INSTITUTO SUPERIOR DE CIENCIAS MÉDICAS, VILLA CLARA

Reducción del nitroazul de tetrazolio por leucocitos polimorfonucleares neutrófilos del recién nacido

Dr. Alfredo Gutiérrez Maydata¹ y Dr. Cs. Med. Mayra Masjuán del Pino²

RESUMEN

Se realizó la prueba de reducción del nitroazul de tetrazolio (NBT) en granulocitos obtenidos de sangre del cordón umbilical, de 46 recién nacidos a término y de más de 2 500 g. El grupo control estuvo conformado por 80 adultos sanos, donantes de sangre voluntarios. Para valorar los efectos de diferentes niveles de complemento se utilizaron como fuentes de éste, suero de adulto normal, suero humano inactivado a 56 ^oC o suero fresco de ratón. El porcentaje de leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) reductores fue significativamente inferior en el recién nacido (16,7 ± 3,6 %) en relación con el adulto (25,5 ± 4,2 %) cuando se utilizó suero humano inactivado como fuente de opsoninas, y no se hallaron diferencias significativas al utilizar suero fresco de ratón o suero adulto activo. Se destaca además el incremento de la capacidad reductora del leucocito PMN del recién nacido (58 y 95 %) de incremento al utilizar suero de adulto activo o ratón respectivamente contra el adulto (7,8 y 39,2 %) en iguales condiciones.

Descriptores DeCS: NITROAZUL DE TETRAZOLIO; NEUTRÓFILOS; RECIÉN NACIDO; SANGRE FETAL; FAGOCITOCIS; COMPLEMENTO.

Las defensas del neonato humano son inmunológicamente inmaduras, lo que contribuye sustancialmente a la alta incidencia de sepsis en el recién nacido (RN) a término.¹ Uno de los trastornos que parece incrementar el riesgo de infecciones bacterianas son los cambios cuantitativos y cualitativos en el sistema fagocitario, que pudieran llevar a una deficiencia en la habilidad de los leucocitos PMN de fagocitar y matar microorganismos,² pues las investigaciones sobre la capacidad del suero de RN de servir como fuente de opsoninas han mostrado ser menor en relación con el adulto,³ y en particular el estudio del sistema complemento resulta elemento de especial interés en el RN, pues la actividad del complemento hemolítico total (mide la integridad de la vía clásica) constituye el 50 % de la del adulto, y la actividad de la vía alternativa (que tiene entre sus activadores las paredes celulares de la levadura,⁴ está aún más dañada;¹ lo que nos indujo a valorar los efectos de diferentes niveles de complemento sobre la actividad fagocitaria de los leucocitos PMN del RN ante la levadura, manteniendo niveles aceptables de IgM e IgG.

MÉTODOS

Muestra: La muestra fue seleccionada en el Hospital Ginecoobstétrico "Mariana Grajales" de Santa Clara y estuvo compuesta por 46 RN normales de uno y otro sexos, de peso superior a 2 500 g y cuyas madres tenían de 38 a 42 semanas de edad gestacional. A la totalidad de los RN se les tomó sangre del extremo placentario del cordón umbilical en tubos heparinizados.

El grupo control lo conformaron 80 adultos sanos con edades comprendidas entre 17 y 25 años, de uno y otro sexos, donantes voluntarios de banco de sangre o estudiantes del ISCM-VC, a quienes se les extrajo sangre venosa en tubos heparinizados.

En todos los casos se realizó conteo de leucocitos y determinación del porcentaje y número absoluto de granulocitos neutrófilos mediante coloración de Giemsa.

Aislamiento de granulocitos neutrófilos: La obtención de granulocitos se hizo según la técnica descrita por Hudson⁵ ligeramente modificada: 10 mL de sangre total se mezclaron con 2,5 mL de Dextran T-500 (Pharmacia Fine Chemicals) a una concentración de 30-10^-3 en solución salina. Se incubó en posición vertical a 37 ^oC por espacio de 1 hora; posteriormente se eliminó el sobrenadante, y el precipitado se centrifugó a 1 000 g para eliminar totalmente el plasma. Las células fueron lavadas con solución de buffer fosfato (PBS), 3 veces durante 10 mi-nutos a 1 000 g. Se realizó el conteo de granulocitos y se ajustó a una concentración final de 5.10⁶ células/mL.

Prueba de reducción de NBT: La levadura (Saccharonyces cerevisiae) como partícula, fue utilizada para inducir la fagocitosis. La solución salina que contenía un fragmento de levadura se llevó a temperatura de ebullición durante 30 min. Se filtró por gasa varias veces y se ajustó a una concentración de 4.10⁶ células/mL; posteriormente se distribuyó en pequeños volúmenes y almacenó a -20 ^oC.

La técnica de reducción del NBT se hizo de acuerdo con la descripción de Stelzner.⁶ La solución de NBT se preparó en PBS a una concentración de 2.10.^-3 Posteriormente se mezclaron 100 m L de suspensión de células, 50 m L de la suspensión de levaduras, 100 m L de NBT y 20 m L de suero como fuente de opsoninas, y se incubaron 30 minutos a 37 ^oC. Se realizó la determinación microscópica del porcentaje y número absoluto de células formazán positivas; fueron consideradas como tal aquéllas en cuyo citoplasma se observó un precipitado azul, por presentar inclusiones de azul de formazán.

Fuente de opsoninas: Para valorar los efectos de diferentes niveles de complemento sobre la actividad fagocitaria del leucocito PMN del neonato, se utilizó, en 16 muestras de recién nacidos y 30 de adultos, suero humano AB inactivado por calentamiento durante 30 minutos y a 56 ^oC, método que es capaz de abolir o reducir severamente la actividad opsónica dependiente del complemento, no así el efecto de IgM e IgG, termoestables en estas condiciones.⁷ En un segundo grupo (30 recién nacidos y 50 adultos) se utilizó suero de ratón, rico en componentes del complemento, y en el último, suero AB humano sin decomplementar.

Cálculos estadísticos: Los resultados correspondientes a RN y controles fueron obtenidos al calcular la media aritmética y el error estándar de la media. La comparación entre los valores de ambos grupos se realizó con la aplicación de la prueba de la "t" de Student de diferencia de medias y proporciones para un límite de confianza de p = 0,05.

RESULTADOS

La tabla 1 muestra los valores de leucocitos totales y leucocitos PMN en sangre de cordón y de adultos ( ± s), donde se puede observar un incremento altamente significativo (p < 0,01) del número de leucocitos totales y leucocitos PMN en el recién nacido. A pesar de ello, y dada la leucocitosis relativa del neonato aquí observada, el porcentaje de leucocitos PMN es menor (p < 0,01) en la sangre del cordón que entre adultos.

TABLA 1. Leucocitos totales y polimorfonucleares neutrófilos en sangre de cordón umbilical y de adultos estudiados ( ± s)

		Leucocitos	PMN
Muestra	n	(células/mL)^*	(células/mL)^*	(%)^*
Recién nacidos	46	9 431±245	4 487±120	48,2±1,28
Adultos	80	6 766±168	3 841±466	56,5±0,77

Fuente: Laboratorio de Inmunología del ISCM-VC. ^* p < 0,01.

En la tabla 2 se dan a conocer los valores ( ± s) de la prueba del NBT en el grupo de recién nacidos y el de adultos, ante diferentes fuentes de complemento. El porcentaje de leucocitos PMN reductores del NBT fue significativamente inferior en el recién nacido (p < 0,01) con respecto al del adulto, cuando se utilizó suero humano inactivado como fuente de opsoninas, por lo que no se encontraron diferencias significativas al utilizar suero de adulto activo o suero fresco de ratón.

TABLA 2. Resultados de la prueba del nitroazul de tetrazolio en recién nacidos y adultos con la utilización de diferentes fuentes de complemento ( ± s)

	% PMN reductores del NBT
Muestra	n	Suero inactivado^*	Suero activo	Suero ratón
Recién nacidos	46	16,7±0,53	26,4±0,73	32,6±0,98
Adultos	80	25,5±0,46	27,5±0,44	35,0±0,73

Fuente: Laboratorio de Inmunología del ISCM-VC. ^* p < 0,01.

En la figura se describe cómo el incremento en el porcentaje de leucocitos PMN que reducen al NBT en sangre de cordón umbilical de recién nacidos, es superior al mostrado entre los adultos cuando se eleva la disponibilidad de componentes del sistema complemento, con crecimientos del 58 y 95 % al utilizar suero activo o suero fresco de ratón respectivamente, muy superiores al 7,8 % y 39,2 % en adultos en iguales condiciones.

FIGURA. Comparación de los valores de reducción de azul de nitrotetrazolio utilizando suero inactivado (a), suero activo (b) o suero de ratón (c) en recién nacidos y adultos. Fuente: Laboratorio de Inmunología ISCM-VC.1.

Se destaca el hecho de que entre los adultos sólo se encontró un incremento de significación estadística con el uso de suero de ratón como fuente de opsoninas.

DISCUSIÓN

Miller⁸ halló que el eluato de levaduras incubadas en plasma de adultos contenía muy poca IgM, lo cual demostró la importancia de esta clase de inmunoglobulinas en la opsonificación de las levaduras. Como se precisa a su vez de una estrecha cooperación entre los

componentes del sistema complemento y los anticuerpos de la clase IgM para una marcada actividad opsónica, se puede comprender entonces, la necesidad de un sistema íntegro para la opsonificación de este microorganismo. La activación del sistema complemento lleva a la generación de componentes tales como C3b y C3bi, que actúan como opsoninas por unión con las partículas a que se fagocitarán y las hace susceptibles a la ingestión por una variedad de células que llevan receptores específicos para el complemento (CR),⁹ de los cuales CR1 y CR3 han sido descritos en detalle, y es CR1 específico para C3b y CR3 para C3bi.¹⁰

Una vez estimulada la membrana del leucocito por la adhesión a sus receptores de sustancias particuladas, se activan una serie de procesos bioquímicos que desempeñan una importante función en la activación bactericida.¹¹ La magnitud de este proceso, conocido por explosión respiratoria, puede valorarse al determinar la capacidad de los leucocitos PMN de reducir al NBT, el que entonces origina un precipitado citoplasmático de formazán como consecuencia de una reacción redox, donde intervienen enzimas oxidasas dependientes del nicotín-adenín dinucleotidofosfato (NADPH), que bajo activación adecuada catalizan la transferencia de electrones, vía una flavoproteína y el citocromo b-245 al oxígeno,¹¹ y se genera el anión superóxido.

En nuestros experimentos, si analizamos el efecto de los niveles crecientes de complemento sobre los resultados de la prueba de NBT, observamos un incremento esperado tanto en los recién nacidos como en los adultos del porcentaje de células reductoras. Sin embargo, fue inesperado el marcado incremento del recién nacido, especialmente cuando se deja de utilizar suero inactivado, que refleja una dependencia mucho más estrecha que en el adulto, para la fagocitosis de la levadura, de un adecuado nivel de complemento, y que pone de manifiesto factores intrínsecos, dependientes del leucocito PMN del neonato, y no sólo extrínsecos, dependientes de los niveles de opsoninas séricas, como había sido señalado por otros.¹² Nuestros resultados concuerdan con los estudios sobre receptores para complemento leucocitario, donde se ha comprobado que la estimulación de neutrófilos aislados induce una rápida movilización de los receptores para complemento de un gran pool citoplasmático, e incrementa su expresión sobre la superficie celular.¹³ Debido a que la mayor parte del C3 fijado sobre la levadura consiste en C3bi^7,14 la fagocitosis de levadura opsonizada requiere de poca unión a CR1, pero depende de CR3. Se ha comprobado además, que la unión de C3b a CR1 contribuye poco a la explosión respiratoria inducida por levaduras. En contraste con esto, anticuerpos monoclonales contra CR3 inhiben sustancialmente la producción de superóxido en iguales condiciones.¹⁵

La justificación a los requerimientos incrementados de componentes del sistema complemento del leucocito PMN neonatal, para promover un nivel dado de unión, ingestión y activación del metabolismo oxidativo en relación con el adulto, cuando se parte de los niveles bajos proporcionados por el suero neonatal, podría estar relacionada directamente con la observación de que la expresión máxima de CR3 en neutrófilos neonatales estimulados es del 75 % del valor del adulto¹⁶ no así CR1, donde el incremento es superior en el recién nacido,^13,16 lo que puede ser una de las causas de la respuesta del neonato a la infección, donde la limitada concentración de opsoninas en el sitio de ataque puede dañar la fagocitosis. La estabilidad alcanzada en la reducción del NBT en condiciones de un aporte de elementos del sistema de complemento apropiados, reflejan un metabolismo oxidativo del leucocito PMN del neonato intacto, hasta donde es capaz de hacerlo la prueba de reducción del NBT, prueba informada por otros autores³ con resultados elevados en el período neonatal en otras condiciones experimentales. El patrón aquí encontrado sería válido para aquellos microorganismos que siguen un modelo de opsonificación similar a la levadura, con estrecha dependencia de C3bi y CR3.

SUMMARY

The test for reducing nitroblue tetrazolium in granulocytes obtained from blood of the umbilical cord of 46 at term newborns with more than 2 500 g was performed. The control group was composed of 80 sound adults, who were volunteer blood donors. Normal adult serum, inactivated human serum at 56 ^oC, or mouse's fresh serum were used as sources to assess the different complement levels. The percentage of reducing neutrophil polymorphonuclear leucocytes (PMN) was remarkably inferior in the newborn (16,7 ± 3,6 %) compared with the adult (25.5 ± 4,2 %) when inactivated human serum was used as a source of opsonins. No significant differences were found on utilizing mouse's fresh serum or active adult serum. It is also stressed the reducing capacity of the PMN leucocyte in the newborn (58 and 95 %) on using active adult serum or the mouse's fresh serum, respectively, against the adult (7.8 and 39.2 %) under equal conditions.

Subject headings: NITROBLUE TETRAZOLIUM; NEUTROPHILS; INFANT NEWBORN; FETAL BLOOD; PHAGOCYTOSIS; COMPLEMENT.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Cairo MS. Neonatal neutrophic host defence. Am J Dis Child 1989;143:40-6.
2. Wilson CB. Immunologic basis for increased susceptibility of the neonate for infection. J Pediatr 1986;108:1--12.
3. Miler J. The Immunity of human foetus and newborn infant. London: Publisher The Lagne, 1983:88.
4. Bellanti JA. Immunology III. Philadelphia: WB. Saunders, 1985:10.
5. Hudson L. Neutrophil function test. En: Practical immunology. 2ed. Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1980:79-80.
6. Stelzner A. Phagozytose. En: Friemel, Immunologische Arbeit methoden. 3ed. Jena: Veb Gustav Fischer, 1984:252-81.
7. Cain JA, Bachen EA, Bricker PL. Role of complement receptor type three and serum opsonins in the neutrophil response to yeast complement.
8. Miller ME. Función fagocitaria en el neonato: aspectos seleccionados. Acta Pediatr 1980;4(10):38-44.
9. Expósito Rodríguez G, García Santana C, Valdés del Pozo Z. Estudio de la reducción intracelular del azul de nitrotetrazolio (NBT) por los leucocitos polininfonucleares de pacientes con cáncer de mama. Rev Cubana Invest Biomed 1989;8(1-2):32-45.
10. Ross GD. Immunobiology of the complement system. London: Academic Press, 1986:87.
11. Maly F, Nakamura M, Gauchat J, Urwyler A, Walker C. Superoxide dependent nitroblue tetrazolium reduction and expression of cytochrome b-245 components by human tonsillar ß lymphocytes and ß cell lines. J Immunol 1989;142:1260-67.
12. Gahr M, Blanke R, Speer CP. Polymorphonuclear leucocyte functions in term and pretum newborn infants. Biol Neonate 1985;48:15-20.
13. Adinolf M. Ontogeny of human complement receptors CR1 and CR3 expression of shese molecules on monocytes and neutrophils from maternal, newborn and fetal samples. Eur J Immunol 1988;18:565-9.
14. Kimberly RP, Chen B, Erlanger BF. Human mononuclear phagocytes express adenosine A1 receptor. J Immunol 1993;151:2775-85.
15. Salzmann HC, Gottlichen J. Phagocytosis of serum opsonized Zymosan duwn-regulates the expression of CR3 and F_c RI in the membrane of human monocytes. J Immunol 1988;141(10):3537-43.
16. Bruce MC, Baley JE. Impaired surface membrane expression of C3Gi but not C3b receptors on neonatal neutrophils. Pediatr Res 1987;21(3):306-11.

Recibido: 2 de mayo de 1995. Aprobado: 18 de octubre de 1996.

Dr. Alfredo Gutiérrez Maydata. Calle 8va. edificio 5, apartamento 7, entre 3ra. y 9na., reparto Escambray, municipio Santa Clara, provincia Villa Clara, Cuba.

¹ Especialista de II Grado en Bioquímica Clínica. Asistente. Instituto Superior de Ciencias Médicas de Villa Clara (ISCM-VC).

² Doctora en Ciencias Médicas. Especialista de I Grado en Inmunología. Profesora Titular. ISCM-VC.