EXPERIENCIA Y RESULTADOS

CENTRO NACIONAL DE GENÉTICA MÉDICA.INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MÉDICAS DE LA HABANA

Síndrome frágil X: Mutaciones dinámicas y su repercusión en otras enfermedades genéticas

Prof. Dra. Aracely Lantigua Cruz¹

RESUMEN

En este artículo se presenta una revisión actualizada del síndrome frágil X, tanto en sus aspectos clínicos como genéticos. Se hace referencia al impacto que los mecanismos de esta peculiar mutación, han tenido en la explicación de fenómenos genéticos como la anticipación, característicos de varias enfermedades fundamentalmente neuromusculares y neurodegenerativas. Finalmente, se hace referencia al enfoque actual del diagnóstico del síndrome frágil X tanto clínico como citogenético y molecular, y a su repercusión en el diagnóstico prenatal.

Descriptores DeCS: SINDROME DE FRAGILIDAD DEL CROMOSOMA X/genética; SINDROME DE FRAGILIDAD DEL CROMOSOMA X/diagnóstico; MUTACION/genética.

INTRODUCCIÓN

En 1943 Martin y Bell describen la forma de herencia y características faciales de una familia con 11 varones afectados por retraso mental (RM) distribuidos en 2 generaciones. En 1969 Escalante y Bryan y Gillian independientemente, describen macroorquidismo en pacientes con RM y fenotipo Martin Bell (MB), y Lubs señala la presencia de un sitio frágil del cromosoma X en cariotipos de varones con ese síndrome.¹ Sutherland en 1977 encuentra que esta fragilidad sólo se manifiesta en cultivos con medios pobres en folato.² Así queda catalogado el síndrome frágil X como una entidad que presenta rasgos faciales característicos, RM, herencia recesiva ligada al X y sitio frágil Xq27-28.^1,2 Su frecuencia se ha estimado en 1 en 1 000 a 1 500 varones y 1 por cada 2 000 a 2 500 hembras.^3,4

El síndrome se manifiesta por un fenotipo y conducta característicos. Ligero incremento del peso al nacer y de la talla en la infancia. Circunferencia cefálica superior al 75 percentil en niños. Cara alargada, orejas prominentes y grandes, paladar alto, mentón grande a expensas de su sínfisis, piel aterciopelada y fina, hipotonía, hiperextensibilidad de las articulaciones, fundamentalmente de los dedos, alteraciones en los dermatoglifos, Pectus carinatum o excavatum, pies planos, escoliosis, macroorquidismo pospuberal y ocasionalmente antes.^5,6

Prolapso de la válvula mitral, dilatación de la aorta ascendente, apnea durante el sueño, lo que pudiera explicar los casos de muertes súbitas.

Muchas de estas manifestaciones se observan en enfermedades genéticas del tejido conectivo. Histológicamente se demostró ausencia de arborización de la elastina en la dermis papilar, y fragmentación de sus fibras en la dermis reticular profunda.⁵

También presentan dermis cerebelar pequeña y agrandamiento del cuarto ventrículo. Aumento global del área temporal derecha y de los ventrículos laterales. En mujeres estos signos son menos severos.⁵ Correlación significativa entre convulsiones y tanto por ciento de fragilidad en estudios citogenéticos, así como de la presencia de ondas paroxísticas e hiperactividad en varones frágil(X), y en grado menos severo en portadores.⁶

CONDUCTA Y ESTUDIOS NEUROPSICOLÓGICOS

Los hallazgos en evaluaciones de las funciones cognitivas de estos pacientes indujo a plantear que debían existir 2 tipos de mutaciones que explicarían el carácter estático en unos pacientes y su declinación en otros.⁷ La frecuencia del síndrome en grupos de niños con autismo y la conducta autista de otros pacientes no han permitido un enfoque de relación de esta psicosis con la mutación frágil X.^8,9 Otras disfunciones neuropsicológicas se expresan por déficit significativo de las relaciones sociales, conducta motora esteriotipada, respuesta inusual a estímulos motores, anormalidades del lenguaje como perseveración y ecolalia.¹⁰

En las mujeres frágil(X) se han reportado, depresión (26 %), hiperactividad (47 %) y agresividad (18 %), así como problemas psiquiátricos incluyendo esquizofrenia, enfermedad maníaco-depresiva y psicosis del 15 al 20 % de las heterocigóticas.

En heterocigóticas se han valorado deficiencias en la comprensión verbal y la memoria,¹¹ así como alteraciones del sentido quinestético, funcionamiento motor y déficit en la atención que sugieren disfunción parcial del lóbulo frontal con CI entre 65 a 127.^10,12 Otros hallazgos han sido menopausia precoz, irregularidad menstrual y disfunción hipotalámica.¹⁰

CITOGENÉTICA DEL SITIO FRÁGIL

El término sitio frágil fue utilizado por Hecht en 1969 en relación con una discontinuidad sobre el cromosoma 16 con un patrón hereditario. Se han descrito numerosos sitios frágiles cuya detección continúa incrementándose.² El primer sitio frágil relacionado con un fenotipo anormal fue el Xq, localizado en Xq27-28¹³ y con técnicas de alta resolución en Xq27.3.¹⁴ A este sitio frágil se le denomina FRAXA.

En cultivos carentes de folato se desencadenan fenómenos bioquímicos que determinan la visualización microscópica de una interrupción al nivel de Xq27.3, aunque nunca en valores superiores al 50 %, aun en varones con retraso mental severo y con todas las características del síndrome.² La expresión citogenética en mujeres portadoras sólo aparece en la mitad de las portadoras obligadas.

En 1992 se reportó una segunda familia con expresión del sitio frágil Xq27.3, sin asociación aparente con RM ni de características clínicas del síndrome, lo que puso en duda la utilidad citogenética del sitio frágil X para la caracterización de la enfermedad.¹⁵ La posibilidad de realizar estudios de hibridización in situ (FISH) con cósmidos de ADN de loci que flanquean al sitio frágil Xq27.3 (FRAXA) y otro locus distal han confirmado que la fragilidad sin el síndrome de fra(X) es el resultado de un nuevo sitio frágil sensible al folato, el FRAXA, que en la actualidad se ha relacionado con diferentes grados de RM.¹⁶

Lo hasta aquí expuesto evidencia lo limitado del uso de la detección citogenética del sitio fra(X) para identificar mujeres portadoras sanas dentro de una familia afectada.

AVANCES MOLECULARES

Los estudios de ADN en este síndrome comenzaron con el locus del factor 9 de la coagulación (F9),¹⁷ las publicaciones entre el año 1985 y 1988 fueron contradictorias en relación con el grado de ligamiento en las familias estudiadas entre estos 2 loci [F9 y frágil(X)], pero a partir del año 1989 comienzan a reportarse nuevos loci distales del sitio frágil,¹⁸ y se logra su localización dentro de 6 a 7 cM, para realizarse el diagnóstico prenatal en varias familias.¹⁹

Hasta 1991 se había logrado limitar la región del sitio frágil a 1 ó 2 cM, es decir, de 1 a 3 Mb, lo que determinó el comienzo del aislamiento y caracterización de la mutación fra(X).²⁰

EL GEN FMR-1 Y LA NATURALEZA DE LA MUTACIÓN FRÁGIL X

En 1991 Annemieke Verkerk, et al. identificaron el gen FMR-1,²¹ el cual contenía una repetición de bases CGG coincidente con un punto de ruptura muy cercano al sitio frágil X.²¹ Actualmente la explicación es la siguiente: el alelo normal tiene un exon 5 con una secuencia repetitiva (CGG)n; este alelo es meióticamente estable con n de 6 a 46, con una media de 29. Durante la meiosis el valor de n puede aumentar a un rango de 52 y 200; a este cambio se le denomina premutación. Es de suponer que existe un rango de n considerado como premutaciones lo suficientemente grande para variar la probabilidad de amplificar n de 200 a más de 1 000, como se ha reportado en varones con el síndrome y que constituyen la mutación completa que expresa la enfermedad^20-23 (figura 1). FIGURA 1. Esquema de la caracterización molecular del gen FMR-1, en el que se señalan el alelo normal, la premutación, la mutación completa y la localización de los islotes CpG hipermetilados, cuando las repeticiones CGG son muy grandes.

METILACIÓN Y SU RELACIÓN CON EL GEN FMR-1

Todos los hombres que expresan el síndrome frágil X presentan a 250 bp de las secuencias p (CGG)n islotes CpG metilados en más del 50 %, mientras en los estados de premutación el grado de metilación es similar al del cromosoma X normal. Se ha pensado que el efecto de expresión del gen FMR-1 pudiera correlacionarse con el grado de metilación de estas zonas de CpG.^20,24

MOSAICISMO SOMÁTICO

El análisis molecular en diferentes tejidos de personas afectadas ha puesto de relieve un mosaicismo somático importante, que indica que los alelos con premutaciones son inestables mitóticamente. Estas variaciones somáticas sólo se producen si la amplificación p(CGG) es mayor de 0,7 kb, y por otra parte todos los individuos que han presentado variaciones somáticas expresaron el sitio frágil.²³

HERENCIA DE LA MUTACIÓN FMR-1

Aunque la herencia del síndrome frágil X está caracterizada como recesiva ligada al cromosoma X, existe gran discrepancia en el riesgo de transmitir la enfermedad dentro de diferentes generaciones de la misma familia. Estos riesgos estudiados por Sherman, et al. aparecen en la figura 2^25,26 y a su discrepancia con lo esperado se le denominó "paradoja de Sherman". El 20 % de los hombres que por el árbol genealógico se conoce que portan el gen, son fenotípicamente normales, pero transmiten el gen al 100 % de sus hijas, quienes se mantienen asintomáticas.²⁷ Nótese que las mujeres portadoras hijas de un hombre transmisor sano (HTS) presentan riesgos diferentes de los calculados para una portadora que expresa la enfermedad y que recibió el gen de la hija de un HTS, esto es un ejemplo del fenómeno de anticipación genética.

FIGURA 2. Árbol genealógico hipotético en el que se señalan los riesgos de mutación completa del gen FMR-1 en diferentes generaciones de acuerdo con la "paradoja de Sherman".

RELACIÓN ENTRE MUTACIÓN FMR-1 Y "PARADOJA DE SHERMAN"

Los individuos normales presentan en sus alelos normales un rango de 6 a 54 repeticiones con una media de 30, que se heredan de forma estable. En las familias con síndrome frágil X se observan tanto hombres como mujeres, cuyos rangos de repeticiones CGG varían entre 43 y 200 copias. Estas personas tienen alelos premutados. Son meióticamente inestables.²⁸ Sin embargo la premutación que transmite el hombre nunca se transforma en mutación completa a través de sus espermatozoides, es decir, sus hijas son normales, pero portadoras de la premutación que será meióticamente inestable en sus ovogénesis. El riesgo de aumentar el número de repeticiones para una mujer portadora de la premutación, depende del tamaño de la premutación, y será bajo si está en el rango de 50 a 65, pero si es superior a 90 el riesgo es casi del 100 %.²⁹ Esto explica por qué los criterios para determinar el patrón de herencia recesiva ligada al cromosoma X no se corresponden con las leyes de Mendel. También significa que durante varias generaciones el estado de premutación no sufra variaciones y por qué a pesar de ser esta enfermedad genética la segunda causa de RM y de que los varones no se reproduzcan, no exista una alta tasa de mutaciones nuevas, sino cromosomas X fundadores que portan un rango de mutaciones superior al normal.^30,31

FISIOPATOLOGÍA DEL SÍNDROME FRÁGIL X

Las regiones CpG representan el sitio promotor del gen FMR-1. El hombre afectado por una mutación completa tiene una hipermetilación en esa zona y no sintetizan ARN mensajero,²⁴ ni tampoco la proteína correspondiente. Por otra parte el sitio de iniciación de la transducción se localiza 69 bases después de la repetición CGG. Luego esta repetición en el alelo normal debe tener otras funciones, que parecen estar en relación con una secuencia de bases que constituya un sitio de unión a proteínas. Esta proteína es incapaz de unirse a este sitio del ADN del gen FMR-1, cuando la mutación es completa como resultado de la metilación. Se desconoce cómo la falta de unión de esa proteína afecta al fenotipo.²⁹

REPERCUSIÓN GENÉTICA DEL DESCUBRIMIENTO DEL GEN FMR-1

Las características del gen FMR-1 y su relación con el sitio FRAXA y de la expansión de las repeticiones CGG con el fenotipo MB, despertaron el interés por investigar molecularmente otros sitios frágiles y otras enfermedades monogénicas caracterizadas por penetrancia incompleta, expresividad variable y anticipación.³² En la tabla se resumen los resultados acumulados en los últimos 4 años.²⁹ TABLA. Resultados de los últimos 4 años

				Alelos
Entidad sitios frágiles	GEN	LOCUS	Tripleta	N	P	F
FRAXA	FMR-1	Xq27.3
FRAXE	NI	Xq28	(CGG)n - n =	6-50 n	50-200	n>200
FRAXF	NI	Xq28
FRA16A	NI	16p11
Distrofía miotónica	DM	19q13	(CTG)n - n =	5.38 n =	42-1000	n >1000
Atrofia muscular espino bulbar	AR	Xq11-12
Enfermedad Huntington
Ataxia espinocerebelar	SCAI	6p22	(CAG)n - n =	6-36 n =	40 < 100	n = 100
Atrofia dentatorubralpalidolnisiona	DRPLA	12p12
Síndrome How River	HRS	12p12
Enf. Machado - Joseph	MJD	14p23

N = normal P = premutación F = mutación completa

A este mecanismo de mutación se le ha denominado mutaciones dinámicas.³³ De las 11 entidades con estas mutaciones señaladas en la tabla, las neurodegenerativas y neuromusculares se caracterizan por anticipación (severidad y comienzo precoz de la enfermedad en cada nueva generación) y de los 4 sitios frágiles, sólo FRAXA y FRAXE se acompañan de retraso mental.²⁹ Se ha observado que el valor medio de repeticiones en las cuales puede comenzar a aparecer la mutación para todas ellas es de 35, tal vez debido a la existencia de un mecanismo común para desencadenar la expansión de los tripletes.²⁹

Los sitios frágiles con esta mutación tienen en común que son expansiones de CGG y se expresan cuando hay más de 200 repeticiones. El resto de las enfermedades con mutaciones dinámicas no presentan sitios frágiles.²⁹

Tanto en el síndrome frágil X, como en la distrofia muscular, los tripletes repetidos no forman parte de la proteína y se localizan en los extremos de los genes FRAXA y DM respectivamente.²⁹

En las otras 6 entidades (todas enfermedades neurodegenerativas) el triplete repetitivo es GAG, en un número menor que 100, localizados en regiones internas del gen y sí aparecen en la proteína formando cadenas de poliglutamina que constituyen la única semejanza entre ellas. Se piensa que sean las longitudes de estas poliglutaminas el punto clave en la anormalidad de la función biológica de la proteína involucrada.²⁹

¿Cómo se hace el diagnóstico del síndrome frágil X?

A nivel clínico tiene gran valor predictivo el fenotipo MB, el macroorquidismo, el retraso mental y una historia familiar de herencia ligada al X. La hiperactividad es un síntoma relevante. Sin embargo, estudios en grupos de pacientes con RM de causa prenatal desconocida, inclasificables (sin antecedentes pre-, peri- y posnatal y fenotipo normal), así como en todo varón con conducta autística, se debe realizar estudio citogenético en busca del sitio FRAXA o estudio molecular directo del gen. Este último ha permitido detectar la mutación en 4 de 150 varones con RM de origen desconocido,³⁴ pero el hallazgo de otras aberraciones cromosómicas en pesquisajes citogenéticos de frágil X³⁵ como anillo del 22 y cariotipos con 47 cromosomas al ser el extra un cromosoma inclasificable (Lantigua, et al., datos no publicados) sugieren el complemento de ambos estudios.

ESTUDIOS MOLECULARES

Los métodos empleados pueden ser directos si estudian al gen o indirectos si se emplean marcadores que flanquean al gen por ambos lados. De los primeros el más empleado es el Southern blot, que se realiza utilizando endonucleasas de restricción y una sonda para ser observada cuando hibride con el ADN muestra. El método puede detectar el gen normal, la premutación y la mutación completa, pero es difícil precisar el número de repeticiones. Otro método directo es la amplificación del segmento del gen correspondiente a la zona de repeticiones, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el cual permite analizar el número de repeticiones del alelo normal, la premutación y la mutación completa. Con el empleo de restrictasas sensibles a sitios metilados puede estimarse el grado de metilación del gen FMR-1, para pronosticar la severidad de la mutación, si observamos que una hipermetilación se correlaciona con la mutación completa y falta de expresión.

Los métodos indirectos se realizan a través del estudio de fragmentos de ADN, lo más adyacente posible al gen, de modo tal que la probabilidad de que estas zonas adyacentes se transmitan a la descendencia con el FMR-1 sea tan cercana a 1 como sea posible. Este método se emplea cuando los directos son difíciles de interpretar en la caracterización del gen¹⁹ y se puede combinar con los directos.

La interpretación de los resultados obtenidos con los métodos directos diferencian muy bien entre el alelo normal, premutación y mutación completa, pero no son fáciles de interpretar los solapamientos entre alelo normal-premutación y premutación-mutación completa, y en este último caso ni siquiera el estudio de la metilación es a veces tan preciso, pues las hipermetilaciones parecen estar relacionadas con la elongación (CGG)n.^20,24

El diagnóstico prenatal con métodos moleculares directos permite identificar los 2 extremos, esto es, alelo normal y mutación completa sin dificultad, pero los estados intermedios (normal-premutación y premutación-mutación completa) son más imprecisos y requieren de la caracterización molecular de la familia, ya que en caso de dudas puede necesitarse el empleo de métodos indirectos.

Recientemente se ha descrito un método inmunológico que puede introducir nuevos enfoques en el diagnóstico del síndrome, pues los enfermos se detectan con la simple lectura de una reacción antígeno anticuerpo y su empleo será útil, no sólo en pesquisajes de poblaciones de riesgo, sino también pesquisajes de neonatos.³⁶

El Centro Nacional de Genética Médica ha propuesto realizar el registro familiar, para analizar las inestabilidades meióticas en mujeres portadoras de la premutación, y predecir el riesgo de mutación completa, el éxito del diagnóstico prenatal del síndrome y mejorar la atención genética a esas familias.

GLOSARIO

Alelos: alternativa de un gen que expresa cualidades diferentes de un carácter específico y que ocupa el mismo locus en cromosomas homólogos.

ADN: ácido desoxirribonucleico. ADNc: ADN complementario.

ARN: ácido ribonucleico. ARNm: ácido ribonucleico mensajero.

ARNr: ácido ribonucleico ribosomal. ARNt: ácido ribonucleico de transferencia.

Codón: conjunto de 3 bases nitrogenadas del ARNm que determina la incorporación de un aminoácido específico en la síntesis de proteínas.

cM: centimorgan, unidad de ligamiento.

1 cM = 1 % de recombinación entre 2 genes adyacentes.

Exon: unidad del gen que se transcribe y que está presente en el ARNm maduro.

Gen: unidad de la herencia. En términos moleculares secuencia de ADN que se requiere para expresar un producto funcional.

kb: kilobase = 1 000 bases nitrogenadas.

Loci: plural de locus.

Locus: posición de un gen en el cromosoma.

Mb: megabase = 1 000 000 de bases nitrogenadas.

p: en citogenética representa el brazo corto de un cromosoma.

Probe: secuencia de ADN o de ARN marcados que se usan para detectar secuencias complementarias por hibridación molecular a un segmento de ADN en estudio.

Promotor: región del ADN a la que se unen proteínas específicas que promueven la transcripción del gen.

SUMMARY

In this article, it is presented an updated review of the fragile X syndrome, both of their clinical and genetics aspects. It also refers to the impact the mechanisms of this peculiar mutation have had on the explanation of genetic phenomena such as the anticipation, which are characteristic of various diseases, mainly neuromuscular and neurodegenerative diseases. Finally, it deals with the present approach not only of the clinical diagnosis of the fragile X syndrome, but also of the cytogenetic and mollecular one and with its repercussion on the prenatal diagnosis.

Subjects headings: FRAGILE X SINDROME/genetics; FRAGILE X SINDROME/ diagnosis; MUTATION/genetics.

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Recibido: 18 de octubre de 1995. Aprobado: 20 de diciembre de 1995.

Prof. Dra. Aracely Lantigua Cruz. Hospital Pediátrico Docente "Juan Manuel Márquez", municipio Marianao, Ciudad de La Habana, Cuba.

1. Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de II Grado en Genética Clínica. Profesora Titular de Genética del Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana.