcado mientras que el de las de IgM e IgG fue moderado.16

Una posible explicación a estos resultados es que las células mononucleares en los pacientes con enfermedades inflamatorias del intestino poseen células intestinales capaces de madurar en células productoras de IgA que emigran y permanecen en la sangre periférica en vez de volver al intestino o a la penetración de agentes que provocarían una respuesta inmune sistémica.15

El nivel de inmunoglobulinas circulantes es el resultado de muchos factores contribuyentes, incluyendo síntesis, catabolismo y pérdida.17

Otros investigadores apuntan sobre la importancia del estudio acerca de los cambios en la síntesis y producción de las diferentes clases de inmunoglobulinas y de sus células productoras al nivel intestinal, le dan mayor valor a dichos estudios que a los que se realizan al nivel de sangre periférica.15,17-19

El aumento de IgA e IgM en nuestros pacientes pudiera explicar la aparición en ellos de inmunocomplejos circulantes en el 62 % con CUI y en el 47 % con EC lo que pudiera reflejarse en la aparición de manifestaciones sistémicas en los 2 grupos de pacientes.19

Estudios posteriores más profundos deberán tomar en cuenta factores tales como tiempo de evolución de la enfermedad, extensión de la lesión, estado clínico del paciente en el momento del estudio, actividad de la enfermedad, estado nutricional y tratamiento. Recomendamos también futuras investigaciones en las que se compare el comportamiento de los parámetros inmunológicos estudiados a nivel de sangre periférica y en el tejido intestinal afectado en ambos grupos de pacientes.

CONCLUSIONES

La función de los linfocitos T, evaluada por su activación con PHA se comportó normalmente en los pacientes con colitis ulcerativa idiopática y enfermedad de Crohn.

El estudio de las subpoblaciones de linfocitos nos permitió conocer que estos pacientes presentaron una tendencia a disminuir las poblaciones T3 y T4, esta disminución fue altamente significativa en pacientes con CUI.

Los sujetos que padecían ambas enfermedades mostraron alteraciones de la inmunidad humoral. Aumentaron las inmunoglobulinas séricas a predominio de la IgA y los inmunocomplejos circulantes.

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Reciido: 4 de noviembre de 1993. Aprobado: 20 de octubre de 1994.

Lic. Georgina Roosseau González. Instituto de Gastroenterología, calle 25 entre H e I, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.