Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto". Laboratorio de Medicina Herbaria

Efectos de la tintura de Melissa officinalis l. sobre íleon aislado y en modelo de diarreas

My. Alfredo J. Céspedes Valcárcel,¹ Lic. José de la Paz Naranjo,² Téc. Caridad Sebazco Pernas³ y Dra. María del C. Martínez Torres¹

1. Especialista de I Grado en Farmacología. Instructor.
2. Licenciado en Bioquímica.
3. Técnica A en Investigaciones Fisiológicas.

Se realizaron 2 estudios, uno in vitro en el íleon aislado de cobayo y otro in vivo en un modelo de diarreas en ratas, con el objetivo de corroborar la acción antiespasmódica de una tintura al 20 % de Melissa officinalis L. En el modelo in vitro se encontró que las dosis de 0,084, 0,169 y 0,338 mg/mL de solución nutricia provocan una disminución significativa (p < 0,05) de la contracción inducida con acetilcolina (10 mg/mL). En el estudio in vivo se determinó que las dosis de 16,9, 33,8 y 67, 6 mg/kg de peso disminuían el tiempo de aparición de la primera diarrea y su frecuencia. En ambos modelos el efecto estuvo en dependencia de las dosis. La tintura tuvo un efecto antiespasmódico en los 2 modelos utilizados y una acción antidiarreica sobre el modelo in vivo.

Palabras clave: MELISSA OFFICINALIS/uso terapéutico; ILEON; DIARREA/quimioterapia; COBAYOS; RATAS CONSANGUINEAS BB.

INTRODUCCION

La Melissa officinalis L., conocida como toronjil europeo, Melissa o hierba de limón es una planta oriunda del Mediterráneo. Su aceite esencial está compuesto por citrol, citronelal y geraniol, y contiene taninos, ácidos triterpénicos y orgánicos, resina y mucílago. El uso popular le ha atribuido propiedades como antiespasmódica, estimulante, sedativa, digestiva y antiemética.^1,2

En el presente trabajo se estudió la posible acción relajante del toronjil sobre la fibra lisa del tracto gastrointestinal mediante el uso de modelos in vitro e in vivo, lo que pudiera corroborar el efecto antiespasmódico que se le ha atribuido tradicionalmente a la planta.

MATERIAL Y METODO

MODELO IN VITRO EN ILEON AISLADO DE COBAYO

Como animales de experimentación se utilizaron cobayos machos adultos Hartley (n=8) procedentes del CENPALAB, con un peso entre 300 y 350 g, escogidos al azar mediante una tabla de números aleatorios. La Melissa officinalis L., se empleó en forma de tintura al 20 %, elaborada por la Empresa de Laboratorios Farmacéuticos "Saúl Delgado" con las siguientes características: líquido transparente de color ámbar amarillento; pH 6,2; densidad 0,9061; índice de refracción 1,366; sólidos totales 3,38 %; contenido alcohólico 66,38 % y contenido en acietes esenciales 0,04 %.

Los cobayos fueron privados de alimentos 24 horas antes del experimento. Las muestras de íleon fueron aisladas utilizando la técnica descrita por Magnus en 1904,³ y se fijaron mediante un hilo de seda negra 6/0 a un transductor isotónico fuerza-desplazamiento, que se conectó a un polígrafo Nihon- -Kooden RM-150. La señal se registró en papel milimetrado y se midió la fuerza de contracción.

Se utilizó un baño para órgano aislado de 20 mL de capacidad con solución tyroide a 35 ⁰C burbujeada con carbógeno. La tensión utilizada fue de 1 g. La preparación se estabilizó durante 1 hora y se cambió la solución cada 15 minutos. Se buscó la respuesta contráctil máxima del íleon en presencia de acetilcolina (10 mg/mL), comenzando con una dosis de 5 mL, la que se duplicó hasta lograr una contracción de igual magnitud con 2 dosis consecutivas; de éstas se tomó la menor dosis, lo que se consideró la respuesta máxima contráctil del órgano (contracción de máxima amplitud y 100 % de respuesta). Sobre la base de este valor se calcularon los valores relativos en porcentajes de respuesta contráctil del órgano a la acetilcolina y en presencia de la tintura.

Los registros se efectuaron siempre en el orden siguiente: basal; dosis de la droga; dosis de acetilcolina (contracción máxima amplitud); lavado x 3 cada 5 minutos y estabilización (10 minutos).

Las dosis y cantidades empleadas fueron: menstruo etanol 70/ H₂O 30 (200 m L); tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 0,042 mg/mL de baño (25 m L); tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 0,084 mg/mL de baño (50 m L); tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 0,169 mg/mL de baño (100 m L) y tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 0,338 mg/mL de baño (200 m L).

Los indicadores estudiados fueron: tensión (g), variación de la tensión (g) y porcentaje de variación de la tensión con respecto a la contracción de máxima amplitud.

ENSAYO IN VIVO EN MODELO DE DIARRREA⁴

Se utilizaron ratas Wistar hembras con un peso entre 180 y 200 g, las que procedían del CENPALAB. Los animales se mantuvieron en ayunas 24 horas antes del experimento y se les suministró agua suficiente según sus requerimientos. Las ratas fueron asignadas de forma aleatoria a 5 grupos, cada uno con 15 animales (n=15).

• Grupo 1 (control). No se administró droga.
• Grupo 2 (menstruo). Se administró una solución hidroalcohólica al 70 % en un volumen de 400 m L (mayor volumen utilizado en los grupos experimentales).
• Grupo 3 , Se administró tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 16,9 mg/kg de peso.
• Grupo 4. Se administró tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 33,8 mg/kg de peso.
• Grupo 5. Se administró tintura de Melissa officinalis L. al 20 % en una dosis de 67,6 mg/kg de peso.

La droga sujeta a prueba fue administrada por vía oral y 1 hora después se suministró 1 mL de aciete de castor mediante una sonda gástrica. Se observó la evolución de cada animal en jaulas individuales, de forma continua, para detectar la presencia de deposiciones durante un período de 120 minutos a partir de la administración del purgante. Las variables estudiadas fueron tiempo de aparición de la primera deposición y su frecuencia. Las dosis que se utilizaron fueron calculadas sobre la base del estudio realizado previamente en el órgano aislado.

ANALISIS ESTADISTICO

Los datos fueron introducidos en un ordenador y almacenados. Después de comprobada la normalidad de los datos y la homogeneidad de sus varianzas se realizó el ANOVA de una sola vía o el test de Kruskal-Wallis según se requiriera, y un test a posteriori para determinar dónde se encontraban las diferencias. Se elaboraron tablas para exponer los resultados y curvas dosis-respuesta para determinar la recta de mejor ajuste y se aplicó test de correlación para buscar asociación entre las variables. Se fijó como criterio de significación la p < 0,05.

RESULTADOS Y DISCUSION

ENSAYO IN VITRO

La respuesta máxima contráctil de acetilcolina no varió de forma significativa con el uso del menstruo y la dosis de 25 m L de la tintura. Sin embargo, las dosis de 50, 100 y 200 m L de la droga provocaron una variación significativa de la contractilidad del órgano estudiado; los valores medios, desviación estándar y la magnitud de sus diferencias se exponen en la tabla 1.

TABLA 1. Media, desviación estándar y variación de tensión en íleon de cobayo estimulado con acetilcolina con el uso de la tintura de Melissa officinalis. L.

	Tensión (g)
Dosis	n	Media	DE	Variación de la tensión (g)	Sigficación
Basal	8	5,71	1,08	-	-
Solvente	8	5,64	1,52	-0,07	ns
25 m L	8	5,20	1,29	-0,50	ns
50 m L	8	4,93	1,38	-0,7	p < 0,05
100 m L	8	4,47	1,07	-1,25	p < 0,05
200 m L	8	3,51	1,19	-2,20	p < 0,05

ns = no significativo.

Los porcentajes relativos de respuesta contráctil y su variación con respecto a la respuesta máxima contráctil fueron de 98,75; 91, 12; 86,40; 78,22 y 61,50 % para el solvente y las dosis de 25, 50, 100 y 200 m L de la droga respectivamente. La curva dosis-respuesta y la recta de mejor ajuste, elaboradas con los datos recogidos en el experimento, pusieron de manifiesto que el coeficiente de correlación entre las variables dosis y respuesta fue muy alto (r = 96,26) y con un nivel de significación menor de 0,05 (tabla 2).

TABLA 2. Curva dosis-respuesta y recta de mejor ajuste del efecto de la tintura de Melissa officinalis L. sobre el íleon aislado de cobayo.

Dosis		Efecto (relajación)
m L	log. dosis	Observado	Calculado
25	1,39794	8,88	6,13
50	1,69897	13,60	15,84
100	2,0000	21,78	25,54
200	2,301030	38,50	35,25

p < 0,05 r = 96,26

ENSAYO IN VIVO

Las 2 variables estudiadas (tiempo de aparición de la primera diarrea y frecuencia de diarreas) variaron de forma significativa (p < 0,05), cuando se compararon las 3 dosis de Melissa officinalis L. con el menstruo y el grupo control. La comparación entre sí del menstruo y del grupo control presentó también diferencias significativas (tablas 3 y 4).

TABLA 3. Valores medios y desviación estándar de la frecuencia de diarreas con el uso de la tintura de Melissa officinalis L.

Dosis	Frecuencia
mg/kg	n	Media	DE	Significación
Control	15	2,80	0,56	-
Placebo	15	2,46	0,74	* p < 0,05
16,90	15	1,33	0,97	** p < 0,05
33,80	15	0,80	0,67	** p < 0,05
67,60	15	0,33	0,48	** p < 0,05

* Con el control. ** Con control y placebo

TABLA 4. Valores medios y desviación estándar del tiempo de aparición de la primera diarrea en ratas con el uso de la tintura de Melissa officinalis L.

Dosis (min)	Tiempo de aparición de la primera deposición
mg/kg	n	Media	DE	Significado
Control	15	59,13	12,52	-
Placebo	15	59,60	15,31	* p < 0,05
16,90	15	67,73	28,27	** p < 0,05
33,80	15	81,26	29,99	** p < 0,05
67,60	15	108,40	19,66	** p < 0,05

* Con el control. ** Con control y placebo

Al analizar los valores calculados y observados de la curva dosis-respuesta donde se evalúa el tiempo de aparición de la primera diarrea se obtuvo en coeficiente de correlación alto (r = 0,9817) pero un valor de p "no significativo" (p > 0,05) (tabla 5).

TABLA 5. Curva dosis-respuesta y recta de mejor ajuste de la actividad antidiarreica de la tintura de Melissa officinalis L. sobre el modelo en ratas

Dosis		Efecto (min)*
mg/kg	log. dosis	Observado	Calculado
16,90	1,23	67,73	65,03
33,80	1,53	81,26	85,86
67,60	1,83	108,40	106,06

r = 0,9817 p > 0,05. * Tiempo de aparición de la primera deposición

La Melissa officinalis L. es una planta que se ha estudiado para comprobar propiedades antiinflamatorias.⁵ Su composición química fundamental se ha informado en algunos trabajos,⁶ sin embargo, en la literatura revisada no se encontraron estudios sobre sus efectos en el tracto gastrointestinal que permitieran comparar los resultados obtenidos por los autores.

En el presente trabajo se observó que la tintura de Melissa officinalis L. al 20 % redujo de modo significativo la contracción provocada por la acetilcolina sobre el íleon aislado de cobayo con dosis de 0,084; 0,169 y 0,338 mg/mL de solución. Este efecto se manifestó en forma "dosis-dependiente". El menstruo y la dosis de 0,042 mg/mL no modificaron significativamente la contracción, por lo que se atribuyó el efecto encontrado a la planta, pues al ser esta dosis la más baja de las utilizadas no se descarta que resulte insuficiente para llegar al umbral de respuesta y en el caso del menstruo, por la inexistencia del principio activo.

En el modelo de diarrea en ratas, los resultados fueron similares a los del modelo in vitro ya que las dosis utilizadas, calculadas teniendo en cuenta el experimento anterior, variaron de forma significativa la motilidad del tracto gastrointestinal de los animales de experimentación y provocaron una disminución en la frecuencia de diarreas y una prolongación del tiempo de aparición de la primera diarrea, aunque el menstruo utilizado evidenció diferencias significativas cuando se comparó con el grupo control, lo que se esperaba por estar descrito en la literatura,^7,8 ya que el etanol puede tener efectos constipantes al disminuir la motilidad del tracto gastrointestinal. No se puede afirmar que éste sea la principal causa de la disminución de la frecuencia de diarreas en los grupos tratados con la tintura, pues en los animales en que se utilizó la Melissa officinalis L. hubo una diferencia significativa de efecto cuando se compararon con los que recibieron el menstruo.

Otro elemento que corrobora estos resultados es la característica dosis-dependiente que mostró el efecto estudiado y la dosis de alcohol utilizada en el menstruo, igual a la que tenía el mayor volumen administrado de tintura (67,6 mg/kg de peso); sin embargo, difirió de manera significativa al ser comparada con la menor dosis aplicada (16,9 mg/kg de peso), que posee la menor cantidad de alcohol. Aunque el comportamiento de la curva dosis-respuesta no se ajusta a un modelo lineal puede decirse que el efecto está en dependencia de la dosis.

Los resultados obtenidos favorecen la continuación de estudio de la planta con el objetivo de ser empleada en el tratamiento de afecciones del tracto gastrointestinal.

Otros autores han encontrado efectos analgésico y sedante de la planta en modelos experimentales,⁹ lo que propicia su actividad terapéutica como antiespasmódica en el dolor de tipo visceral.

La acción farmacológica de la planta encontrada en los estudios preclínicos realizados corrobora de forma experimental -con 2 modelos (in vitro e in vivo)- el uso que como antiespasmódico le atribuye la medicina popular. El complemento de este trabajo con una investigación toxicológica permitiría someter a consideración de las autoridades reguladoras la ejecución de un ensayo clínico controlado para comprobar la actividad terapéutica de la planta en seres humanos.

CONCLUSION

La tintura de Melissa officinalis L. al 20 % tiene un efecto antiespasmódico dependiente de la dosis en los modelos de íleon aislado de cobayo y de diarreas en ratas.

SUMMARY

Two studies were carried out: one in vitro in the guinea pig isolated ileum, and the other in vivo, in a diarrhea model in rats, with the purpose of confirming the antispasmodic action of a 20 % Melissa officinalis L. tincture. In the in vitro model, it was found that the 0,084; 0,169 and 0,338 mg/mL doses of nutritious solution provoke a significant decrease (p < 0,05) of the acetylcholine induced contraction (10 mg/mL). In the in vivo study, it was determined that 16,9; 33,8 and 67,6 mg/kg of weight doses decreased the time of appearance of the first diarrhea, and its frequency. In both models the effect was dependent on the doses. The tincture had an antispasmodic effect in the two models used, and an antidiarrheic action on the in vivo model.

Key words: MELISSA OFFICINALIS L./therapeutic use; ILEUM; DIARRHEA/drug therapy; GUINEA PIGS; RATS, INBRED BB.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Roig JT. Plantas medicinales aromáticas o venenosas de Cuba. La Habana: Ciencia y Técnica, 1971:561-2.

2. Cuba. Ministerio de Salud Pública. Plantas medicinales. Fitomed I. La Habana: Editorial Ciencias Médicas, 1991:58.

3. Sainz F, Miyares C, García M. Técnica de farmacología experimental. La Habana: Ciencia y Técnica, 1972:131-5.

4. Litter M. Farmacología experimental y clínica. 6 ed. Buenos Aires: El Ateneo, 1983:904-9.

5. Englberger W, Hadding U, Etschenberg E, Graf E, Leyek S, Winklmann J, et al. Rosmarinic acid: a new inhibitor of complement C-3 convertase with anti-inflammatory. Int J Inmunopharmacol 1988;10(6):729-37.

6. Mulkani A, Kapetanidis I. Flavonoids of the leaves of Melissa officinalis. Pharm Acta Helv 1987;62(1):19-22.

7. Rall TW. Hipnóticos y sedantes: etanol. En: Goodman y Gilman eds. Las bases farmacológicas de la terapéutica. 8 ed. New York: Editorial Médica Panamericana, 1991:345-80.

8. Bowman W, Rand MJ. Farmacología: bases bioquímicas y patológicas, La Habana: Instituto Cubano del Libro, 1984; t.11. 8-10. (Edición Revolucionaria.)

9. Saulimani R, Fleurentin J, Misslin R, Derrien G, Pelt JM. Neurotropic action of the hydroalcoholic extract of Melissa officinalis in the mouse. Planta Med 1991;57(2):105-9.Recibido: 13 de octubre de 1995. Aprobado: 19 de diciembre de 1995.

My. Alfredo J. Céspedes Valcárcel. Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto". Avenida Monumental, Habana del Este, CP 11700, Ciudad de La Habana, Cuba.