Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Evaluación de la citotoxidad del trióxido de arsénico en líneas celulares tumorales humanas con la técnica colorimétrica de la sulforhodamina B

Dr. Relman Ruiz García,1 Lic. Alejandro Sánchez López,2 Dr. José Luis Bello Gárciga,3 Lic. Mayrelis Azcue Ferrara4 y Dra. Yamila Colom Loo5

Resumen

El trióxido de arsénico ha demostrado ser un inductor de apoptosis en líneas celulares de leucemia promielocítica aguda. Estudios clínicos han demostrado su efectividad en el tratamiento de esta enfermedad en pacientes refractarios al tratamiento con ácido retinoico. En este trabajo se determinó la actividad citotóxica de este producto frente a un panel de 3 líneas celulares tumorales humanas de tumores sólidos (M14, MCF7, HT-29) y una línea de leucemia promielocítica aguda, utilizando la técnica de la sulforhodamina B. Se realizaron 2 experimentos en los cuales las células fueron incubadas durante 48 h en presencia del producto. Las IC50 s obtenidas en ambos experimentos fueron: M14 (0,471 y 0,450 µg/mL), MCF7 (0,122 µg/mL), HT-29 (0,543 y 0,659 µ g/mL) y HL60 (0,487 y 0,351 µg/mL). Se concluyó que el trióxido de arsénico posee una marcada actividad citotóxica, no solo en la línea de leucemia promielocítica aguda, sino también, en las líneas de tumores sólidos humanos estudiadas por lo que se recomendó realizar un estudio de actividad antitumoral de este producto.

Palabras clave: Sulforhodamina B, citotoxicidad, líneas celulares tumorales humanas, adenocarcinoma de mama (MCF7), melanoma (M14), adenocarcinoma de colon (HT29) , leucemia promielocítica aguda (HL-60).

La leucemia promielocítica aguda (LPA) es una neoplasia caracterizada por una diferenciación anormal de las células mielocíticas. Está originada por la translocación recíproca de los cromosomas t(15,17) lo cual origina la fusión de los genes PML (gen de la leucemia promielocítica) y RAR a (gen del receptor de ácido retinoico) lo que da como resultado la síntesis de una oncoproteína quimérica PML/RAR a. Esta proteína actúa bloqueando la diferenciación mielocítica, pero permitiendo la maduración de mielocitos en presencia de niveles farmacológicos de ácido retinoico.1

El tratamiento de la LPA con los ácidos retinoicos ha demostrado ser muy efectivo con una respuesta inicial excelente, se observa remisión de la enfermedad en los primeros 2 meses de tratamiento. Sin embargo, el desarrollo de resistencia a este fármaco se ha convertido en una complicación de rutina y en el mayor problema clínico asociado a este tratamiento,2 por esto y en la búsqueda de terapias alternativas se ha propuesto el uso del trióxido de arsénico en el tratamiento de la enfermedad.

En este trabajo se determinó la actividad citotóxica del trióxido de arsénico en 4 líneas celulares tumorales humanas, utilizando la metodología descrita para la técnica de la sulforhodamina B.3

Métodos

Líneas celulares

En el estudio se emplearon 4 líneas celulares tumorales de origen humano: la M 14, melanoma,4 la MCF 7, adenocarcinoma de mama,5 la HT29, adenocarcinoma de colon6 y la HL-60 , leucemia promielocítica aguda.7

Reactivos

Todos los reactivos empleados fueron obtenidos de Sigma, Co. Ltd, St. Louis, Mo.

Cultivo de las líneas celulares

Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 (R-5382), suplementado con 10 % de suero de ternera fetal inactivado (STFi)(F-2442) a 56 oC de temperatura durante 30 min, L-Glutamina (2 mM )(G-6392), piruvato de sodio (1 mM) (S-8636). A este medio de cultivo se le denominó medio de cultivo estándar (MCE).

Los pases de las líneas celulares adherentes se realizaron cuando se observó 75 % de confluencia de las monocapas celulares, en el proceso de tripsinización se empleó una solución de tripsina-EDTA (T-4174) previo lavado de las monocapas celulares con una solución salina balanceada de fosfatos (PBS) pH=7,2, estéril. En el caso de la línea HL-60 de crecimiento en suspensión se realizó el cambio de medio y el reajuste de la concentración celular a 200 000 cél/mL, 2 veces por semana.

Solubilización y dilución de las muestras

Se prepararon 5 diluciones seriadas por un factor de dilución de 10, se empleó una concentración máxima de 500 µg/mL, la que se esterilizó con filtro Minisart (Sartorius, 16534) de diámetro de poro de 0,20 mm. De la droga que se empleó como control positivo (actinomicina-D) (A 9415), se hicieron 5 diluciones seriadas por un factor de dilución de 10, con una concentración máxima de 2 µg/mL.

Protocolo general de la prueba de citotoxicidad

Inoculación de las células

Las células se cosecharon de los cultivos en fase de crecimiento exponencial (frascos de 75 cm, 2 Costar cat. No. 3275) contadas por exclusión de azul tripán y dispensada de acuerdo con el protocolo descrito por Monks y otros,8 en placas de fondo plano de 96 pozos (Corning, cat. No. 25860) en un volumen de 100 µL de medio por pozo, a una concentración celular de 15 000 células por pozo de M14, HT29, 5 000 células por pozo de MCF7 y 20 000 células por pozo de HL-60. Después de un período de incubación de 24 h a 37 oC, 5 % de CO2, y 100 % de humedad relativa (incubadora de CO2) se realizó la adición de las muestras a estudiar.

Adición de los extractos e incubación de la muestras

Inmediatamente antes de la adición de las muestras se fijaron 2 placas de líneas celulares no tratadas y se fijaron con ácido tricloroacético al 50 % en el caso de las líneas celulares adherentes y al 80 % en el caso de la línea en suspensión, durante 1 h a 4 oC, como una medida del contenido de proteína celular en el tiempo de la adición de las muestras.

Las diluciones de otras soluciones stock de los productos a evaluar y de la droga empleada como control positivo se realizaron el mismo día de la prueba con medio de cultivo estándar (MCE) transfiriéndose 100-µL de cada dilución a su correspondiente pozo de una placa de 96 pozos (Corning, cat No. 25860) según el protocolo descrito por Monks y otros5 en el que 3 líneas celulares están sembradas en una misma placa. Como ya los pozos tienen 100 µL de medio, la concentración final de los productos es 50 % de la concentración de las diluciones seriadas. Después de la adición de las muestras, las placas se incubaron a 37 °C, 5 % de CO2 y con 100 % de humedad por 48 h.

Prueba de la sulforhodamina B (SRB)

Esta metodología está descrita detalladamente por Skehan.3 Brevemente, los cultivos celulares adherentes son fijados in situ por la adición a cada pozo de 50 µL de ácido tricloroacético (T-6399) al 50 u 80 % en agua (w/v) y se incuban las placas durante 60 min a 4 °C. Entonces, los sobrenadantes son desechados, las placas se lavan 5 veces con agua destilada y se secan.

Se añaden 100 µL de una solución de sulforhodamina B (S-1402) (0,4 % w/v en ácido acético al 1 %) a cada pozo y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se lavan las placas 5 veces con ácido acético al 1 % para eliminar el colorante no unido. Se secan al aire y el colorante que se ha unido a la proteína es solubilizado por la adición de 100 mL de tampón Tris. La densidad óptica se leyó en un lector de placa de 96 pozos de la Organon Teknica No. 510 a una longitud de onda de 492 nm.

Cálculo de los resultados

Los datos de la densidad óptica obtenidos de cada pozo de las placas de 96 pozos se pasaron a una hoja de cálculo preparada en Microsoft Excel versión 7 para Windows 95.

La inhibición del crecimiento del 50 % (GI50) es la concentración del producto que causa 50 % de reducción en el crecimiento de los cultivos tratados comparado a los cultivos controles y es calculado de la siguiente expresión :

IC50 = [(T-Tz )/(C-Tz )] x 100 = 50

Donde:

Tz, es el contenido de proteína al comienzo de la incubación del producto en estudio.

C, es el valor de los cultivos controles al final del período de incubación del producto.

T, son los valores de los cultivos tratados con el producto al final del período de incubación.

Los valores son calculados para este parámetro si el nivel de efecto es alcanzado, pero si el efecto no es alcanzado o si es excedido, entonces el valor es expresado como mayor (alto) o menor (bajo) de la concentración máxima o mínima del producto evaluado.

En el proceso de análisis y de cálculo se empleó una microcomputadora IBM compatible.

Resultados

En el estudio realizado se demostró que el trióxido de arsénico tiene actividad citotóxica marcada en las 4 líneas celulares tumorales humanas estudiadas. Como puede apreciarse en la tabla, este producto tuvo un mayor efecto citotóxico en la línea de adenocarcinoma de mama MCF7, con una IC50 de 0,099 µg/mL en el experimento 1 y de 0,122 µg/mL, en el experimento 2. En varios estudios se ha planteado la relativa sensibilidad de líneas celulares tumorales humanas provenientes de tumores sólidos, entre las cuales está incluida la línea MCF7.9

Tabla. Resultados de la evaluación in vitro de la actividad citotóxica del trióxido de arsénico en diferentes líneas celulares tumorales humanas

Línea celular	Inhibición del crecimiento 50 % IC50 (mg/mL)
	Experimento 1	Experimento 2
M14	0,471	0,450
MCF7	0,099	0,122
HT-29	0,543	0,659
	Experimento 3	Experimento 4
HL60	0,487	0,351

Discusión

Con respecto a las líneas celulares M14 y HT29, se plantea que en las líneas celulares humanas de tumores sólidos en general, el rango de IC50 se encuentra entre 0,4 µg/mL y 1,2 µg/mL,10 lo que se corresponde con los resultados obtenidos en estas líneas.

Finalmente, los valores de IC50 del producto frente a la línea HL60 demostraron su marcada efectividad en este tipo de leucemia.

Los resultados demostraron que el trióxido de arsénico tiene una marcada citotoxicidad en las líneas celulares tumorales humanas ensayadas por lo que es recomendable ampliar el estudio de citotoxicidad de esta sustancia en otras líneas celulares tumorales humanas y, además, evaluar la actividad antitumoral de este compuesto en tumores en animales de experimentación.

Summary

Evaluation of the cytotoxicity of arsenic trioxide in human tumoral cellular lines by the sulforhodamine B colorimetric technique

Arsenic trioxide has proved to be an inductor of apoptosis in cellular lines of acute promyelocytic leukemia. Clinical studies have showed its effectiveness in the treatment of this disease in patients refractory to the treatment with retinoic acid. It was determined the cytotoxic activity of this product against a panel of 3 human tumoral cellular lines of solid tumors (M14, MCF7, HT-29) and a line of acute promyelocytic leukemia, using the sulforhodamine B technique. Two experiments were made in which the cells were incubated for 48 hours in the presence of the product. The IC50 s obtained in both experiments were: M14 (0.471 and 0.450 µg/mL), MCF7 (0.122 µg/mL), HT-29 (0.543 and 0.659 µg/mL) and HL60 (0.487 and 0.351 µg/mL). It was concluded that the arsenic trioxide has a marked cytotoxic activity not only in the line of acute promyelocytic leukemia, but also in the studied lines of human solid tumors. Therefore, it was recommended the conduction of a study of the antitumoral activity of this product.

Key words: Sulforhodamine B, cytotoxicity, human tumoral cellular lines, breast adenocarcinoma (MCF7), melanoma (M14), colon adenocarcinoma (HT29), acute promyelocytic leukemia.

Referencias bibliográficas

1. Pandolfi PP, Grignani F, Alcalay M, Mecarelli A, Biondi A, LoCoco F, et al. Structure and origin of the acute promielocytic leukemia myl/RAR a cDNA and characterization of its retinoids-binding and transactivation properties. Oncogene. 1991;66:675-84.

2. Parkinson DR, Smith MA, Cheson BD, Stevenson HC, Friedman MA. Transretinoic acid and related differentiation agents. Sem Oncology. 1992;19(6):734-41.

3. Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, McMahon J, Vistica D, et al. A new colorimetric cytotoxicity assay for anticancer drug screening. J Natl Cancer Inst. 1990;82:1107-12.

4. Sulit HL, Golub SH, Irie RF, Gupta RK, Grooms GA, Morton DL et al. Human tumor cells grown in fetal calf serum and human serum: influences on the tests for lymphocyte cytotoxicity, serum blocking and serum arming effects. Int J Cancer. 1976;17(4):461-8.

5. Soule HD, Vázquez J, Long A, Albert S, Brennan M. A human cell line from a pleural effusion derived from a breast carcinoma. J Natl Cancer Inst. 1973;51:1409-16.

6. Fogh J, Trempe G. New human tumor cell lines. Chap. 5. En: Fogh J (de.) Human tumor cells in vitro. New York: Plenum Publishing Corp, 1975.p. 115-59.

7. Gallagher R. Characterization of the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute promyelocytic leukemia. Blood. 1979;54:713-33.

8. Monks A, Scudiero D, Skehan P, Shoemaker R, Paull K, Vistica D et al. Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. J Natl Cancer Inst. 1991;83:757-66.

9. Baj G, Arnulfo A, Deaglio S, Mallone R, Vigone A, De Cesaris MG, et al. Arsenic trioxide and breast cancer: analysis of the apoptotic, differentiative and immunomodulatory effects. Breast Cancer Res Treat. 2002 ;73(1):61-73.

10. Nakagawa Y, Akao Y, Morikawa H, Hirata I, Katsu K, Naoe T, et al. Arsenic trioxide-induced apoptosis through oxidative stress in cells of colon cancer cell lines. Life Sci. 2002;70(19):2253-69.

Recibido: 22 de diciembre de 2005. Aprobado: 1 de marzo de 2006.
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, 29 y E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10400. Correo electrónico: [e-mail]

1Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Auxiliar. Jefe del Laboratorio de Oncofarmacología.
2Aspirante a Investigador.
3Doctor en Ciencias Biológicas. Investigador Titular. Jefe del Departamento de Investigaciones Preclínicas.
4Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora.
5Médico Veterinaria. Aspirante a Investigadora.