Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Citotoxicidad natural inducida por la activación de linfocitos T en pacientes con cáncer de mama

Dra. María del C. Arango Prado,1 Dra. María E. Faxas García,2 Lic. Yoselín Pérez Dehanay,3 y Dr. Rolando Camacho Rodríguez4

Resumen

Se estudió en un grupo de 12 pacientes con cáncer de mama (5 pacientes de estadio IIa, 2 de estadio IIb, 2 de estadio III y 3 de estadio IV) la capacidad de los mediadores solubles liberados durante la activación de linfocitos T para potenciar la respuesta de citotoxicidad natural. Dicha activación se realizó con los anticuerpos monoclonales (AcMs) IORT3 e IORTL, anti-CD3 y anti-CD6 respectivamente. Como resultado se observó una disminución de la actividad citotóxica de células mononucleares periféricas inducida por los mediadores liberados durante la activación CD3/CD6 en las pacientes principalmente en los estadios más avanzados (III y IV), lo que difiere totalmente de lo analizado en controles sanos y en la mayoría de las pacientes en estadio II.

DeCS: NEOPLASMAS DE LA MAMA/inmunología; LINFOCITOS T CITOTOXICOS; ANTICUERPOS MONOCLONALES; CELULAS KILLER NATURALES.

El papel de la inmunocompetencia en pacientes con cáncer de mama es controversial y los resultados de diferentes investigadores no son concluyentes. En general, existe una inmunodeficiencia celular progresiva más evidente en los estadios avanzados que se caracteriza por una disminución en número y función de los linfocitos T1 una depresión en la función de los monocitos/macrófagos, compromiso de la actividad citotóxica de células (Natural Killer / asesinas naturales NK), disminución de los efectos líticos de los linfocitos citotóxicos y disminución de la actividad de las células (Lymphokine-activated killer cells / células asesinas activadas por linfocinas LAK).2,3 Todas estas alteraciones parecen estar asociadas con influencias inmunosupresoras entre las que se destacan las citocinas supresoras (IL10, TGF b) y otros factores séricos.4,5

El inicio de la respuesta inmune antitumoral requiere de la interacción del T Cell Receptor/Receptor de células T (TCR) con el antígeno en el contexto del Major Histocompatibility Complex/Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) y además de moléculas coestimulatorias. La posibilidad de que estas moléculas sirvan como una vía alternativa de activación T es de gran importancia para la inmunología tumoral ya que la pobre inmunoestimulación de las células tumorales puede deberse a trastorno en las adecuadas señales coestimulatorias.6 Una de estas moléculas accesorias es la CD6, involucrada en la activación de los linfocitos T.

La molécula CD6 se expresa fundamentalmente en las células T maduras; es una glicoproteína de 105-130 kD y su ligando es el ALCAM (molécula de adhesión de los leucocitos activados).7-9 Los resultados con diferentes AcMs que reconocen el CD6 muestran que esta molécula participa como molécula coestimulatoria en los mecanismos de activación de la célula T y este efecto depende del epítope específico involucrado en el proceso de activación aunque se desconoce cómo la molécula CD6 transduce la señal. El AcM IOR-T1 (CIMAB, Cuba) identifica y define un nuevo epítope conformacional dentro de la molécula CD6, localizado probablemente en la estructura primaria. Este anticuerpo induce proliferación de las células T estimuladas con cantidades subóptimas del AcM CD3 OKT3.10

La transducción de señales adecuadas para la activación T, proveniente de las interacciones antígeno/MHC-TCR y moléculas coestimularorias genera finalmente en el linfocito la producción de citocinas como la interleucina 2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN g), las cuales pueden actuar en diversas etapas de la respuesta inmunitaria y algunas tienen una importante función en la potenciación de los mecanismos citotóxicos, en su totalidad mediados por células NK.11,12

Por todo lo antes discutido, se propuso con esta investigación explorar la influencia de los mediadores solubles liberados por los linfocitos T, (durante la activación vía CD3/CD6) de pacientes con cáncer de mama, sobre la activación citotóxica de células efectoras de controles sanos.

Se incluyeron 12 pacientes procedentes del Servicio de Mastología del INOR, que cumplieron con los criterios de inclusión siguientes: diagnóstico confirmado de cáncer de mama debidamente clasificado por estadios según criterios del pTNM,13 edades entre 30 y 70 años, sexo femenino, sin tratamiento oncoespecífico previo y sin otra enfermedad crónica, séptica o endocrino-metabólica. Se incluyó además, un grupo control de 5 donantes voluntarias, aparentemente sanas, con edades entre 30 y 70 años, sin antecedentes patológicos personales, tratamiento con medicamento alguno, ni enfermedad conocida.

Procedimientos

Se obtuvieron 20 mL de sangre con EDTA al 10 %, recolectada en tubos de sistema vacutainer (Becton Dickinson), de la vena cubital del brazo contrario al proceso tumoral. Las células mononucleares periféricas (CMP) fueron obtenidas por centrifugación en gradiente de densidad 1 077 g/mL (Histopaque 1 077 -Sigma-) según método de Böyum14 y ajustadas a 1 × 106 cel/mL en medio RPMI 1640 (Gifco) con 10 % de un pool de suero AB, posteriormente fueron incubadas en placas Petri de 5 cm de diámetro a razón de 1 ´ 106 cél/cm de diámetro (1 mL/cm de diámetro), a 37 °C, con 5 % de CO2 en aire durante 90 min con el objetivo de depletar los monocitos que quedan adheridos a la placa; las células no adherentes (linfocitos) fueron ajustados a 1 ´ 106 cél/mL de medio cultivo.

Activación in vitro de los linfocitos utilizando el entrecruzamiento de los AcM antiCD3/antiCD6. Obtención de los mediadores de dicha activación

Las placas de 96 pozos de fondo en U (NUNC) se recubren con 50 mL/pozo de anti-IgG de ratón a una concentración de 10 mg/mL en tampón de recubrimiento (carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6), se incubaron durante toda la noche a temperatura de 4 °C. Con posterioridad se realizaron 4 lavados con SSTF y se secaron adecuadamente los pozos utilizando papeles de filtro estériles.

Para realizar el sistema de "entrecruzamiento" del AcM IOR-T3 (anti-CD3) y el AcM IOR-T1 (anti-CD6) se utilizaron las concentraciones de estos anticuerpos monoclonales (CIMAB, SA, Cuba) definidas previamente (0,01 mg/mL del AcM anti-CD3 y 0,1 µg/mL del AcM anti-CD6). Estos AcMs se añadieron en las placas previamente absorbidas a razón de 50 mL de la dilución de un AcM + 50 mL de la dilución del otro AcM y al final se adicionaron 105 células/pozo en 100 mL. Los controles utilizados fueron: IgG anti-ratón + células, IgG anti-ratón + anti-CD3 + células e IgG anti-ratón + anti-CD6 + células. Después se procedió a incubar la placa a 37 °C, con 5 % de CO2 en aire y atmósfera húmeda durante 72 h. Finalmente, los sobrenadantes del cultivo celular, en donde debían encontrarse los mediadores de la activación T fueron recolectados, centrifugados, filtrados y conservados a -70 °C.

Para evaluar la capacidad de los sobrenadantes o mediadores de inducir citotoxicidad, las CMP obtenidas de donante sano fueron ajustadas a 4 ´ 106 cel/mL, según procedimiento antes descrito y la suspensión celular obtenida fue dispensada en los pozos de placas de cultivo de 12 pozos, a razón de 1 mL/pozo y seguidamente se le adicionó 1 mL/pozo de los sobrenadantes (mediadores) conservados de las 12 pacientes. Se dispensaron los sobrenadantes de la activación vía CD3 y los sobrenadantes de la activación vía CD3/CD6 de cada paciente y de cada control analizado. Además se incubaron células solamente con medio para ser utilizadas como control de células no estimuladas. Esta placa se cultivó durante 48 h, a 37 °C y atmósfera con 5 % de CO2 en aire, posteriormente las células fueron recolectadas, lavadas y ajustadas de manera independiente a 4 ´ 106 cel/mL para ser utilizadas en el ensayo de citotoxicidad.

El ensayo de citotoxicidad natural de células mononucleares mediante marcaje isotópico (actividad NK) se realizó según técnica habitual,15 las células anteriores (efectoras) fueron ajustadas a 4 ´ 106 células/mL de medio RPMI 1640 + 10 % suero fetal (sigma). Se utilizó como célula blanco la línea eritroleucémica K562 a la que se le añadió una solución de Cr51 (cromato de sodio, solución PB. Amersham, UK) a razón de 100 mci/ 2 ´ 106 células, las cuales finalmente fueron ajustadas a una concentración de 104 células/pozo. Las células efectoras y diana se enfrentaron 4 h a 37 °C en 5 % de CO2 en placas de 96 pozos fondo en U; se establecieron 4 relaciones efectoras-dianas 40:1; 20:1; 10:1 y 5:1 en un volumen final de 200 mL/pozo, se colectaron los sobrenadantes y se midió la radiactividad en contador de radiaciones gamma durante 1 min.

Se estableció un índice de citotoxicidad (IC) en % para cada relación de las CMP diana, según la fórmula: IC = (LE - L0) / (LT - LO) ´ 100 donde: LE: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis experimentales, LO: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis espontáneas y LT: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis totales obtenida por destrucción celular con detergente tritón 5 %. Posteriormente se calcularon los valores de unidades líticas (UL) a partir de los IC, éstas se definen como la cantidad de células efectoras que lisan un porcentaje de células dianas predefinido por el investigador (30 %) por cada 1 millón de células efectoras. Dada su complejidad se realizó el cálculo mediante sistema automatizado creado al efecto, en el Laboratorio de Inmunología Clínica del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.

Resultados

La figura 1 muestra que los mediadores de activación liberados por los linfocitos de controles sanos aumentan las UL por encima del valor encontrado de actividad citotóxica sin mediador que fue de 7,62 UL. Sin embargo, el comportamiento en pacientes difiere en su mayoría del observado en los controles de la figura 2. Los mediadores de la activación vía CD3/CD6, provenientes de los pacientes 3, 6, 7 y 8 (estadios IIa, IIb, IIb y IIIa, respectivamente) no aumentaron la actividad citotóxica, por el contrario parecen tener un efecto inhibidor. Sin embargo, el sobrenadante obtenido por la activación vía CD3 sí aumentó la citotoxicidad.

Fig. 1. Citotoxicidad natural inducida por mediadores de activación I procedentes de controles.

 

Fig. 2. Citotoxicidad natural inducida por mediadores liberados durante la activación I, procedentes de pacientes.

En los pacientes 9 (estadio IIIb) y 10, 11 y 12 (estadio IV) la citotoxicidad inducida con mediadores de ambas vías está por debajo de las UL de citotoxicidad sin mediadores, por lo que parece haber existido una inhibición de la capacidad citotóxica de las células efectoras.

Discusión

Los resultados mostrados en los controles pueden ser explicados porque las citocinas presentes en dichos mediadores como IL2, IFN g6,11 lograron potenciar la función efectora de citotoxicidad natural, la cual es mediada fundamentalmente por las células NK.16,17 Se sabe que el AcM IOR-T1 reconoce un epítope dentro de la molécula CD6 el cual tiene participación en los mecanismos de activación a través de las proteínas kinasas con la inducción posterior de la síntesis de RNAm para la II-2 y por ende desempeña un papel importante en los mecanismos de la respuesta inmunitaria de las céluas T.10,18,19 Las céluas T en reposo presentes en la sangre periférica pueden ser inducidas a proliferar por unión cruzada del AcM IOR-T1 y de la molécula CD28, a través de una vía independiente del antígeno.20

Los resultados en el grupo de pacientes pueden ser explicados en parte por el compromiso en la respuesta celular de estas y como se explicaba anteriormente, por la liberación de citocinas supresoras de la respuesta inmunitaria (IL10, L4, TGFb). Estas citocinas pudieran estar presentes en los sobrenadantes recolectados y actuar sobre células NK que causan una depleción física y/o funcional.5,6,11

Un resultado interesante fue el obtenido en las pacientes 3, 6, 7 y 8 (estadios IIa, IIb, IIb y IIIa) en las que se observó marcada diferencia entre la actividad citotóxica inducida por medidores obtenidos por vía CD3 y los obtenidos por vía CD3/CD6. Los mediadores de activación liberados por esta última vía no aumentaron la citotoxicidad de las células efectoras, por el contrario la inhibieron, sin embargo, los sobrenadantes obtenidos por la activación vía CD3 sí la aumentaron. Lo anterior puede ser consecuencia de un trastorno de la expresión de la molécula CD6 en la superficie del linfocito de estas pacientes y por tanto un trastorno en la activación linfocitaria con la insuficiente producción de citocinas y/o liberación de citocinas con actividad inhibitoria.

Se sabe que durante la activación de la célula T ocurren cambios significativos en la superficie celular, como por ejemplo la modulación y la expresión de nuevas moléculas de antígeno; estos cambios se asocian a introducción de estados transitorios de hiperfosforilación.11 Se ha planteado la existencia del CD6 en 2 estados en dinámico equilibrio: una forma desfosforilada (que se encuentra en células T en reposo) y otra fosforilada presente en células T activadas.10,18,19 Al igual que sucede con algunas integrinas más estudiadas, estos cambios conformacionales que ocurren en el CD6 durante la activación pueden reflejar la adquisición de una función que permanezca inactiva en el estado de reposo y que se adquiera con la activación celular; esta función podría ser citotóxica o de secreción de linfocinas que podrían actuar a otros niveles y garantizar así la competencia inmunológica del linfocito. La baja o aberrada expresión de esta molécula puede comprometer los mecanismos anteriores, e incluso en estas pacientes la estimulación de la vía CD3/CD6 pudiera provocar a través de algún mecanismo no definido, un aumento en el AMPc y la producción de citocinas supresoras, que sería responsable de los efectos inhibitorios sobre las células NK.20 No obstante, no se pueden dar conclusiones definitivas y será necesario continuar los estudios de esta molécula.

Summary

The capacity of the soluble mediators released during the activation of T lymphocytes to potentiate the response of natural cytotoxicity was studied in a group of 12 patients with breast cancer (5, stage IIa; 2, stage IIb; 2, stage III; and 3, stage IV) This activation was performed with IORT3, IORT1, anti-CD3 and anti-CD6 monoclonal antibodies, respectively. As a result, it was observed a reduction of the cytotoxic activity of peripheral mononuclear cells induced by the mediators released during CD3/CD6 activation mainly among patients in the most advanced stages (III and IV), which differs completely from what was analyzed in sound controls and in most of the stage II patients.

Subject headings: BREAST NEOPLASMS/immunology; T LYMPHOCYTES, CYTOTOXIC; ANTIBODIES, MONOCLONAL; KILLER CELLS, NATURAL.

Referencias bibliográficas

1. Wittschke C, Krainer M, Budinsky AC. Reduced mitogenic stimulation of peripheral blood mononuclear cells as a prognostic parameter for the course of breast: A prospective longitudinal study. Br J Cancer 1995;71(6):1292-6.
2. Schwartzentrubart DJ, Solomon D, Rosemberg SA. Characterization of lymphocytes infiltrating human breast cancer specific immune reactivity deleted by measuring cytokin secretion. J Immunotherapy 1992;12(1):320-60.
3. Arango MC, Llanes L, Moreno L, Faxas ME. Respuesta citotóxica natural en pacientes con cáncer de mama. Rev Cubana Oncol 1999;15(3):40-7.
4. Hadden JW. The immunology of breast cancer. Clin Immunother 1995;4(4):279-300.
5. Murray JS. How the MHC selects Th1/Th2 immunity, Immunol Today 1998;19(4):157-62.
6. Schreiber H. Tumor immunology. En: Paul W. Fundamental Immunology. 3. ed. New York: Raven Press Ltd, 1993. p.1143-78.
7. Cortés F, Deschasseaux F, Uchida N, Labastie MC, Fiera AM, He D, et al. HCA an immunoglobulin-like adhesion molecule present on the earliest human hematopoietic precurson cells is also expressed by stromal cells in blood-forming tissues. Blood 1999;93(3):826-37.
8. Bodian DL, Skonier JE, Bowen MA, Neubauer M, Sitadak AW, Aruffo A, Bajorath J. Identification of residues in CD6 which are critical for ligand binding. Biochemistry 1997;36:2637-41.
9. Skonier JE, Bowen MA, Aruffo Bajorath J. CD6 recognizes the neural adhesion molecule BEN. Protein Science 1997;6:1768-70.
10. Osorio LM, Ordoñez C, García CA, Jondal M, Chow SC. Evidence for protein tyrosine kinase involvement in CD6-induced T cell proliferation. Cell Immunol 1996;166:44-52.
11. Abbas KA. Immunity to tumors. En: Abbas KA, Lichtman AH, Pober JS. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: WB Saunders Company; 2000:384-403.
12. Sepulveda C, Puente J. Natural killer cells and the innate immune system in infections pathology. Rev Med Chil 2000;128(12):1361-70.
13. UICC. TNM Classification of Malignant Tumours. 5 ed. Edited by Sobin LH and Wittekind CH. A John Wiley and Sons, INC., Publication; 1997:123-130.
14. Böyum A. Ficoll-Hypaque method for separating mononuclar cells and granulocytes from human bloos Scand J Clin Invest 1968;121 (suppl. 97):710.
15. Wigzell H, Ramsted U. Natural killer cells. En: Weir DM ed. Handbook of experimental immunology. Oxford: Alden Press Vol 2. Cellular Immunol, 1986;60:1-5.
16. Lieberman N, Mandelboim O. The role of NK cells in innate immunity. Adv Exp Med Biol, 2000;479;137-45.
17. Lanier LL. The origin and functions of natural killer cells. Clin Immunol, 2000 Apr;95(1):14-8.
18. Osorio LM, De Santiago A, Aguilar-Santelises M, Mellstedt H, Jondal M. CD6 ligation modulates the Bcl-2/Bax ratio and protects chronic lymphocytic leukemia B cells from apoptosis induced by anti-IgM. Blood. 1997 Apr 15;89(8):2833-41.
19. Osorio LM, Rottenberg M, Jondal M, Chow SC. Simultaneous cross- linking of CD6 and CD28 induces T cell proliferation in resting. Immunol 1998;93:358-365.
20. Uotila P. The role of cyclic AMP and oxygen intermediates in the inhibition of cellular immunity in cancer. Cancer Immunol Immunother, 1996;43:1-9.

Recibido: 5 de septiembre de 2002. Aprobado: 23 de octubre de 2002.
Dra. María del C. Arango Prado. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Especialista de I Grado en Inmunología Clínica. Investigadora Agregada.
2 Especialista de II Grado en Inmunología Clínica. Doctora en Ciencias Médicas.
3 Licenciada en Bioquímica.
4 Especialista de II Grado en Oncología. Profesor Auxiliar.