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Revista de Salud Animal

versión ISSN 0253-570X

Rev Salud Anim. vol.33 no.3 La Habana oct.-dic. 2011

 

TRABAJO ORIGINAL

 

 

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN in vitro DE CEPAS DE Lactobacillus spp. COMO CANDIDATO A PROBIÓTICAS

 

In vitro ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF Lactobacillus spp. STRAINS AS A PROBIOTIC CANDIDATE

 

Lilian Sánchez1*, J. Vichi*, Marisleidys Llanes*, Erica Castro**, Dulce M. Soler*, Ivette Espinosa*, G.L. Kociubinski***, Celia L. Ferreira****

 

 

1Dirección Producciones Biofarmacéuticas, *Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Apartado 10, San José de las Lajas, La Habana. Correo electrónico: lilian@censa.edu.cu; **Universidad de Concepción. Chile; ***Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Argentina; ****Universidad Federal de Viçosa, Viçosa, Av. PH Rofs, 36570 000, Brazil

 

 


RESUMEN

El uso de los lactobacilos como probióticos en los últimos años cobra un interés creciente debido a sus propiedades benéficas en animales y humanos. Con el objetivo de aislar y caracterizar cepas vaginales de Lactobacillus spp., mediante pruebas in vitro para considerar su posterior aplicación como probiótico se aislaron 24 cepas identificadas a nivel de grupo por el perfil de fermentación de carbohidratos y la producción de gas a partir de la glucosa. A todas las cepas se les determinó su estabilidad de crecimiento a pH ácidos y a diferentes temperaturas. De ellas se seleccionaron 9 que presentaron las mejores características como candidatos a probióticas por sus resultados en las pruebas de hidrofobicidad frente a solventes orgánicos como tolueno, xileno y hexadecano, hemaglutinaron frente a eritrocitos humano, auto-agregaron, coagregaron con Escherichia coli y Candida albicans e inhibieron el crecimiento de estos patógenos. Se evaluó el perfil de susceptibilidad a 17 antimicrobianos y revelaron resistencia a 7 de ellos.

Palabras clave: Lactobacillus; probiótico.


ABSTRACT

The use of lactobacilli as probiotics in recent years had has an increased interest due to their beneficial properties in animals and humans. In order to isolate and characterize Lactobacillus spp. vaginal strains by in vitro tests to consider their subsequent application as a probiotic, 24 strains identified at group level by the carbohydrate fermentation profile and gas production from glucose were isolated. Growth stability of all strains was determined at acid pH and at different temperatures. From them, 9 strains were selected showing the best probiotic characteristics as candidates by their scores on tests of hydrophobic versus organic solvents such as toluene, xylene and hexadecane positive hemagglutination against human erythrocytes, autoaggregation, coaggregation with Escherichia coli and Candida albicans, inhibiting the growth of these pathogens. The susceptibility profile of 17 antimicrobials was evaluated, showing resistance in 7 of them.

Key words: Lactobacillus; probiótico.


INTRODUCCIÓN

En el hombre, los animales y las plantas se encuentran los lactobacilos por ser huéspedes naturales. Los lactobacilos representan el grupo de bacte rias ácido láctico (BAL) más difundido ya que pueden crecer en todos los hábitats que contengan azúcares fermentables, productos hidrolizados de proteínas, vitaminas, factores de crecimiento y baja tensión de oxígeno. Tienden a dominar numéricamente y limitan o impiden el desarrollo de microorganismos patógenos por ser buenos productores de ácido láctico y de sustancias antimicrobianas (1,2).

Muchas de las propiedades de los lactobacilos hacen que puedan ser clasificados como probióticos, microorganismos vivos que ingeridos en cantidad adecuada confieren un beneficio saludable en el huésped (3,4). La mayoría de las cepas que se emplean como probióticos, pertenecen al género Lactobacillus, que son comensales humanos y se han aplicados históricamente de forma segura en la fermentación de alimentos, aspectos que garantizan su inocuidad. Sin embargo, a pesar de que estas bacterias se consideran seguras (GRAS), se recomienda por la OMS que sean sometidas a pruebas para que su aplicación no tenga efectos colaterales, que afecten negativamente la salud del huésped (5).

En los inicios se consideraba que los microorganismos que se emplearían como probióticos, debían formar parte de la flora normal del intestino de la especie animal a la que se suministraran, sin embargo, posteriormente esta condición no se consideró indispensable siendo más importante los efectos beneficiosos que ocasionaban en el huésped así como su inocuidad (6). Para que la administración de bacterias ácido lácticas como probióticas, tanto en humanos como en animales, sea exitosa, tienen que ser resistentes a condiciones específicas (7).

Entre las propiedades más importantes está la capacidad de atravesar la barrera digestiva para que se puedan multiplicar y colonizar el intestino, ser estable durante el proceso de producción, comercialización distribución y que lleguen vivo a su destino. Deben poseer actividad antimicrobiana porque esta característica hace que las BAL, cuando se administran en cantidad adecuada, tengan potencial para generar una barrera frente a los patógenos. Generalmente, la adhesión a células epiteliales está considerada como un factor importante para lograr la colonización y prerrequisito esencial para ejercer una actividad probiótica sin embargo, hay quien considera que un rápido crecimiento del microorganismo puede lograr el mismo fin (7,8, 9).

Dado que existen numerosos reportes en la literatura sobre la presencia de lactobacilos en heces y vaginas (9, 10, 11), en este trabajo se propone, a partir de aislamientos hechos en vagina humana, detectar mediante experimentos in vitro, cepas de lactobacilos con propiedades probióticas con posibilidad de usarse en humanos o animales.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Medios y condiciones de cultivo 

Las bacterias ácido lácticas aisladas se cultivaron en caldo o agar Mann Rogosa Sharp (MRS, BioCen) a 37°C durante 24-48 horas, sin agitación y para el crecimiento en agar, se emplearon jarras de anaerobiosis bajo una atmósfera de CO2 de un 10 %. Como medio de conservación a corto plazo se utilizó medio agar y caldo MRS a 4-8°C con pases mensualmente. Para la conservación a largo plazo, se utilizó caldo MRS con un 30% de glicerol y el medio conformado por leche descremada (10%), extracto de levadura (0,5%), y glucosa (1 %), a 20°C.

Obtención y procesamiento de la muestra

Las cepas de microorganismos se obtuvieron de muestras vaginales de 198 mujeres sanas de la provincia Mayabeque, Cuba. El tiempo transcurrido entre la recolección de las muestras y su procesamiento fue de aproximadamente 10 minutos. Las muestras vaginales, previo consentimiento de las donantes y con conocimiento pleno del uso posterior, fueron recolectadas directamente con un hisopo estéril que se introdujeron directamente en tubos con 5 mL de caldo MRS durante 8 horas. Posteriormente, se realizaron diluciones seriadas (1/10, 1/100, y 1/1000) en solución tampón fosfato- salino (PBS) y se sembró 0,1- 0,2 mL en placas Petri con agar MRS, que fueron incubadas a 37°C en anaerobiosis durante 48 horas. Se escogieron aquellas placas en las que el número total de colonias crecidas se encontraba entre 100 y 150, se tomaron entre 10 y 12 colonias equivalente a la raíz cuadrada del total de ellas, de esta manera se garantizó tomar muestras representativas de los microorganismos presentes (12).

Selección e identificación de las cepas 

Se seleccionaron las cepas de lactobacilos por las características fenotípicas como la morfología de sus colonias y la observación microscópica después de realizada la coloración de Gram a las bacterias. Fueron realizadas pruebas bioquímicas como catalasa, indol y producción de ácido a partir de glucosa (13).

Capacidad fermentativa

Se realizó el crecimiento de un cultivo fresco de 18 horas de cada cepa en caldo MRS sin extracto de carne y sustituyendo la glucosa por los siguientes carbohidratos al 1%: D-glucosa, Galactosa, Asculin, Xilosa, Manosa, Sacarosa, Melibioza, Maltosa, Almidón, Ramnosa, Manitol, Salicina, Melizitosa, y se le adicionó el indicador bromocresol púrpura. Todos fueron incubados a 37oC durante 24 horas, posteriormente se efectuó la lectura de los resultados (13,14).

Caracterización y selección de cepas de Lactobacillus sp. con actividad de antagonismo microbiano

Crecimiento en condiciones hostiles

A diferentes pH: Se cultivaron las cepas aisladas en caldo MRS al cual se le ajustó el pH inicial a pH 2,5; 3, 4; 5,4; 6,4. Los cultivos fueron incubados a 37°C durante 24-48 horas.

A diferentes temperaturas: Se cultivaron las cepas en caldo MRS y se incubaron en 15; 30; 37 y 45oC durante 24-48 horas. El crecimiento se observó visualmente en cada una de las variantes evaluadas.

Determinación de hidrofobicidad:

Se determinó la hidrofobicidad superficial de las cepas aisladas de Lactobacillus ssp. mediante la medición de la afinidad por el disolvente orgánico de las células cultivadas en sistema de dos fases agua-disolvente orgánico, como medida predictiva de su capacidad de adhesión a epitelios.

Para evaluar la hidrofobicidad en la superficie bacteriana se realizó un ensayo con las indicaciones reportadas por Frizzo et al. (15). Cada una de estas cepas crecidas de cultivo fresco en caldo MRS a 37ºC se lavaron con PBS, se llevó a una densidad óptica (DO) de 0,6 a 560 de longitud de onda (ë)y se mezclaron con la misma cantidad de n-hexadecano, xileno y tolueno, a temperatura ambiente. Después de un tiempo de separación de 60 min., se midió la DO ë 560 de la fase acuosa. El porcentaje de hidrofobicidad se calculó utilizando la siguiente ecuación:

Prueba de agregación:

Las cepas de Lactobacillus ssp. con mejores resultados en el estudio de hidrofobicidad se les realizó el ensayo de agregación de acuerdo a la técnica utilizada por Reniero et al. (16). Los cultivos, incubados 18 h a 37°C en MRS, se centrifugaron y se lavaron tres veces con agua destilada y se resuspendieron en el volumen inicial con una solución de Ringer- lactato y se llevaron a una DO de 0,7. Los sobrenadantes de cada una de las cepas se filtraron y se agregaron a la suspensión a una concentración final del 10% (v/v), posteriormente, se incubaron a temperatura ambiente. La agregación se considera positiva cuando las partículas visibles, similares a la arena y formadas por las células agregadas, se depositarán en el fondo del tubo dejando el sobrenadante limpio en un período máximo de 2 h a temperatura ambiente.

Producción de peróxido de hidrógeno:

Se les determinó a las cepas seleccionadas y para ello se utilizó el protocolo descrito por Felten et al. (17). Las cepas de Lactobacillus sp. fueron sembradas sobre placas con 20 mL de agar MRS, suplementadas con 5mg de 3,3', 4,4'-tetrametilbenzidina (Sigma) y 0,2 mg de peroxidasa (horse radish, Sigma) incubadas en condiciones de anaerobiosis durante 48 horas. Posteriormente, las placas fueron expuestas al aire. La identificación de bacterias productoras de H2O2 se realizó después de la incubación y formación de pigmentos azules alrededor de las colonias, se consideró dos categorías: no productora y productora de H2O2.

Coagregación con patógenos: El ensayo de coagregación fue diseñado basado en métodos reportados por Reid et al. (9). Las suspensiones de microorganismos ajustaron a una D.O de 0,7 en PBS. Una alícuota de 500 µL de los cultivos de las cepas seleccionadas de Lactobacillus spp. fueron centrifugadas filtradas y mezcladas con la 500 µL de Escherichia coli ATTC 25922 y Candida albicans ATTCC 3153 incubadas en zaranda orbital a 100 rpm por 2 horas. Las suspensiones fueron observadas macroscópicamente y bajo microscopio óptico con un lente de 100 X. La prueba se consideró positiva cuando se hizo visible la sedimentación de las células sobre el fondo del tubo en un período máximo de 2 h a temperatura ambiente. Se desarrollaron controles con suspensiones en PBS de las BAL y los patógenos utilizados.

Prueba de Hemoaglutinación:

Se determina la capacidad de adhesión a células epiteliales según lo descrito por Reid et al. (9). Se toman 50µL de las cepas evaluadas con D.O de 0,7 correspondiendo a la escala Mac Farlam de 1x107 UFC/mL y se unen a 50µL eritrocitos humanos grupo A+ y O+; carnero y conejos previamente lavados al 0,5% y colocan en placas plásticas de hoyos redondos y se incubaron a temperatura ambiente y a 40C por 2 horas.


Inhibición del crecimiento

Una alícuota de 500 µL de los cultivos de las cepas seleccionadas Lactobacillus sp de 18 horas de crecimiento con D.O de 0,7 se centrifugó y se tomó el sobrenadante filtrado y fueron mezcladas con la 500 µL de cultivos frescos Escherichia coli ATTC 25922 y Candida albicans ATTCC 3153. Se incubaron en zaranda orbital termostatada a 100 rpm por 8-12 horas a 37oC. Posteriormente, fueron sembradas en medio Agar Nutriente y Agar Dextrosa Sabouraud para evaluar su crecimiento durante 24 horas a 370C. Se utilizó como control las suspensiones en PBS de los patógenos utilizados.

Susceptibilidad a agentes antimicrobianos

Se utilizó el método de difusión en disco modificado, substituyendo el agar Müeller Hinton por agar MRS. Los antimicrobianos probados fueron: Ampicilina (25 µg), Rocefin (25µg), Cefuroxima (30µg), Metronidazol (30 µg), Azitormicina (10 µg) Nistatina (100 unidades), Penicilina(10 µg), Triplesulfa (25µg), Kanamicina (30 µg), Vancomicina(30 µg), Cloranfenicol(30 µg), Gentamicina(30 µg), Amikacina (30 µg), Ciprofloxacina (25 µg), Amoxicillina (30 µg), Streptomicina (30 µg), Oxitetraciclina (30 µg), todos de la firma Oxoid. Se incubaron por 48 horas bajo condiciones de anaerobiosis y posteriormente se midieron los halos de inhibición.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se aislaron 24 cepas de Lactobacillus, las que presentaron los rasgos fenotípicos que distinguen las BAL de otros microorganismos: bacilos Gram-positivos, catalasa negativos y anaerobios facultativos. La identificación a nivel de grupo se realizó por medio de los patrones de fermentación de azúcares y producción de CO2 a partir de glucosa; en el grupo A clasificados como homofermentativos obligados se encuentran las cepas L- 87, 89, 60, 61, 128, 136, 148, 175, 179, 195, 197; y en el grupo B heterofermentativos facultativos se hallan las restantes L- 59, 84, 86, 135, 137, 138, 174, 178, 179/1, 181, 185, 196, 198.

Se considera que en el proceso de selección de cepas de interés probiótico, es fundamental comprobar la capacidad de tolerancia a las condiciones adversas a su paso por el tracto gastrointestinal, su comportamiento ante los agentes empleados en el tratamiento de infecciones, sus propiedades adherentes a células epiteliales e inhibitorias ante patógenos in vitro para demostrar el mecanismo de acción de exclusión y competencia por los sitios receptores.

En este trabajo se comprobó que cuando las cepas aisladas de Lactobacillus spp. fueron sometidas a diferentes condiciones de crecimiento, se pudo observar que todas crecieron a pH 5,4 - 6,6 a temperaturas de incubación 30-37o C a hasta las 48 horas. El crecimiento en medio líquido de las cepas evaluadas se presenta a través de este, aunque sus células precipitan rápidamente después que el crecimiento cesa; dando lugar a un sedimento suave y homogéneo, sin formación de películas.

En la Tabla 1, se observa el comportamiento en condiciones hostiles del crecimiento de las cepas aisladas; el 16,6% de las cepas evaluadas resultaron sensibles a pH bajos y solo a temperatura de 450C la cepa L-174 tuvo un crecimiento distintivo. Los resultados obtenidos reflejan las propiedades principales de las cepas probióticas por su resistencia a pH extremos y a diferentes temperaturas.

Las características físico-químicas de la pared celular bacteriana, tanto como la naturaleza de la superficie a la que se adhiere, influyen sobre los fenómenos de autoagregación y adhesión. En los ensayos de adhesión o hidrofobicidad frente a solventes polares se logró seleccionar 9 cepas con los mejores porcentajes, y posteriormente se les realizó el ensayo de hemaglutinación, ambos se muestran en la Tabla 2. Los mayores porcentajes fueron encontrados en las cepas L-136, L-179, L-87, coincidiendo con la hemaglutinación positiva. Los resultados obtenidos de estos ensayos mostraron que existe una correlación entre la hidrofobicidad-potencial y una hemaglutinación positiva con eritrocitos de los grupos O+ y A+. Las cepas menos hidrofóbicas fueron negativas para la hemaglutinación.

Hay evidencia que los ácidos lipoteicoicos proporcionan hidrofobicidad de la pared celular bacteriana, la cual está directamente relacionada con cepas adherentes (18). También se ha visto que componentes proteinaceos superficiales se encuentran involucrados en este fenómeno.

La capacidad de agregación es una característica que se puede utilizar para iniciar el estudio de las interacciones microbianas. Existe una asociación entre la habilidad de los lactobacilos para adherirse al epitelio intestinal o vaginal, la actividad de agregación y la hidrofobicidad de su superficie (1,8,12). Las 9 cepas seleccionadas fueron capaces de autoagregar y en la mayoría se observa una formación macroscópica granular que se forma rápidamente en un tiempo de 15-25 minutos coincidiendo con las propiedades de coagregaron frente a los patógenos utilizados como los revelados en la Tabla 3. La coagregación con patógenos puede impedir el acceso del mismo a los tejidos receptores, de hecho es una explicación alternativa por la pérdida de adherencia de E. coli y C. albicans a las células epiteliales intestinales y vaginal en presencia de lactobacilos, además su capacidad de agregar la distingue de otras ya que hace posible su acción ante microorganismos patógenos formadores de biopelículas (18).

El perfil de sensibilidad a antibiótico de cada una de las cepas estudiadas mostró variabilidad en su comportamiento. La mayoría de las cepas fueron resistentes hacia Azitormicina, Nistatina, Triplesulfa Gentamicina, Amikacina, Ciprofloxacina, Kanamicina. Estas resistencias se han atribuido como un aspecto intrínseco y no transmisibles (19). Sin embargo, no todas las resistencias a antibióticos en los lactobacilos son intrínsecas, algunos pueden ser codificada por plásmidos por lo tanto su resistencia a los antibióticos deben ser cuidadosamente evaluados antes de su uso como probiótico comercial.

Cuando se realizó la prueba de inhibición in vitro ante los patógenos evaluados quedó demostrada la acción antimicrobiana de las cepas seleccionada ante E. coli, ya que no se observó crecimiento de este microorganismo al parecer debido a la producción de ácidos orgánicos, como el ácido láctico o acético, bajando el pH a 3-4 en los cultivos de las cepas evaluadas limitando el desarrollo de E. coli. Los efectos perjudiciales de estas moléculas en los microorganismos sensibles se resumen en alteración de la permeabilidad celular, alteración del potencial de membrana y subsiguiente alteración de la Fuerza Protón Motriz, así como, descenso del pH intracelular que ocasiona la alteración de funciones celulares importantes (20).

En cuanto al debilitamiento del crecimiento de C. albicans al parecer está muy relacionado con la producción de H2O2 por las cepas L- 136, L- 1 75, L- 197, L- 198 de Lactobacillus spp. que al realizar la prueba de formación de peróxido mostraron positividad. En general se cree que las cepas de Lactobacillus controla la microflora vaginal, incluyendo C. albicans, por la colonización del epitelio vaginal y la inhibición del crecimiento de los otros microorganismos. Por lo tanto, las cepas de Lactobacillus, como candidatos a probióticos, suelen ser probado primeramente in vitro para demostrar su capacidad de adherirse al epitelio vaginal, su actividad antimicrobiana a Gardnerella vaginalis y C. albicans, además su producción de H2O2 que, según varios autores, son los responsables de la actividad inhibitoria (9,21).

Estos Lactobacillus spp. solos o combinados entre sí, pueden resultar importante en la regulación y equilibrio del ecosistema vaginal o intestinal. En conclusión, los resultados obtenidos en las pruebas in vitro realizadas demostraron que las cepas seleccionadas poseen características fisicoquímicas y biológicas compatibles con un potencial uso como probiótico: resistencia a pH ácido, buenas propiedades hidrofóbicas, hemaglutinantes, y autoagregantes, relacionadas con su capacidad de adhesión al epitelio intestinal y/o vaginal, actividad antimicrobiana como inhibición del crecimiento de E. coli y C. albicans; no obstante, no es necesario que los microorganismos cumplan con todos los criterios de selección ensayados, en consecuencia, las restantes cepas podrían ser sometidas a posteriores pruebas con el objeto de estudiar otras propiedades como tolerancia a las sales biliares, actividad hemolítica, producción de bacteoricinas y ácidos orgánicos con actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos además de la formación de biopelículas.



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