Artículo original

 

 

EFECTO DE LA ADICIÓN DE FSH Y LH EN EL MEDIO SOBRE LA MADURACIÓN Y EL DESARROLLO EMBRIONARIO in vitro DE OVOCITOS DE CERDA

 

EFFECT OF THE ADDITION OF FSH AND LH IN MEDIUM ON THE MATURATION AND THE EMBRYONIC DEVELOPMENT in vitro OF OOCYTES OF SOW

 

 

F. Fernández Reyes*, J.E. Hernández Pichardo* y María del Rocio Rosales Ávila**

*Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal. Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco (UAM-X). Calzada del Hueso 1100, Colonia Villaquietud, Delegación Coyoacán, CP. 04960, México, D.F. **Clínica Privada

 

 

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RESUMEN

Se recuperaron 1025 ovocitos de ovarios de cerdo obtenidos en mataderos, de estos 165 (tratamiento 1) se maduraron con 0.75 U.I. de FSH y 0.75 U.I. de LH y 125 (tratamiento 2) con 1.5 U.I. de FSH y 1.5 U.I. de LH, la maduración fue evaluada por fijación con alcohol-ácido acético y teñido con orceína acética. Se obtuvo un 40 % y 39.2 % de ovocitos madurados para los tratamientos 1 y 2 respectivamente, sin diferencia estadística significativa entre los mismos. En los dos tratamientos para la fertilización in vitro se evaluó la maduración de los ovocitos mediante la observación de cuerpo polar, los cuales fueron divididos en dos grupos: se obtuvieron 155 ovocitos madurados con el primer tratamiento y 137 ovocitos con el segundo tratamiento, lo que corresponde a 42.1% y 37.3% de madurados, respectivamente. Como resultado de la fertilización in vitro se obtuvieron 122 embriones en sus diferentes etapas alcanzando, 76 embriones en el primer tratamiento y 46 con el segundo tratamiento, para un 49%^a y 33.5%^b (a diferente de b P<0.05). Se concluye que si bien el suplemento de FSH y LH al medio de maduración TCM-199 in vitro, no afectó significativamente la maduración, en el desarrollo de embriones se obtuvo un mayor porcentaje de mórulas y desarrollo embrionario con el empleo de 0.75 U.I. de FSH y 0.75 U.I. de LH.

Palabras clave: cerdo; ovocito; embrión; maduración in vitro; fertilización in vitro

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ABSTRACT

One thousand twenty five oocytes from sow ovaries, obtained in slaughter houses were recovered. From them, 165 (treatment 1 ) were matured with 075 U.I. of FSH and 0.75 U.I. of LH, and 125 (treatment 2 ) with 1.5 U.I. of FSH and 1.5 U.I. of LH. Maturation was evaluated by fixation with alcohol-acetic acid and stained with acetic orcein. There was a 40% and 39% of maturated oocytes from the treatments 1 and 2 respectively, without significant statistical differences among them. In the two treatments for in vitro fertilization, the maturation of oocytes was evaluated by polar body observation. They were divided into two groups: one having 155maturated with the first treatment and the other having 137 oocytes with the second treatment, which corresponded to a 42.1% and 37.3% respectively . As result of in vitro fertilization, 122 embryos were obtained in their different stages, reaching 76 with the first treatment and 46 with the second one, for a 49% and 33.5% (a different fom b p <0.05) respectively . It is concluded that even though FSA and LH supplement to the maturation medium TCM-199 (in vitro) did not significantly affect such maturation, in the development of embryos, there was a higher percentage of morulas and embryonic development with the use of 0.75U.I. of FSH and 0.75 0.75U.I: of LH.

Key words: pig; oocyte; embryo; maturation in vitro; fertilization in vitro

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INTRODUCCIÓN

Los ovocitos son células altamente especializadas y las únicas dependientes de la introducción de ácido desoxirribonucleico (ADN) externo, proveniente del espermatozoide para poder llevar a cabo las siguientes fases de desarrollo (1). Los ovocitos pueden ser obtenidos de ovarios provenientes de animales sacrificados en el matadero, los cuales son una fuente abundante de ovocitos obtenidos a bajo costo, que pueden ser madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta estados avanzados del desarrollo embrionario (2,3). El diámetro del ovocito y la morfología del complejo cúmulo-ovocito (COCs), son buenos indicadores de la competencia ovocitaria para producir embriones (4). Se ha demostrado que la maduración in vitro (MIV) de ovocitos de cerda en medios definidos, produce embriones viables (5). Las secuencias detalladas de los eventos que ocurren durante el crecimiento del ovocito in vivo deben imitarse lo máximo posible, para soportar el crecimiento del ovocito in vitro (1). Para incrementar la eficiencia y reproductividad en la MIV y fecundación in vitro (FIV), así como el desarrollo embrionario, se han creado medios definidos, estos medios son suplementados con polivinil alcohol (PVA), cisteína, glucosa, piruvato de sodio, factor de crecimiento epidérmico (EGF), LH y FSH (5). En la cerda se han realizado diferentes modificaciones en las técnicas para cultivo de embriones, la adición de hormonas FSH y LH, así como EGF en los medios de cultivo para maduración de los ovocitos han resultado más eficientes, con ellas se han obtenido embriones de calidad y aptos para su desarrollo (6). Los COCs recuperados de los folículos pueden ser madurados in vitro en un medio adecuado como el TCM-199, suplementado con FSH y LH (7). Asimismo se han utilizado diversos medios de maduración (8,9,10), de los cuales el más común es el medio TCM-199 suplementado con gonadotropinas. La FSH induce expansión de las células del cúmulo y maduración nuclear in vitro (11). Mattioli et al. (12) demostraron que la mezcla de FSH y LH acelera y facilita la progresión mitótica del ovocito. La estimulación con FSH, tiene un efecto positivo sobre la calidad de los ovocitos para MIV obtenidos por punción folicular (13). La interacción paracrina entre el ovocito y los factores circundantes de las células de la granulosa es crítica in vivo para el desarrollo y función normal del mismo (14). En la MIV se debe prestar especial atención al manejo del pH y la temperatura, para asegurar la síntesis de proteínas y mantener estable la morfología del eje meiótico, ya que las alteraciones en estos parámetros ocasionan una disminución sobre la capacidad de maduración y fertilización de los ovocitos (15). A pesar de que las condiciones de cultivo para la MIV de los ovocitos de especies domésticas se han mejorado notablemente, la capacidad de desarrollo de los ovocitos madurados in vitro aún es limitada (16).

Una vez que los COCs han madurado y los espermatozoides han sido capacitados in vitro, se hace la FIV, para que ocurra la penetración de espermatozoides capacitados en los ovocitos madurados (1), para concluir este proceso ambos gametos deben ser cocultivados en medio TCM-199 (17), por unas 6 horas (18). Los embriones obtenidos pueden ser transferidos a receptoras sincronizadas o congelados (19) El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto de dos concentraciones de FSH y LH sobre la maduración de ovocitos de cerda.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron 300 ovarios de cerda provenientes del Rastro Frigorífico "Los Arcos" y fueron depositados en un termo con 500 mL de NaCl al 0.9 % adicionada con antibiótico antimicótico a temperatura ambiente y se transportaron al laboratorio "Manejo de la Reproducción" de la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad-Xochimilco en un tiempo no superior a dos horas y a una temperatura de entre 25⁰ C y 30⁰ C, de acuerdo a lo propuesto por Ducolomb et al., (5). Una vez en el laboratorio los ovarios se lavaron 3 veces (500 mL) por lavado, con la misma solución, está se encontraba a temperatura ambiente.

Los COCs fueron obtenidos por aspiración de folículos de 3 a 5 mm, con una jeringa de 10 mL y aguja (Needle) de 1 ½ calibre 1.20 mm x 38 mm, el contenido de las jeringas se vertió en tubos cónicos de 50 mL estériles, posteriormente se dejó sedimentar media hora, se extrajo el sobrenadante y se hicieron tres lavados posteriores con medio (TL-HEPES-PVA) con intervalos para la sedimentación de 15 minutos, después del último lavado se obtuvo el paquete celular el cual se depositó en una placa de Petri donde se procedió a buscar y seleccionar los ovocitos con citoplasma uniforme, y rodeados de una masa compacta de células del cúmulo.

Los criterios de selección fueron los descritos por Sánchez y Silva, (13), bajo lupa estereoscópica a un aumento de 20X, fueron clasificados como aptos (categorías I y II) y no aptos (categorías III y IV) para la MIV, basándose en las características de las células del cumulus oophurus, corona radiada y la homogeneidad del citoplasma.

- Ovocitos categoría I (Excelentes). Presentan citoplasma oscuro uniforme combinado con 5 ó más capas compactas del cumulus.

- Ovocitos categoría II (Buenos). Presentan citoplasma oscuro uniforme conjuntamente con una corona radiada completa, pero menos de 5 capas del cumulus.

- Ovocitos categoría III (Regulares). Presentan una pérdida de la uniformidad del citoplasma, la corona radiada se presenta incompleta y las capas del cumulus presentes son menos compactas.

- Ovocitos categoría IV (Malos). Presentan citoplasma no homogéneo o francamente fragmentado y las células de la corona y del cumulus se encuentran disgregadas o ausentes en su totalidad.

El cultivo in vitro se realizó de acuerdo a lo propuesto por Casas et al., (20) y Ducolomb et al., (5). Los COCs fueron clasificados en dos grupos:

Tratamiento 1: medio comercial TCM-199 con sales de Earle, L-Glutamina y bicarbonato de sodio libre de proteínas (IN VITRO, México), suplementado con D-glucosa, piruvato de sodio, PVA, cisteína, EGF, 0.75 U.I. FSH y 0.75 U.I. LH (Merional de IBSA) correspondiente a (10 ul/mL).

Tratamiento 2: Igual mismo medio de cultivo pero con un suplemento de 1.5 U.I. FSH y 1.5 U.I. LH (Merional de IBSA) correspondiente a (20 ìl/mL). Los ovocitos fueron lavados tres veces en su respectivo medio de maduración y fueron cultivados in vitro en placas de 4 posillos (Nunc) con 500 ìl de medio de maduración de acuerdo a su respectivo tratamiento, cubierto con aceite mineral (Sigma), posteriormente se incubaron a 38.5ºC con 5 % de CO2 en aire y humedad a saturación por 44 horas.

Después de la MIV, las células del cúmulo fueron removidas con 300 ìl de hialuronidaza al 0.1 %. La maduración de los ovocitos fue evaluada mediante la técnica de orceina acética al 1 % en ácido acético al 45 %. Para lo cual se colocaron entre un porta objetos y un cubre objetos para fijarlos con ácido acético y etanol (1:3) por 48 horas.

Los ovocitos se clasificaron de la siguiente manera; aquellos con Vesícula Germinal como; no maduros, los que presentaron cromatina en Metafase I se consideraron; en proceso de maduración, y aquellos que presentaron Cuerpo Polar y Metafase II como; maduros.

Los ovocitos desnudos se lavaron dos veces en gotas de 500 ìl de medio de maduración (TCM-199 suplementado) y tres veces en gotas de 500 ul en medio amortiguador con Tris (TBM), después se observó la presencia de cuerpo polar y se procedió a hacer la FIV, en una placa de 4 posillos se colocaron de 40 a 50 ovocitos, en gotas de 50 ìl de medio TBM cubiertas con aceite mineral, a las cuales se adicionaron 50 µl de una solución que contenía una concentración final de 5x10⁵ espermatozoides por mL, posteriormente se incubaron a 38.5º C, con 5 % de CO² en aire y humedad a saturación, por 5 horas, Trascurrido este tiempo fueron cambiados a medio de desarrollo embrionario, para lo cual se lavaron tres veces en gotas de 50 ul medio North Carolina State University-23 (NCSU-23) suplementado con BSA libre de ácidos grasos al 0.4 %; después se transfirieron a gotas de 500 ìl del mismo medio cubiertas con aceite mineral en placas de cuatro posillos, y se incubaron en las mismas condiciones durante 120 horas.

El desarrollo embrionario fue evaluado en un microscopio invertido a 400X y los resultados fueron analizados mediante la prueba de Ji-cuadrada, (21,22).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se obtuvo un total de 1025 ovocitos, de los cuales se utilizaron 290 para evaluar maduración con adición de 2 concentraciones diferentes de FSH y LH al medio, mediante la técnica de fijación de alcohol ácido acético y tinción con orceína acética y 735 para los 2 tratamientos con observación de cuerpo polar y desarrollo embrionario.

Los resultados de maduración de 37.3 % a 42.1 %, en los 2 tratamientos (Tablas 1 y 2), fueron similares al reportado por Mattioli et al., 35% (12) al adicionar 10% de suero fetal bovino al medio de maduración, pero inferior al 76% que obtuvieron al adicionar 50 ng/mL de LH y 86% al adicionar 50 ng/mL de FSH. Resultados muy similares reportan Marchal et al. (23), al obtener 44% de maduración al adicionar 400 ng/mL de pFSH en ovocitos obtenidos de folículos de un tamaño menor a 3 mm, pero el porcentaje de maduración con esa misma concentración de hormona fue de 86% cuando los folículos median más de 5 mm. Por otra parte Ducolomb et al., (5), reportan 82% de maduración al suplementar con LH 0.5 µg/mL y FHS 0.5 µg/mL. Estos hallazgos concuerdan con la importancia que tienen las gonadotropinas según lo mencionan Marchal et al. (23), en que son uno de los factores decisivos en la MIV, ya que mejoran la maduración nuclear y la expansión del cúmulo.

El porcentaje de desarrollo embrionario 49% y 33.5%, del tratamiento 1 y 2, (Tabla 3), es inferior al 70% de ovocitos fertilizados reportados por Ducolomb et al. (5). El estadio de desarrollo embrionario que sobresalió fue la etapa de mórula con el 28.3%, en el Tratamiento 1, en tanto que Ducolomb et al., (5), reportan 14% en estado de blástula. Por otra parte Marchal et al., (23), obtuvieron 53% de fertilización y 3% de blastocistos en folículos pequeños, 73% de fertilización y 14% de blastocistos en folículos medianos y 77 % de fertilización y 23% de blastocistos en folículos grandes. Esta diferencia en el desarrollo embrionario comparado con otros autores puede ser por la manipulación durante el proceso. En tanto que la diferencia observada a favor del tratamiento 1, puede ser debido a que las concentraciones de FSH y LH actúen en forma sinérgica, permitiendo de manera particular la acción de la LH sobre la maduración del citoplasma, lo que facilita la formación del pronúcleo masculino y el desarrollo embrionario. Además la LH interviene en la selección de las moléculas enviadas por las células somáticas al ovocito y puede ser importante en el efecto regulatorio que ejercen durante la maduración del mismo (12).

En el presente estudio no se obtuvieron blastocistos en un periodo de incubación de 120 horas, posiblemente porque el desarrollo embrionario está comprometido con defectos de maduración de los ovocitos Hunter, (24). Estos defectos pueden ser ocasionados desde el momento de la obtención de los COCs por el método de punción ya que puede ocasionar un daño del 20%. Esta disminución en las tasas de recuperación puede estar asociada a efectos nocivos sobre las capas de las células del cúmulo, ejercidas por la fuerza de aspiración Muñoz, (25). Aunque los ovocitos porcinos de MIV/FIV puedan convertirse en blastocistos en un medio de cultivo simple de maduración con gonadotropinas, la eficacia es relativamente baja (26). Asimismo Coy et al., (17), plantean que aunque se ha demostrado que pueden producirse cerdos vivos mediante FIV, los avances en esta área han sido escasos debido principalmente a las dificultades en la maduración de los ovocitos, la técnica de la FIV propiamente dicha y el cultivo de embriones. En México, Ducolomb et al., (5), han llevado a cabo estudios utilizando la metodología de FIV en cerdos, a la fecha se tiene un reporte de dos cerditos nacidos por esta técnica, lo cual hace necesario el ampliar este espacio de conocimiento

Se concluye que el suplemento de 0.75 U.I. FSH y 0.75 U.I. LH, comparado con el suplemento de 1.5 U.I. FSH y 1.5 U.I. LH, al medio de maduración TCM-199 in vitro, no afectó significativamente la maduración. Posiblemente existe un nivel de saturación en los receptores afines a estas hormonas, de tal forma que aunque se adicione una mayor concentración no se observe ningún incremento en la maduración nuclear o del citoplasma del ovocito.

La tinción con orceína acética es un método útil para evaluar la maduración, ya que es más fácil de realizar y resultó muy similar a la evaluación de la presencia de cuerpo polar.

Después de la fertilización in vitro, se obtuvo un mayor porcentaje de embriones y mórulas con el primer tratamiento, posiblemente porque en estas concentraciones las hormonas actúan en forma sinérgica y de esta forma se manifieste la acción de la LH sobre la maduración del citoplasma, lo que facilita la formación del pronúcleo masculino y el desarrollo embrionario. Es necesario realizar más estudios para confirmar la acción de las gonadotropinas en la MIV de ovocitos de cerda y su desarrollo embrionario in vitro.

Se logró un mejor resultado con 0.75 U.I. FSH y 0.75 U.I. LH, a pesar de las dificultades conocidas y la necesidad de más estudios para corroborar lo obtenido.

 

AGRADECIMIENTOS

Al Rastro Los Arcos de Los Reyes La Paz, Estado de México, por la donación de los ovarios.

 

REFERENCIAS

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(Recibido 3-1-2009; Aceptado 7-5-2009)