Trabajos Originales

Instituto de Neurología y Neurocirugía. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras"

Caracterización de deleciones en el gen responsable de la distrofia muscular de Duchenne: su frecuencia en pacientes cubanos

Lic. Mayra Rodríguez Hernández,¹ Lic. Raúl Ferreira Capote,² Dr. Luis Alberto Gayol Mecías¹ y Dr. Ricardo Santiago Luis González¹

1. Instituto de Neurología y Neurocirugía.
2. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".

RESUMEN

La distrofia muscular de Duchenne es la más común y grave de las distrofias musculares, afecta a 1 de cada 3 500 varones nacidos vivos y provoca la muerte en la segunda o tercera década de vida. Con nuestro trabajo nos propusimos calcular la frecuencia con que se encuentran las delecciones en el gen (DMD) como causa más común de la enfermedad y su caracterización. Se empleó la técnica del PCR multiplex. Se estudiaron 30 individuos con diagnóstico de DMD. En el 53 % de los casos se presentó una delección en el gen DMD y el 87 % de las delecciones detectadas estuvieron localizadas en la región 3' del gen DMD, particularmente el 62,5 % de ellas involucraban los exónes 48-51 de dicho gen.

Palabras clave: DISTROFIA MUSCULAR/genética; DELECION CROMOSOMICA; CROMOSOMA X/genética; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA/métodos; CUBA.

INTRODUCCION

La más común de las distrofias musculares es la de Duchenne (DMD), enfermedad letal ligada al cromosoma X con una incidencia global de 1 por cada 3 500 varones nacidos vivos.¹

El gen responsable de esta enfermedad (gen DMD) está localizado en el brazo corto del cromosoma X (región Xp 21) y su aislamiento a finales de la década del 80 ² ha permitido obtener valiosa información sobre su estructura y organización funcional: es el gen más grande y complejo hasta ahora conocido, con 2 500 kb de longitud y con cerca de 77 exones que representan menos del 1 % de la longitud total del gen³

Además, se ha aislado el producto proteico codificado por este gen, denominado distrofina, con un tamaño de 427 kDa,⁴ y se ha demostrado su presencia en distintos tejidos con sus isoformas específicas.⁵

Una importante característica del gen DMD es que la deleción es el defecto génico más frecuente,⁶ con incidencias de hasta el 70 % en algunas poblaciones estudiadas.

Estas deleciones son muy heterogéneas, tanto en su ubicación como en su longitud. Algunas involucran a todo el gen, mientras que en la mayoría de los casos es sólo una deleción parcial de tamaño variable, aunque con regiones hot spot en el gen (con mayor frecuencia de mutaciones) bien caracterizadas.

La caracterización de las deleciones en el gen DMD es de gran importancia para esclarecer la patogénesis de la enfermedad; no obstante, aunque se han realizado muchos estudios para tratar de correlacionar el tipo de deleción con el cuadro clínico de la DMD, no se ha podido establecer ninguna conclusión,⁷ con lo cual se ha demostrado la complejidad de la relación genotipo-fenotipo en esta enfermedad.

Es de gran valor conocer la frecuencia de deleciones en una población determinada para definir qué estrategia se establecerá para prevenir la enfermedad. En aquellas poblaciones con alta incidencia de deleciones es recomendable, desde el punto de vista técnico y económico, implantar una estrategia para el diagnóstico prenatal y de portadoras, basada principalmente en la detección de deleciones. La posibilidad que reporta la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de detectar reordenamientos estructurales discretos, ha hecho de ella la técnica por excelencia para detectar deleciones en el gen DMD debido a su sencillez, bajo costo y sensibilidad, entre otras ventajas. No obstante, la heterogeneidad de las deleciones antes mencionadas es una desventaja para su aplicación rutinaria, pues la detección del 100 % de las deleciones exigiría realizar un considerable número de reacciones, lo cual aumentaría extraordinariamente el costo del análisis.

Chamberlain et al.,⁸ desarrollaron una estrategia que permite la expansión del PCR con estos fines. Describieron un PCR múltiple para detectar deleciones en el gen DMD, donde 9 regiones específicas de este gen, que incluyen las regiones hot spot, se analizan simultáneamente en una misma reacción. Este método permite detectar el 80 % de todos los genes delecionados.

En este trabajo describimos los resultados obtenidos al estudiar, mediante el método de Chamberlain et al,⁸ la frecuencia de deleciones en el gen DMD en la población cubana y alguna información básica sobre su caracterización molecular.

MATERIAL Y METODOS

Estudiamos 30 pacientes, no emparentados, con diagnóstico de DMD en el Instituto de Neurología y Neurocirugía (INN) sobre la base de CPK elevada, biopsia positiva, electromiografía miopática e hipertrofia muscular.

Como individuos controles seleccionamos hombres sanos sin antecedente familiar de DMD.

Para detectar deleciones, utilizamos el método descrito por Chamberlain et al.,⁸ con la siguiente modificación: en vez de realizar la amplificación de las 9 regiones seleccionadas en una misma mezcla de reacción, las dividimos en 3 mezclas, cada una de ellas desarrollada independientemente, con vistas a mejorar la eficiencia de la reacción y facilitar la detección mediante electroforesis de los fragmentos amplificados. La primera mezcla está destinada a amplificar las regiones simbolizadas a, b, d y h; la segunda, a las regiones c, e, i, y g y la tercera, a las regiones d y f. En la figura 1 se representa esquemáticamente el gen DMD, con la localización de cada una de las 9 regiones que se amplifican con este método.

FIG. 1

RESULTADOS

Los patrones electroforéticos obtenidos en individuos controles y algunos pacientes con DMD se ejemplifican en la figura 2 (A, B y C) independientemente para las 3 mezclas de reacción empleadas. En todos los casos, los controles (individuos normales) presentan todos los fragmentos esperados. La deleción se expresa mediante la ausencia de al menos 1 de los fragmentos esperados.

De los 30 pacientes estudiados, 16 presentaron deleción, en la figura 1 representamos las regiones cuya deleción detectamos en cada uno de estos individuos.

FIG. 2

No observamos ninguna deleción total del gen DMD, sino que todas fueron parciales. Como era de esperar, el tamaño de las deleciones no fue homogéneo. En 10 de los pacientes la deleción sólo incluía una de las 9 regiones estudiadas, mientras que en los restantes, fue de 2, 3 ó 4 regiones (2 pacientes en cada caso).

De las 9 regiones analizadas, las más frecuentemente involucradas en deleciones fueron la h (correspondiente al exón 51) y la f (exón 48), ausentes en 9 y 6 pacientes, respectivamente.

En cuanto a la distribución espacial de las deleciones en el gen DMD, observamos mayor incidencia en la región próxima al extremo 3' del gen, que correspondió a las deleciones de 14 pacientes.

DISCUSION

La confiabilidad del método utilizado se demuestra por la detección, de todos los fragmentos esperados en los individuos controles.

En nuestro estudio detectamos deleciones en 16 de los 30 pacientes analizados, lo cual nos permite considerar que en el 53 % de los enfermos con DMD, incluidos en nuestro trabajo, se pudieran detectar deleciones y, por tanto, brindar la posibilidad de comunicar un diagnóstico prenatal a los familiares de las embarazadas con riesgo de padecer de DMD. Esta cifra es muy similar a la frecuencia de deleciones detectada por Chamberlain et al.,⁸ por el método que ya nosotros empleamos.

No obstante, esta cifra no puede considerarse como indicador de la frecuencia de deleciones DMDen la población cubana, pues el método utilizado no es capaz de detectar todas las deleciones posibles de presentarse en el gen DMD. Chamberlain et al.⁸ demostraron que este método es capaz de detectar el 80 % de las deleciones DMD descritas hasta el momento. Si consideramos esta cifra como válida, entonces la frecuencia de deleciones DMD en nuestra población será de aproximadamente el 66 %.

En otros estudios se han reportado valores similares de frecuencia de deleciones en el gen DMD. En general, la frecuencia de deleciones en diferentes poblaciones oscila entre el 60 y el 70 %.^3,9-11

En el 86,7 % de nuestros pacientes (14 de 16), la deleción está localizada en la región próxima al extremo 3' del gen DMD, lo cual coincide con los resultados obtenidos por otros autores.^7,9,10

La región del gen DMD que incluye los exones del 47 al 53 es considerada un hot spot que está involucrada en, al menos, el 57 % de las deleciones.¹²

Nuestros resultados confirman el carácter hot spot de esta región. En el 68 % de nuestros pacientes con deleciones, al menos 1 de los 2 exones analizados correspondientes a este hot spot (región h, exón 51 y región f, exón 48) está delecionado. Estos resultados son de gran valor para fines diagnósticos, pues mediante el análisis de sólo estos 2 exones pudiera realizarse el diagnóstico prenatal directo en el 37 % de los embarazos con riesgo de DMD.

Nuestros resultados indican la conveniencia de implantar una estrategia de prevención de la DMD basada en la búsqueda inicial de deleciones en las familias con riesgo. De esta forma podría brindarse el diagnóstico prenatal directo a las mujeres con riesgo en aproximadamente el 50 % de las familias afectadas, sin necesidad de acudir a los complejos y costosos métodos indirectos basados en el análisis de ligamento con marcadores de DNA.

Sería útil en estudios posteriores poder evaluar la conveniencia desde el punto de vista técnico-económico de incluir el análisis mediante PCR de otros exones del gen DMD con vistas a ampliar las posibilidades de detección de deleciones. Por ejemplo, Beggs et al.¹³ plantean que la incorporación de otros 9 exones al método descrito por Chamberlain et al.⁸ aumenta al 98 % la posibilidad de detectar deleciones. No obstante, esto encarece de forma considerable el método y lo hace más complejo, técnicamente.

SUMMARY

Duchenne muscular dystrophy is the commonest and most serious of all muscular dystrophies affecting 1 out of 3 500 live born males and resulting in death within the second or third decade of life. This work was aimed at estimating the frequency of deletions in the DMD gene as the commonest cause of the disease and its characterization. The multiplex PCR technique was used in this study. A number of 30 individuals presenting with Duchenne muscular dystrophy were studied. A deletion in DMD gene was observed in 53 % of cases, while deletions detected in 87 % of patients were located in the region 3' of DMD gene, particularly, exons 48-51 of such gene were involved in 62.5 % of cases.

Key words: MUSCULAR DYSTROPHY/genetics; CHROMOSOME DELETION; X CHROMOSOME/genetics; POLYMERASE CHAIN REACTION/methods; CUBA.

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Recibido: 31 de octubre de 1995. Aprobado: 7 de noviembre de 1996.
Lic. Mayra Rodríguez Hernández. Instituto de Neurología y Neurocirugía. Laboratorio de Genética. Calle 29 y D, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.