Instituto de Neurología y Neurocirugía. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras"

Diagnóstico de distrofia muscular de Duchenne mediante análisis del ácido desoxinucleotico y su aplicación en la prevención

Lic. Mayra Rodríguez Hernández,¹ Lic. Raúl Ferreira Capote,² Dr. Luis A. Gayol Mecías,³ Dr. Jorge Quintana Aguilar,⁴ Lic. Rebeca Rendón⁵ y Dra. Dora Méndez del Castillo⁶

RESUMEN

Se define una estrategia para la prevención en Cuba de la distrofia muscular de Duchenne (DMD), una de las enfermedades hereditarias letales más frecuentes, y se evalúan la factibilidad de su aplicación y los problemas que pudieran dificultar su implantación al nivel nacional. La estrategia se basa fundamentalmente en la necesidad de detectar las familias afectadas, la definición de las mujeres portadoras o en riesgo de serlo y el estudio molecular de los miembros de interés con anterioridad al ofrecimiento de los servicios de diagnóstico prenatal mediante análisis directo -detección de deleciones en el gen DMD mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o análisis indirecto- empleo de los marcadores denominados polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLPs) en análisis de ligamento. Se concluye en que la aplicación de esta estrategia es factible y conveniente, pues permite ofrecer el diagnóstico prenatal al 75 % de las mujeres portadoras. Su eficiencia en la prevención del nacimiento de nuevos enfermos DMD se demuestra en 2 diagnósticos prenatales realizados, uno de los cuales detectó un embarazo afectado que fue interrumpido por solicitud de los padres.

Palabras clave: DISTROFIA MUSCULAR/prevención y control; DISTROFIA MUSCULAR/diagnóstico; ADN/análisis; DIAGNOSTICO PRENATAL; DELECCION CROMOSOMICA.

INTRODUCCION

La miopatía descrita por Duchenne en 1868,¹ conocida como distrofia muscular de Duchenne (DMD), es la más grave y frecuente de las distrofias musculares progresivas, con una incidencia de un enfermo por cada 3 500 varones nacidos vivos.² Se caracteriza por una degeneración lenta de las fibras musculares esqueléticas, lo que conduce a la invalidez dentro de los primeros 10 años de vida y provoca la muerte por inanición, insuficiencia respiratoria o cardíaca en la segunda década de vida.

La enfermedad se transmite en forma recesiva ligada al sexo y el gen responsable (gen DMD) está localizado en la región 21 del brazo corto del cromosoma X (simbolizado como Xp 21). Este gen presenta una de las mayores tasas de mutación conocida,³ lo que explica que aproximadamente la tercera parte de los individuos afectados no presenten antecedentes familiares (casos esporádicos).

En la actualidad no existen aún métodos terapéuticos eficaces para enfrentar esta enfermedad, por lo que se considera la estrategia más actual la prevención del nacimiento de nuevos enfermos. Esto exige la detección de las familias con individuos afectados y contar con posibilidades para el diagnóstico prenatal de la enfermedad en las mujeres portadoras o en riesgo de serlo, con vistas a ofrecerles mediante el asesoramiento genético la posibilidad de interrupción del embarazo cuando el feto es afectado.

La DMD ha sido una de las enfermedades en las que los estudios de biología molecular han reportado resultados más satisfactorios, en los que se logra no sólo el aislamiento y caracterización molecular del gen⁴ y de su producto proteico, la distrofina,⁵ sino además el desarrollo de valiosos métodos para el diagnóstico de la enfermedad, lo cual cobra gran importancia ante la imposibilidad de un diagnóstico clínico o bioquímico certero de las portadoras y fetos afectados.

El diagnóstico mediante análisis del ácido desoxinucleótico (DNA) permite tanto la detección de las mujeres portadoras de la enfermedad como el diagnóstico prenatal del feto en edades tempranas del embarazo mediante el estudio de muestras obtenidas a partir del líquido amniótico o vellosidad coriónica, en dependencia del tiempo gestacional.

Las primeras técnicas de análisis del DNA que se desarrollaron con estos fines se basaban en el análisis de ligamento con marcadores polimórficos de DNA (los llamados "polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción" o RFLP) los cuales de forma indirecta permiten inferir cuál de sus alelos está ligado al gen dañado, razón por lo cual se denomina análisis indirecto.

No obstante, esta estrategia presenta varios inconvenientes en cuanto a la factibilidad de su ejecución y a la confiabilidad de sus resultados,⁶ por lo que se recomienda su sustitución siempre que sea posible realizar el diagnóstico mediante un método de análisis directo.

El análisis directo es factible cuando se conoce la naturaleza de la anomalía genética (mutación) responsable de la enfermedad. En estos casos se desarrollan métodos que permitan la detección directa al nivel del DNA de dicha mutación, lo que presenta como ventaja que sólo requiere caracterizarla en un miembro enfermo de la familia y entonces definir la presencia o no de ésta en los familiares en riesgo.

En el caso de la DMD se sabe que las mutaciones más comunes que la provocan son las deleciones, y se presentan en hasta el 70 % de los casos en algunas poblaciones.⁷ Actualmente hay disponibles diferentes técnicas de análisis de DNA que permiten detectar en la mayoría de los casos estas deleciones. No obstante, su aplicación con fines diagnósticos no es factible en la detección de portadoras, debido al sobrelapamiento de los 2 cromosomas X presentes en las mujeres.

La introducción de la metodología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)⁸ permitió la expansión del diagnóstico de la DMD. Mediante métodos basados en el PCR se puede realizar la caracterización de marcadores polimórficos para el diagnóstico por análisis de ligamento, pero la principal aplicación de estos métodos en el diagnóstico de DMD es en la detección de deleciones.

No obstante, debido a la gran longitud del gen DMD (2.5 Mb)⁹ y a la heterogeneidad de las deleciones que se presentan en este gen, si se pretende detectar el 100 % de las deleciones, es necesario un gran número de reacciones, complicación que se presenta tanto cuando se utilizan técnicas de PCR como la técnica de Southern Blot.

Chamberlain et al.¹⁰ ofrece una solución parcial a este problema, al proponer un esquema de diagnóstico de deleciones por PCR que racionaliza su aplicación. Mediante una reacción múltiple analiza simultáneamente 9 de las regiones del gen DMD más frecuentemente involucradas en las deleciones, lo que permite la detección de aproximadamente el 80 % de las deleciones existentes.

El Ministerio de Salud Pública de Cuba ha implementado un Programa Nacional para la Prevención de Enfermedades Genéticas, debido a la importancia que cobran estas enfermedades en un país que cuenta con un sistema de salud avanzado como el nuestro.

La incorporación de la DMD a este Programa es un objetivo de gran importancia dada su relativamente alta incidencia en nuestra población (3,76 enfermos por 100 000 habitantes (Brown CA. Estudio epidemiológico de la distrofia muscular progresiva tipo pseudohipertrófica de Duchenne [trabajo para optar por el título de especialista de I grado en neurología], INN, 1990), la gravedad de ésta y sus implicaciones psicosociales en las familias afectadas.

Estas razones impulsaron al Instituto de Neurología y Neurocirugía a evaluar y proponer una estrategia, sobre la base de nuestras posibilidades económicas actuales, para la prevención de la DMD en Cuba.

MATERIAL Y METODO

Las bases de la estrategia propuesta por nosotros son las siguientes:

1. Detección de las familias afectadas, diagnóstico certero de al menos un afectado y análisis genético de éstas (confección del árbol genealógico, definición de las portadoras obligadas y de las posibles portadoras).
2. Búsqueda de deleciones en el gen DMD en al menos un afectado de la familia. De presentarse deleción del gen DMD, entonces están creadas las bases para el diagnóstico prenatal directo, sin necesidad de precisar el carácter o no de portadora en las mujeres en riesgo de serlo.
3. En ausencia de deleciones en el gen DMD, se define una estrategia para el análisis de ligamento en la familia y se analizan en miembros seleccionados de la familia (incluyendo de ser posible al menos un afectado) los marcadores RFLP disponibles para definir cuáles son informativos. De haber al menos uno informativo, se realiza el análisis familiar para detectar las portadoras y evaluar la informatividad de los marcadores RFLP en posibles diagnósticos prenatales.
4. Incorporación de las mujeres portadoras seguras (obligadas o caracterizadas por análisis de ligamento) o las en riesgo de serlo (en las familias con deleciones) en la consulta de asesoramiento genético; ofrecimiento del diagnóstico prenatal a aquéllas en las que éste es posible.
5. En una etapa posterior, se brinda la caracterización de las portadoras mediante análisis de ligamento aun en aquellas familias en las que se hayan detectado lesiones. No obstante, el diagnóstico prenatal en estas familias se seguirá realizando mediante el análisis directo, debido a que ofrece mayor confiabilidad y es más sencillo de realizar.

Para evaluar esta estrategia, fueron recepcionadas en nuestro laboratorio durante el período 1994-1995, 28 familias no emparentadas con al menos un afectado de DMD, remitidas por el Instituto de Neurología y Neurocirugía (INN) o por los departamentos provinciales de Genética. No fueron incluidas en el estudio 2 de estas familias por presentar una estructura no adecuada, fundamentalmente porque no contaban con ningún enfermo vivo y una por negarse a colaborar, por lo que finalmente fueron 25 las familias estudiadas.

En la tabla 1 se ofrece alguna información sobre la estructura de las familias estudiadas.

TABLA 1. Características principales de las familias estudiadas

Clasificación de las familias	Número de familias	Portadoras obligadas	Portadoras en riesgo	Portadoras con posibilidades reproductivas*
Caso esporádico	16	0	30	22
Historia familiar	9	19	33	31
Total	25	19	63	53

* Portadoras con posibilidades reproductivas; son consideradas como tales aquellas portadoras obligadas o en riesgo con menos de 15 años de edad y las de mayor edad, sin infertilidad comprobada, que manifiestan interés de tener hijos.

El DNA se obtuvo a partir de diferentes muestras biológicas con los siguientes métodos de extracción: para sangre periférica el método de precipitación salina,¹¹ para vellosidades coriónicas y amniocitos, el método de fenol-cloroformo/proteinasa K.¹²

En un miembro afectado de cada una de estas familias se realizó el análisis de deleciones mediante el método descrito por Chamberlain, et al. ¹⁰ con la variante de que se realizaron 3 reacciones independientes para el análisis de las 9 regiones del gen DMD involucradas en el estudio (exones 4, 8, 9, 12, 17, 19, 44, 45, 48 y 51), para facilitar la eficiencia de la reacción y la detección electroforética de los fragmentos.

En aquellas familias en que no se detectó deleciones en el gen DMD, se realizó análisis de ligamiento mediante la técnica de Southern Blot¹³ utilizando RFLPs detectados por la sonda pERT 87-15 con las enzimas TaqI y XmnI^.14 Esta sonda corresponde a un fragmento del gen DMD y se ha definido que su frecuencia de recombinación con las mutaciones DMD no es mayor que el 5 %.¹⁵ La sonda fue marcada con el radionúclido 32P mediante la técnica de Random Primer.¹⁶

A las mujeres portadoras obligadas o en riesgo de serlo, en edad reproductiva, se les brindó asesoramiento genético en los correspondientes departamentos provinciales de Genética y, en aquellos casos en que se realizó diagnóstico prenatal, la toma de muestra fetal (ya sea líquido amniótico o vellosidad coriónica) fue realizada en éstos, al igual que la interrupción del embarazo en el caso en que la pareja decidió esta opción.

Fueron solicitados a nuestro laboratorio 6 servicios de diagnóstico prenatal de DMD, 3 de ellos realizados por mujeres en riesgo de familias DMD que habían sido estudiadas previamente para su caracterización genética.

En todos los casos de diagnóstico prenatal se realizó la determinación del sexo del feto mediante ultrasonografía o análisis citogenético a partir del material fetal colectado.

RESULTADOS

Detección de deleciones en el gen DMD

En 13 de las 25 familias estudiadas (52 %) se pudo detectar que el defecto genético es la deleción, las cuales varían considerablemente de acuerdo con su amplitud y localización: aunque 7 de los 13 casos con deleción (54 %) incluyen los exones 48 y 51.

Evaluación del análisis de ligamento en las familias DMD

Se seleccionaron 8 de las 12 familias en las cuales no se detectaron deleciones, para evaluar la aplicabilidad del análisis de ligamento.

Estas 8 familias contaban con 36 portadoras obligadas o en riesgo,^20- 20 de ellas con posibilidades reproductivas. En estas 20 mujeres fue evaluada la informatividad de los 2 marcadores RFLPs disponibles, y se detectó que en 12 de ellas (60 %) al menos uno de estos marcadores es informativo, es decir, se presenta en estado heterocigoto.

El marcador pERT 87-15/XmnI fue el más útil de los marcadores evaluados, y fue informativo en 11 de las mujeres estudiadas, mientras que el marcador pERT 87-15/TaqI sólo fue informativo en 2 casos.

Diagnóstico prenatal de DMD

En la tabla 2 se ofrece alguna información sobre los resultados de los estudios realizados en las familias que solicitaron diagnóstico prenatal, según la estrategia por nosotros propuesta.

TABLA 2. Información básica sobre los resultados de los estudios de diagnóstico prenatal solicitados

	Método diagnóstico
Estudio	Detección Deleciones	Análisis Ligamento	Resultado
Con estudio familiar previo
21		X	Hembra portadora
50	X		Varón enfermo
55		X	Sin diagnóstico
Sin estudio familiar previo
52	X		Sin diagnóstico
53		X	Sin diagnóstico
57	X		Sin diagnóstico

En uno de los casos (registro 50) fue detectada la deleción del exón 48 en el estudio previo de la familia, por lo que el diagnóstico prenatal se realizó directamente mediante el análisis de esta deleción en el feto, previamente caracterizado como del sexo masculino. Dicha deleción se detectó también en el feto, definiendo su estado de enfermo de DMD (figura 1). La interrupción del embarazo se realizó a las 16 semanas de gestación por solicitud de los padres.

Fig. 1

En la familia con registro 21, también estudiada previamente, el marcador pERT 87-15/XmnI resultó informativo, y fue la embarazada heterocigota (genotipo 2.8/1.6+1.2); con el estudio de su hijo enfermo se pudo determinar que el gen DMD afectado está asociado con el alelo 1.6 + 1.2. Con esta información se procedió a realizar el diagnóstico prenatal indirecto. Mediante ultrasonido se determinó que el feto era del sexo femenino y por el análisis del ligamento se pudo determinar que es portadora de la mutación, pues presenta el alelo 1.6 + 1.2 de origen materno (figura 2). La pareja decidió continuar el embarazo.

Fig. 2

DISCUSION

En nuestro estudio el 52 % de las familias estudiadas presentan una deleción como anomalía genética responsable de la enfermedad, lo que coincide con los resultados reportados por otros autores, de acuerdo con la eficiencia del método.¹⁰ Además el hecho de que los exones 48 y 51 estén involucrados en el 54 (%) de las deleciones, también coincide con los estudios realizados anteriormente,⁷ lo que muestra la confiabilidad del método. Esto permite considerar de gran utilidad su empleo en el diagnóstico prenatal de la enfermedad, pues se puede ofrecer la detección directa de deleciones a todas las mujeres portadoras de dichas familias y en aquéllas con riesgo sin definirse previamente su carácter de portadora. En total son 20 las portadoras con posibilidades reproductivas en las familias estudiadas que pueden ser beneficiadas por el diagnóstico prenatal directo.

La aplicación exclusiva del método directo para el diagnóstico prenatal en aquellas familias con deleciones en el gen DMD presenta como ventaja fundamental, desde el punto de vista estratégico, que facilita la implantación de un programa masivo, pues sólo requiere de la caracterización previa de la deleción en un familiar enfermo. No obstante, presenta como limitante que, al no permitir la detección de portadoras, toda mujer embarazada en riesgo de ser portadora debe ser sometida al diagnóstico prenatal. Esto, además de mantener la carga emocional que la incertidumbre de su estatus origina en estas mujeres, conduce a que se realice innecesariamente el diagnóstico prenatal en aproximadamente el 50 % de los casos, con los riesgos y gastos que ocasiona la toma de muestra fetal y el estudio molecular. Este análisis fundamenta nuestra propuesta, de que en una etapa posterior las mujeres en riesgo de las familias con deleciones sean caracterizadas como tales o no mediante análisis de ligamento.

Al evaluarse la posibilidad del diagnóstico prenatal y de portadoras mediante análisis de ligamento con la batería de marcadores RFLP disponibles, se comprobó que dicho diagnóstico es posible en el 60 % de las mujeres evaluadas, y fue el marcador pERT 87-15/XmnI el más útil al ser informativo en el 55 % de los casos. A partir de esta información podemos calcular que pudiera brindarse la opción de diagnóstico prenatal a 20 de las 33 mujeres portadoras con posibilidades reproductivas pertenecientes a las 12 familias, sin deleciones incluidas en este estudio.

Sobre la base de la experiencia obtenida al enfrentar las 6 solicitudes de diagnóstico prenatal, se deduce que son 3 los principales problemas que se presentan para implantar un programa dirigido a estos fines:

1. La dificultad de registrar y realizar el análisis de DNA en las familias antes de la solicitud de diagnóstico prenatal.

Sólo el 50 % de las solicitudes correspondían a familias que habían sido analizadas previamente. Los 2 registros 51 y 21, en que se pudo concluir el diagnóstico correspondían a estas familias y las 3 familias registros 52, 53 y 57 que no tenían realizado estudio previo no se les pudo dar un diagnóstico concluyente.

2. La avanzada edad gestacional a que se realizan las solicitudes.

En las 3 solicitudes de diagnóstico prenatal correspondientes a mujeres en riesgo en las cuales las familias no habían sido estudiadas previamente, con la mayor urgencia posible, se obtuvo muestra de sangre de algún familiar DMD para realizar el estudio de deleciones, lo que permitió detectar deleciones en 2 de los casos (registros 52 y 57). No obstante, la elevada edad gestacional a que se realizaron las solicitudes (19 y 22 semanas, respectivamente) y la demora que provocó la localización y estudio de los familiares enfermos, impidió que el diagnóstico prenatal se realizara en tiempo para permitir una posible interrupción del embarazo, por lo que se decidió no someter a las embarazadas a los riesgos y complicaciones propios de la toma de muestra fetal.

En el registro 53 no se detectó deleción en el familiar DMD y fue imposible el análisis del árbol genealógico y obtención de muestras de sangre de los familiares de interés en un plazo que permitiera definir la existencia o no de algún marcador informativo y entonces ofrecer el servicio de diagnóstico prenatal, por lo que éste no pudo realizarse.

3. La poca informatividad que reporta la batería de marcadores RFLP disponible.

De acuerdo con nuestros resultados el 33 % de las familias con estudio previo realizado no resultan informativas para ninguno de los marcadores disponibles. Causa por la que no se pudo dar diagnóstico a la familia con registro 55.

Las dificultades relativas al registro y estudio de las familias y a la solicitud temprana en el embarazo de los diagnósticos prenatales podrán ser reducidas a medida que los genetistas y neurólogos de las provincias obtengan una mayor información y se ajusten los mecanismos de recepción y muestreo mediante los sistemas implantados por el Centro Nacional de Genética Médica, rector del Programa Nacional.

La poca informatividad de los marcadores disponibles debe ser solucionada mediante la incorporación de nuevos y más potentes marcadores, preferiblemente detectados mediante PCR,^17,18 para agilizar y disminuir el costo del procedimiento técnico. Actualmente estamos trabajando en este aspecto.

Otro trabajo que se emprenderá para ampliar las posibilidades de prevención de DMD es el montaje de técnicas que permitan el análisis de DNA a partir de muestras obtenidas de cadáver o de necropsias. De esta forma se podrá brindar estos servicios a familias que no cuentan con ningún enfermo DMD vivo, como es el caso de 2 de las familias que fueron recepcionadas inicialmente y excluidas de este estudio.

En este trabajo hemos sustentado la estrategia por nosotros propuesta para la prevención de la DMD. Mediante su aplicación en un conjunto reducido de 25 familias afectadas, pudimos: a) comprobar su factibilidad, b) crear condiciones para ofrecer la posibilidad de diagnóstico prenatal, ya sea mediante análisis directo o indirecto, a 40 de las 53 mujeres portadoras con posibilidades reproductivas (75 %) y c) hemos eva-luado los mecanismos para la ejecución de los diagnósticos prenatales, y se realizaron 2, uno de ellos que reportó un varón enfermo que conllevó la interrupción del embarazo y el otro una hembra portadora.

AGRADECIMIENTOS

A los licenciados Carlos Magariños y Danilo Rivas del Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras", por la valiosa ayuda prestada en la consecusión de este trabajo.

SUMMARY

A strategy is defined for the prevention in Cuba of the Duchenne's muscular dystrophy (DMD), one of the most frequent lethal hereditary diseases, and the feasibility of its application, and the troubles that might difficult its implantation at a national level, are evaluated. This strategy is mainly based on the need of detecting the affected families, the definition of the carrier women, or the women at risk of being carriers, and the molecular study of the members of interest with anteriority to the offering of prenatal diagnosis services by direct analysis -detection of DMD gen deletions by (PCR) polymerase chain reaction, or indirect analysis-, use of the markers called polymorphisms in the length of the restriction fragments (RFLPs) in ligament analysis. It is concluded that the application of this strategy is feasible and convenient, since it allows offtering a prenatal diagnosis to the 75 % of the carrier women. Its efficiency in the prevention of births of new DMD ill newborns is showed in two prenatal diagnosis, one of which detected an affected pregnancy, interrupted due to the parents'solicitude.

Key words: MUSCULAR DYSTROPHY/prevention and control; MUSCULAR DYSTROPHY/diagnosis; DNA/analysis; PRENATAL DIAGNOSIS; CHROMOSOME DELETION.

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Recibido: 6 de noviembre de 1995. Aprobado: 11 de enero de 1996.

Lic. Mayra Rodríguez Hernández. Laboratorio de Genética, Instituto de Neurología y Neurocirugía, Aguilera No. 12, entre H y 9 de Abril, Lawton. Municipio 10 de Octubre, Ciudad de La Habana, Cuba.

1. Aspirante a Investigadora. Instituto de Neurología y Neurocirugía.
2. Especialista Superior de Laboratorio. Investigador Agregado. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".
3. Especialista de II Grado en Genética Clínica. Instituto de Neurología y Neurocirugía.
4. Especialista de II Grado en Genética Clínica. Asistente. Centro Nacional de Genética Médica. Instituto Superior de Ciencias Médicas "Victoria de Girón"..
5. Técnica Superior de Laboratorio. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".
6. Especialista de II Grado en Genética Médica. Jefa del Servicio de Genética. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".