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El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una de las hortalizas más cultivadas y difundidas en el mundo, debido a sus cualidades gustativas y su aporte nutricional basado en un alto contenido de minerales y vitaminas (Chohan et al., 2019). Por su lado, el frijol común (Phaseolus vulgaris L.) se considera un componente indispensable de la dieta en Centroamérica y Suramérica (Ulloa et al., 2011). Además, aporta gran cantidad de minerales como hierro, proteínas, almidón y vitaminas (Vaca-Rivera, 2019).
Sin embargo, los hongos Passalora fulva (Cooke) U. Braun y Crous, Stemphyllium solani Weber, Alternaria solani Sor., Rhizoctonia solani Kühny y Sclerotium rolfsii Sacc., son agentes causales de enfermedades de importancia económica para estos cultivos. El principal método de control de estos es el empleo de fungicidas (Kristl et al., 2019). El incremento de la resistencia a estos fungicidas, la contaminación ambiental y la toxicidad provocada por el abuso de los mismos ha aumentado la demanda de antifúngicos de origen natural (El-Nagar et al., 2020).
Los extractos de plantas constituyen una fuente de productos naturales con actividad antifúngica demostrada. Los géneros Citrus L. y Zanthoxylum L., pertenecientes a la familia Rutaceae, son una fuente importante de compuestos bioactivos con actividad antifúngica (Ramírez-Pelayo et al., 2019). De igual forma, en el principal exponente de la familia Phytolacaceae, el anamú (Petiveria alliacea L.), se han identificado numerosos compuestos sulfurados (Sariego et al., 2015) con actividad fungicida. El objetivo de este trabajo fue determinar la actividad antifúngica in vitro de extractos de especies de las familias Rutacea y Phytolacaceae frente a hongos fitopatógenos de tomate y frijol común.
Las hojas de Citrus aurantiifolia (Christm.) Swingle, Citrus reticulata Blanco, Citrus latifolia (Tanaka ex Yu. Tanaka) Tanaka, Citrus aurantium L. y Citrus aurantium var. sinensis L. se recolectaron en el área de colecciones vivas de plantas del Jardín Botánico de Villa Clara, perteneciente a la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara, Cuba. Las hojas de Zanthoxylum pseudodumosum Beurton y P. alliacea se recolectaron en su hábitat natural. La primera de estas en el poblado “El Hormiguero”, carretera a Camajuaní, Santa Clara, Cuba y la segunda en el propio municipio de Santa Clara. La obtención de los extractos se realizó mediante extracción asistida por ultrasonido y maceración. El aceite esencial se extrajo de las hojas mediante el método de hidrodestilación empleando una trampa tipo Clevenger. La identificación de metabolitos en los extractos se realizó por el método de tamizaje fitoquímico (Schabra et al., 1984) y los fenoles totales se cuantificaron según Elkhatim et al. (2018).
Los aislados de los hongos utilizados en el trabajo fueron suministrados por el Laboratorio de Microbiología Aplicada del Instituto de Biotecnología de las Plantas, Santa Clara, Cuba. Para la determinación de la actividad antifúngica in vitro de los extractos y aceite esencial discos de 0,6 cm de diámetro de micelio de cada uno de los hongos crecido en medio de cultivo Agar Papa Detroxa (PDA; Difco, Alemania) durante siete días se trasfirieron, de forma individual, a medio de cultivo Caldo Papa Dextrosa (PDB; Difco, Alemania) y se dejaron crecer en constante movimiento en una zaranda (Gerhardt, Alemania) durante 72 h, a 120 rpm y 27 ± 1 °C. Posteriormente, 1 g de micelio de cada hongo se trituró en un homogenizador Ultra-Turrax T25 (Rose Scientific Ltd., Canadá) y se ajustó la concentración a 5 x 105 fragmentos de micelios mL-1 en una cámara de Neubauer (Brand, Alemania).
La concentración inhibitoria mínima (CIM) se determinó en función de la concentración de fenoles totales del extracto por el método de microdilución (Eloff, 1998). El crecimiento micelial se observó en un estereoscopio (Novel, China) a partir de 72 h de incubación, cada 24 h por siete días. La CIM se definió como la menor concentración del extracto a la cual no se observó crecimiento micelial. El efecto de los extractos en el crecimiento radial de P. fulva, S. solani, A. solani, R. solani y S. rolfsii se determinó por el método de dilución en agar (Yanar et al., 2011). Se evaluaron los extractos que se consideraron promisorios según la CIM. El diámetro de cada una de las colonias se midió, a partir de 72 h de incubación, cada 24 h por siete días. El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se calculó mediante la fórmula (C-T)/C *100, donde C corresponde al diámetro de la colonia (cm) de P. fulva, S. solani, A. solani, R. solani y S. rolfsii crecido en medio de cultivo PDA con el disolvente diluido a la misma proporción en que se preparó el extracto y T corresponde al diámetro de la colonia (cm) crecido en medio de cultivo PDA con los extractos o el fungicida. El efecto de los extractos en la germinación de los conidios se realizó, solamente, sobre las estructuras reproductivas de P. fulva, S. solani y A. solani y se determinó por el método de gota colgante (Kavitha et al., 2005). Se evaluaron los extractos que se consideraron promisorios según el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial. El número de conidios germinados (cuando el tubo germinativo fue igual o superior en longitud al conidio) se determinó, después de las 24 h, mediante la evaluación al microscopio óptico (Leitz Wetzlar, Alemania). El porcentaje de inhibición de la germinación de conidios se calculó mediante la fórmula (C-T)/C *100, donde C corresponde al número de conidios de P. fulva, S. solani y A. solani germinados en agua destilada estéril con el disolvente diluido a la misma proporción en que se preparó el extracto y T corresponde al número de conidios de P. fulva, S. solani y A. solani germinados en los extractos o el fungicida. Se consideraron promisorios los extractos que mostraron inhibición de la germinación de los conidios superior al 50 % (Mishra et al., 2009; Pupo, 2010).
En todos los extractos se identificaron aminas, aminoácidos, fenoles y taninos, flavonoides y alcaloides. En el aceite esencial los sesquiterpenos, fueron los compuestos mayoritarios. Todos los extractos de hojas de cítricos evaluados mostraron CIM inferiores a los 40 mg EAG mL-1 de fenoles totales frente al menos uno de los hongos empleados. El extracto de C. aurantiifolia -met mostró menor CIM frente a P. fulva (5 mg EAG mL-1), los extractos de C. aurantiifolia -et y C. reticulata -et mostraron menor CIM frente A. solani (5 mg EAG mL-1) y el extracto de C. aurantium var. sinensis -met frente a S. solani (0,04 mg EAG mL-1). De los extractos evaluados de hojas de Z. pseudodumosum el extracto hexánico fue el que presentó mayor actividad antifúngica ya que inhibió el crecimiento de A. solani a una concentración de 1000 μg mL-1. Del mismo modo, todos los extractos y el aceite esencial evaluados mostraron porcentajes de inhibición del crecimiento micelial superiores al 50 % frente a alguno de los hongos empleados. Los extractos más efectivos fueron: los extractos de C. aurantiifolia -et frente a P. fulva (70 %), C. ×latifolia -et frente a A. solani (100 %) (Figura), C. aurantium var. Sinensis -et, C. reticulata -et, C. aurantiifolia -met, C. reticulata -met frente a S. solani (100 %), siendo este último el hongo más sensible a la actividad antifúngica de estos extractos. Todos los extractos de P. alliaceae (acuoso, hidroalcohólico y N-hexánico) evidenciaron CIM por debajo de 50 mg EAG mL-1 de fenoles totales. Se destaca el extracto hidroalcohólico con 20 mg EAG mL-1 de fenoles totales como el mínimo valor de la CIM para R. solani y S. rolfsii.
Figura Inhibición del crecimiento micelial de Alternaria solani por extractos de hojas de Citrus latifolia en etanol 70 % (-et) y el solvente como control negativo
Todos los extractos de hojas de cítricos evaluados mostraron porcentajes de inhibición de la germinación de conidios de al menos uno de los hongos empleados superiores al 50 %. En este sentido, los extractos más efectivos fueron: C. aurantiifolia -et, C. aurantium var. Sinensis -met y C. latifolia -met frente a P. fulva (mayor 80 %), C. aurantiifolia -et, C. aurantium -et, C. latifolia -et, C. aurantiifolia -met, C. reticulata -met, C. ×latifolia -met frente a A. solani (mayores del 70 %) C. reticulata -met y C. ×aurantium -met frente a S. solani (100 %).
Estos resultados demuestran el potencial de los extractos de hojas de la familia Rutacea y Phytolacaceae para su empleo como antifúngicos en el manejo agroecológico de patógenos de tomate. No obstante, sería necesario realizar otros estudios de estabilidad y formulación química
