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El limón (Citrus aurantifolia L.) es uno de los principales cultivos perennes en la Provincia de Matanzas, la cosecha de limón alcanzó en el 2014 las 1 300 toneladas y llegó a promediar nueve toneladas por hectárea. La producción citrícola en nuestro país está limitada por problemas fitosanitarios, especialmente antracnosis (Colletotrichum gloeosporioide); la principal enfermedad fungosa a nivel mundial, causando pérdidas económicas en pre y poscosecha, principalmente en regiones con temperatura y humedad relativa elevada (Prusky et al. 2000; Rhaiem y Taylor, 2016).
El control biológico de enfermedades ha tomado interés desde hace algunas décadas por detectar microorganismos benéficos con potencial de ser usados como agentes de biocontrol para reducir las poblaciones de fitopatógenos y disminuir las aplicaciones de productos químicos (Ferreira et al., 2020). Los actinomicetos controlan diferentes agentes patógenos a través de la producción metabolitos secundarios y primarios como antibióticos y enzimas extracelulares (Ding et al., 2019); con capacidad de inhibir el crecimiento micelial, la germinación de esporas de hongos fitopatógenos y sobrevivir en la superficie de las frutas por largos períodos de tiempo (Qi et al., 2019).
Con base en lo anterior el objetivo del presente trabajo fue seleccionar cepas de actinomicetos como agentes de biocontrol de C. gloeosporioides. Para determinar la actividad antagonista in vitro se sembraron las 181 cepas de actinomicetos previamente identificadas en cajas Petri de 90 mm de diámetro con medio de cultivo Agar Caseína Almidón (ACA) a pH 7, para luego incubarse a 28 °C por siete días en una cámara de crecimiento (Memmert), hasta observar crecimiento del actinomiceto. El hongo fitopatógeno se seleccionó debido a su incidencia en la región productora de limón, se sembró en Agar Papa Dextrosa (PDA) e incubó a 25 °C, tres días en una cámara de crecimiento (Memmert) previo a la realización del ensayo.
Cada antagonista se sembró de acuerdo con Evangelista-Martínez et al. (2020), mediante fragmentos de la colonia de 6 mm de diámetro, los cuales se colocaron en los cuatro puntos cardinales de la caja de Petri con PDA, y se incubaron a 28 °C por 3 días. Posteriormente fue colocado un fragmento con micelio de la colonia del hongo fitopatógeno en el centro de cada placa y se incubó de nuevo bajo las mismas condiciones.
Como tratamiento control, se sembró el hongo fitopatógeno en el centro de la caja de Petri con PDA, el crecimiento radial de la colonia de Colletotrichum gloesporoides confrontado ante cada actinomiceto y del control se midió cada 24 h. El día en que el control lleno la caja de Petri, se registró la inhibición de los actinomicetos (Evangelista-Martínez et al., 2020). Para determinar la actividad antifúngica, la variable de respuesta que se evaluó fue el Porciento de Inhibición de Crecimiento Radial (PICR) por efecto de los distintos actinomicetos, de acuerdo con la escala ordinal propuesta por (Salazar et al., 2012). Posteriormente, se seleccionaron las cepas que presentaron mayor PICR para determinar cualitativamente la actividad enzimática extracelular quitinolítica y celulítica.
El procesamiento estadístico de los datos se realizó con el paquete estadístico IBM SPSS Statistics 22.0.0 para Windows. Se verificaron los supuestos de normalidad mediante la prueba de Shapiro Wilk. Se realizó una comparación de medias, mediante la prueba de HSD Tukey. En todos los casos las diferencias se consideraron significativas para un valor de p<0,05.
El ensayo de antagonismo in vitro mostró que, de las 181 cepas de actinomicetos evaluadas, 62 cepas mostraron actividad contra C. gloeosporioides en placas de ACA tras siete días de incubación. En la Tabla 1 se muestran las cepas de actinomicetos con los mejores resultados de la actividad antagónica frente a C. gloeosporioides.
Tabla 1 Actividad antagónica in vitro de cepas de actinomicetos frente a C. gloeosporioides aislado de limón
| No | Cepa | Media Real | Límite de confianza inferior -95,0% | Límite de confianza superior +95,0% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Plat-2 | 22,6 | 20,5 | 15,4 |
| 2 | ESFe-10 | 22,3 | 20,2 | 14,0 |
| 3 | ESFe-12 | 21,6 | 19,5 | 19,0 |
| 4 | EC-18 | 20,6 | 18,5 | 18,0 |
| 5 | ESFe-3 | 20,0 | 17,9 | 12,7 |
Similares resultados obtuvieron Soares et al. (2016) cuando informaron que el aislado de actinomiceto AC 26, por su actividad antagónica en el medio de crecimiento y la producción de metabolitos secundarios, fue el aislado más eficiente para controlar el crecimiento del micelio de los hongos fitopatógenos Curvularia eragrostides y C. gloeosporioides.
Igualmente, Gu et al. (2020) reportaron que la cepa Streptomyces deccanensis QY-3 mostró una buena actividad antagónica contra C. gloeosporioides con una tasa de inhibición del 86,6 %.
De las 62 cepas que mostraron actividad contra C. gloeosporioides, 31 de ellas fueron seleccionadas según el PICR para determinar la actividad enzimática extracelular quitinolitica y celulolitica; y de ellas, 25 fueron capaces de utilizar la quitina coloidal como única fuente de carbono, las que mostraron crecimiento y presentaron una zona de hidrólisis alrededor de la colonia, indicativa de actividad quitinolítica. De estas 25 cepas seleccionamos, las 6 cepas con mayor actividad se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 Actividad Quitinolítica de 6 cepas de actinomicetos en medio agar quitina coloidal
| No | Cepa | Media Real | Límite de confianza inferior -95,0% | Límite de confianza superior +95,0% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Plat-2 | 14,0b | 12,4 | 15,5 |
| 2 | OSS-3 | 12,0b | 10,4 | 13,5 |
| 3 | CY-5 | 11,5ab | 9,9 | 13,0 |
| 4 | Efe-5 | 11,0a | 9,4 | 12,5 |
| 5 | Plat-1 | 10,0a | 8,4 | 11,5 |
| 6 | ESFe-7 | 10,5a | 8,9 | 12,0 |
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren según prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con el test de Mann Whitney para p< 0,05
Similares resultados obtuvieron Das et al. (2017) quienes evaluaron, aproximadamente 260 cepas de actinomicetos aislados de diversos hábitats ecológicos y los examinaron para la producción de quitinas por el método de ensayo en placa. El diámetro de las zonas de hidrólisis osciló entre 8 y 16 mm.
La actividad celulolítica se evidenció con las zonas de aclaramiento alrededor de las colonias cuando se utilizó como revelador el rojo Congo al 1 % (p/v). Las cepas EsFe-12, ESFe-5, Plat-2, ESFe-13, Plat-3 y Plat-1 (Tabla 3) fueron las cepas que presentaron halos de hidrólisis significativamente más grandes que el resto de las cepas evaluadas; siendo la cepa ESFe-12 la que presentó los valores significativos más altos.
Tabla 3 Actividad celulolítica de 6 cepas de actinomicetos en medio conteniendo celulosa
| No | Cepa | Media Real | Límite de confianza inferior -95,0 % | Límite de confianza superior +95,0 % |
|---|---|---|---|---|
| 1 | ESFe-12 | 74,5c | 72,2 | 76,7 |
| 2 | ESFe-5 | 73,5c | 71,2 | 75,7 |
| 3 | Plat-2 | 70,0bc | 67,7 | 72,2 |
| 4 | ESFe-13 | 68,5abc | 66,2 | 70,7 |
| 5 | Plat-3 | 68,5abc | 66,2 | 70,7 |
| 6 | Plat-1 | 54,5a | 52,2 | 56,7 |
Medias con letras desiguales en una misma columna difieren según prueba no paramétrica de Kruskal Wallis complementada con el test de Mann Whitney para p< 0,05
Similares resultados mostraron los estudios realizado por Nauanova et al. (2018), donde el 41,7 % de los actinomicetos aislados poseían una alta capacidad celulítica y el 30,6 % de las cepas descomponen débilmente la celulosa nativa.
Del total de cepas evaluadas, Plat-2 y ESFe-12 mostraron resultados más promisorios en cuanto a la actividad antagónica in vitro frente a C. gloeosporioides y enzimática extracelular quitinolítica y celulolítica. Similares resultados obtuvieron Song et al. (2020) cuando determinaron que la cepa JT-2F fue capaz de producir proteasas y celulasas para degradar los componentes proteicos y celulósicos de las paredes celulares de C. dematium, respectivamente. Por otra parte, Yang et al. (2019) aislaron e identificaron y demostraron que S. corchorusii, tenía una actividad antagónica de amplio espectro contra varios patógenos vegetales fúngicos, como Fusarium oxysporum f. sp. niveum, Phytophthora parasitica var. nicotianae, Rhizoctonia solani, P. capsica, Botryosphaeria dothidea
