Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras"

Diagnóstico molecular del Síndrome X Frágil en un grupo control y miembros de 3 familias afectadas

Lic. Ana María Acevedo López,¹ Lic. Raúl Ferreira Capote,² Dr. Luis A. Gayol Mecías³ y Dra. Dora Méndez del Castillo⁴

RESUMEN

El síndrome X frágil constituye la forma de retraso mental hereditario más frecuente con una incidencia de 1 en 1 500 varones y de 1 en 2 500 hembras; es causado por mutaciones que aumentan el tamaño de un fragmento de ácido desoxinucleótico (DNA) específico en la región Xq 27.3 del cromosoma X. Se presenta el resultado en la introducción y aplicación de la sonda molecular StB12.3 en un grupo control y en miembros afectados de 3 familias. Se exponen las radiografías de los Southern blot que exhiben los patrones diagnósticos posibles a obtener. Esta metodología es mucho más directa, eficiente y confiable para el diagnóstico y prevención de esta forma de retraso mental.

Palabras clave: SINDROME DE FRAGILIDAD DEL CROMOSOMA X AS/diagnóstico; GENETICA BIOQUIMICA; ANALISIS MUTACIONAL DE ADN; SOUTHERN BLOTTING; GRUPOS CONTROL.

INTRODUCCION

El síndrome X frágil es una de las causas más comunes de retraso mental después del síndrome de Down. Consiste fundamentalmente en un retraso mental de grado variable, asociado en ocasiones con trastornos de conducta, macroorquidismo, así como a manifestaciones clínicas relacionadas con displasia del tejido conectivo.¹

La incidencia de la enfermedad se ha estimado de 1 en 1 500 varones y de 1 en 2 500 hembras y constituye una de las causas más frecuentes de retraso mental hereditario.^2,3 Se ha encontrado un marcador cromosómico definido como sitio frágil en el extremo distal del brazo largo del cromosoma X (Xq 27.3).⁴

El diagnóstico citogenético de la enfermedad es un método incompleto y poco confiable, que solamente permite detectar los sitios frágiles en el 55 % de las mujeres portadoras, y existe la posibilidad de diagnosticar falsos positivos.

Recientemente con las técnicas de DNA recombinante se han localizado marcadores moleculares muy cercanos al locus X (FRAXA) que completan el diagnóstico de la enfermedad. Esta región está asociada con un DNA inestable formado por una secuencia de trinucleótidos p (CGG)n repetitiva de longitud variable. La amplificación de esta región se relaciona fuertemente con el fenotipo clínico y el grado de expresión de la enfermedad.^5,6 Investigaciones moleculares han demostrado que el síndrome X frágil se debe a la amplificación de esta secuencia CGG repetida en el gen FMR-1, la cual provoca la pérdida de la expresión del gen.⁷

Adyacente a la secuencia p(CGG)n existe una zona caracterizada por una alta densidad de grupos CpG, llamados "islotes CpG", sensibles a la metilación.^6,8 La mutación en esta zona constituye un incremento en el tamaño de un fragmento de DNA específico.

Este incremento en tamaño es de grado variable según la forma de expresarse la enfermedad. En varones normales transmisores que son fenotípicamente normales y no expresan el sitio frágil por pruebas citogenéticas, la secuencia amplificada es de 100 a 600 bp y el cromosoma X activo está no metilado y se nombra premutación. Cuando esta amplificación es mayor de 600 bp existe una metilación anormal, el fenotipo se manifiesta en el 100 % de los varones y en el 50 % de las hembras y se considera mutación completa. Un tercer patrón de mutación se puede encontrar en menor grado, los llamados individuos mosaicos que muestran los fragmentos pequeños no metilados y los grandes metilados o un smear.^9-11

En la región CpG Oberlé, et al.,⁶ aislaron la sonda molecular StB12-3 que hibridiza con el DNA y permite detectar con manera confiable y directa los estados de metilación, sobre la base del análisis del DNA, lo que no era posible con el empleo de técnicas anteriores. Nosotros presentamos una doble digestión con enzimas de restricción EcoRI/EagI, de un grupo control y en miembros de 3 familias afectados que detecta las mutaciones y los estados de metilación.

MATERIAL Y METODO

El DNA de un grupo control no relacionado y de miembros de familias X frágil se analizó. El DNA se extrajo de los leucocitos por método convencional. Una doble digestión de los DNA con EcoRI y EagI se realizó durante 48 horas en un buffer que contenía 20mM de una solución de Mg Cl₂. Los DNA digeridos se corrieron en un gel de agarosa 0,8 % con una migración de 20 cm del bromofenol azul. Los DNA se inmovilizaron en un filtro Hybond N+ (Amersham) e hibridados en 40 % de formamida a 42 ^oC con la sonda StB12.3 radiomarcada con 40uCi de P.^3,2 Los lavados poshibridación se realizaron en una solución 0,5 X SSC y 0,1 % SDS, uno a temperatura ambiente y otro a 60 ^oC. El filtro se expuso durante 5 días a -70 ^oC y se obtuvieron las autorradiografías que se muestran.

RESULTADOS

Una doble digestión con las enzimas de restricción EcoRI y EagI revela la presencia de los estados de mutación y metilación. Los resultados se muestran en la figura. Con la sonda StB12.3, en varones normales, se obtiene un fragmento de 2.8 kb EcoRI/EagI correspondiente al cromosoma X activo (línea 1 y 9); en hembras normales, se obtiene un fragmento EcoRI adicional de 5.2 kb correspondiente al cromosoma X inactivo metilado (líneas 2,3,4 y 10).

Fig.

Un fragmento de 5.8 kb EcoRI se presenta en un varón con la mutación X frágil, mutación completa, metilada (línea 5). En hembras afectadas aparecen un fragmento de 2.8 kb y un smear por encima de 5.7 kb que corresponde con la mutación completa (líneas 6, 8 y 11). La línea 7 muestra un patrón típico de hembra portadora con fragmentos de 2.8 y 5.2 kb normales, correspondientes a los cromosomas X activo no metilado y X inactivo metilado respectivamente y los fragmentos de 2.9 y 5.8 kb que corresponden a la premutación.

En este estudio se presentó un simple test diagnóstico para el síndrome X frágil, que detecta con alta sensibilidad y especificidad las anomalías en el DNA asociadas con los estados de metilación y mutación en la enfermedad. El uso de este método para identificar todos los portadores, incluyendo los no clínicamente afectados, revela una alta proporción de personas nor-males que portan la premutación (línea 7). La metilación de los islotes CpG muestra la completa correlación entre el grado de amplificación de la secuencia de p(CCG)n repetitiva localizada proximal al locus FRAXA y el fenotipo X frágil en individuos afectados (líneas 5,6,8 y 11).

DISCUSION

El síndrome X frágil, una de las más comunes enfermedades genéticas, se caracteriza por un mecanismo genético único inusual de herencia, que incluye el fenómeno de anticipación conocido como paradoja de Sherman¹² y la presencia de varones normales transmisores que puede ahora ser explicada por el sucesivo incremento en el tamaño de la secuencia p(CCG)n. En varones, puede aparecer además, una banda difusa cerca de la banda normal, este sujeto tiene entonces retraso mental; la predicción del retraso mental en mujeres portadoras no ha podido ser posible.¹³ Aquí se ha presentado la detección del síndrome X frágil con alta sensibilidad y especificidad mediante el análisis directo del DNA, que permite el diagnóstico diferencial de la enfermedad. Para la evaluación sistemática en niños y niñas con retraso mental inexplicable, retraso en el comienzo del habla, autismo o comportamiento hiperactivo, aun sin historia familiar de retraso mental, recomendamos el uso de una digestión simple EcoRI. Recientemente el desarrollo de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha facilitado el entendimiento del amplio espectro de mutación en esta región CGG repetitiva.¹⁴

En conclusión, el síndrome X frágil se puede detectar por el análisis directo de la mutación y sus estados de metilación al nivel de DNA que facilita el diagnóstico prenatal y posnatal de la enfermedad y la identificación de portadores en familias en riesgo y proponer un consejo genético adecuado. El análisis citogenético en el diagnóstico deberá ahora ser reevaluado.¹⁵

SUMMARY

The fragile X syndrome is the most frequent form of hereditary mental retardation, with an incidence of 1 in 1 500 males, and 1 in 2 500 females; it is caused by mutations that increase the size of a fragment of specific desoxinucleotic acid (DNA) in the Xq 27.3 region of the X chromosome. The outcome in the introduction and application of the StB12.3 molecular probe in a control group and in affected members of three families, is presented. The x-rays of the Southern blot that show the diagnosis patterns possible to obtain, are exposed. This methodology is more direct, effective and reliable for the diagnosis and prevention of this form of mental retardation.

Key words: FRAGILE X SYNDROME/diagnosis; GENETICS; BIOCHEMICAL; DNA MUTATIONAL ANALYSIS; BLOTTING, SOUTHERN; CONTROL GROUPS.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Turner G, Opitz JM, Brown WT. Conference report. Second International Workshop of the Fragile X and on X-linked mental retardation. Am J Med Genet 1986;23:11-67.
2. Sutherland GR, Hecht F. Fragile sites on human cromosomes. New York: Oxford University, 1985.
3. Turner G, Robinson H, Laing S, Purvis-Smith S. Preventive screening for the fragile X syndrome. N Engl J Med 1986;315:607-9.
4. Webb T, Jacobs PA, Fragile Xq27.3 in female heterozygotes for the Martin-Bell syndrome. J Med Genet 1990;27:627-31.
5. Heitz D, Rousseau F, Devys D, Saccone S, Abdrrahim H, Le Paslier D, et al. Isolation of sequence that span the fragile X and identification of a fragile related CpG island. Science 1991;251:1236-9.
6. Oberlé I, Rousseau F, Heitz D, Kretz C, Devys D, Hanauer A, et al. Instability of 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science 1991;252:1097-102.
7. Hirst MC, Knight SJL, Christodoulou Z, Grewal J, Fryns JP, Davies KE. Origen of the fragile X syndrome mutation. J Med Genet 1993;30:647-50.
8. Yu S, Pritchard M, Kremer E, Lynch M, Nacarrow J, Baker E, et al. Fragile X genotipe characterized by an unstable region of DNA. Science 1991;1179-81.
9. Rousseau F, Heitz D, Biancalana V, SC M, Blumenfeld S, Kretz C, et al. Direct diagnosis by DNA analysis of the fragile X syndrome of mental retardation. N Engl J Med 1991;1673-81.
10. Mandel JL, Heitz D. Molecular genetics of the fragile X syndrome:a novel type of unstable mutation. Curr Opin Genet Dev 1992;2:422-30.
11. Sutherland GR, Gedeo A, Korman L, Donnelly A, Byard RW, Mulley JC, et al. Prenatal diagnosis of fragile X syndrome by direct detection of the unstable DNA sequence. N Engl J Med 1991;325:1720-2.
12. Sherman SL, Morton NE, Jacobs PA, Tuner G. Further segregation analysis of the fragile X syndrome with special reference to transmiting males. Hum Genet 1985;69:3289-99.
13. Oostra AB, Verkerk AJMH. The fragile X syndrome: isolation of the FMR-1 gene and characterization of the fragile X mutation. Chromosoma 1992;101:381-7.
14. Jacobs PA, Bullman H, Macpherson J, Youings S, Rooney V, Watson A, et al. Population studies of the fragile X: a molecular approach. J Med Genet 1993;30:454-9.
15. Yamauchi M, Nagata S, Seki N, Toyama Y, Harada N, Niikawa N, et al. Prenatal diagnostisis of the fragile X syndrome by direct detection of the dynamic mutation due to an unstable DNA sequence. Clin Genet 1993;44:169-72.

Recibido: 5 de diciembre de 1995. Aprobado: 11 de enero de 1996.

Lic. Ana María Acevedo López. Laboratorio de Genética, Instituto de Neurología y Neurocirugía. Calle 29 y D, El vedado, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

1. Licenciada en Biología. Investigadora Aspirante. Instituto de Neurología y Neurocirugía.
2. Licenciado en Bioquímica. Especialista Superior de Laboratorio Clínico. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".
3. Doctor en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Genética Clínica. Instituto de Neurología y Neurocirugía.
4. Especialista de II Grado en Genética Clínica. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras".